Здесь представлены подробные протоколы для культивирования 32D/G-CSF-R клеточная линия murine миелоидного прекурсоров, вирусных инфекций и проведение анализов пролиферации и дифференцировки. Эта линия клетки подходит для изучения развития миелоидных клеток и роль генов интерес к росту миелоидных клеток и нейтрофильных дифференциации.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Пролиферации и дифференцировки Murine миелоидного прекурсоров 32D/G-CSF-r клетки
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Понимание гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток биологии имеет важные последствия для регенеративной медицины и лечения гематологических патологий. Несмотря на наиболее актуальные данные, которые могут быть приобретены с использованием модели в естественных условиях или первичных культур низкая обилие гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток значительно ограничивает круг подходящих методов для их расследования. Таким образом использование клеточных линий позволяет достаточно производства биологического материала для выполнения показы или анализов, которые требуют числа крупных клеток. Здесь мы представляем, подробное описание, индикация и интерпретации пролиферации и дифференцировки анализов, которые используются для исследования процессов в myelopoiesis и нейтрофильных дифференциации. Эти эксперименты используют 32D G-CSF-реляционный cytokine зависимых murine миелоидного клеток линии, которая обладает способностью размножаться в присутствии Ил-3 и дифференцировать в G-CSF. Мы предлагаем оптимизированный протоколы для обработки клеток 32D/G-CSF-R и обсудить основные недостатки и недостатки, которые могли бы скомпрометировать описанных анализов и ожидаемые результаты. Кроме того эта статья содержит протоколы для производства лентивирусные и антиретровирусного лечения, титрование и трансдукция 32D/G-CSF-R клеток. Мы демонстрируем, что генетические манипуляции этих клеток могут быть использованы для успешного выполнения функциональных и молекулярные исследования, которые могут дополнять результаты, полученные с основной гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток или модели в естественных условиях .
Введение
Гемопоэтических стволовых и прогениторных населения поставляет в организм с большим диапазоном зрелых клеток, включая клетки миелоидного lineage (нейтрофилов, эозинофилов, базофилов и моноцитов). Процесс, который управляет производства миелоидных клеток от гемопоэтических стволовых клеток известен как myelopoiesis, и надлежащего производства зрелой миелоидных клеток в ответ на меняющиеся требования является необходимым условием для надлежащего решения проблем организма с стресса условия, такие как инфекции и потери крови. Недостаточное производство зрелых миелоидных клеток может привести к неспособности устранить патогенов, свертываемость крови, снижение и других угро....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Примечание: Шаги, описывающих расширения, дифференциации и трансдукция 32D/G-CSF-R клеток представлены ниже.
1. Подготовка
- Подготовка средств массовой информации
- Подготовка 250 мл питательной среды: среднего 1640 RPMI (Розвелл парк Мемориальный институт), дополнены 10% тепла инактивированная FBS (плода бычьим сывороточным) и мышиных Ил-3 (10 нг/мл).
- Кроме того используйте самодельные Ил-3. Для производства самодельных Ил-3, передают HEK293 клетки с Ил-3 выражая вектора и собирать Ил-3, содержащий супернатанта22.
Примечание: Антибиотиков, как пенициллин G (100 МЕ/мл), ст....
- Кроме того используйте самодельные Ил-3. Для производства самодельных Ил-3, передают HEK293 клетки с Ил-3 выражая вектора и собирать Ил-3, содержащий супернатанта22.
- Подготовка 250 мл питательной среды: среднего 1640 RPMI (Розвелл парк Мемориальный институт), дополнены 10% тепла инактивированная FBS (плода бычьим сывороточным) и мышиных Ил-3 (10 нг/мл).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Пролиферации и дифференцировки клеток 32D/G-CSF-R
Чтобы оценить пролиферацию клеток 32D/G-CSF-R условиях pro пролиферативных и про дифференциации, 32D/G-CSF-R клетки были культивировали в средствах массовой информации, содержащие Ил-3 и G-CSF, соответственно. Было отмечено, что клетки культивировали в ил-3 содержащие среднего (10 нг/мл) делятся примерно каждые 24 ч (рисунок 2A). После замены Ил-3 G-CSF.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Выбор экспериментальной модели является одним из основных вопросов в области научных исследований. Хотя считается, что основной клетки животных и человека производят наиболее биологически соответствующих данных, эти модели может включать этические проблемы и часто связаны с дорогим и/или сложные изоляции/выращивание процедур. Первичные элементы ограничены в количестве и трудно генетически манипулировать ими. Кроме того Главные ячейки представляют гетерогенных население состоит из различных типов клеток, которые могут осл.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Авторы благодарят профессор Рууд Delwel и профессор Иво Touw за предоставленную нам с линией клеток 32D/G-CSF-R и профессор Даниэль G. Tenen за предоставление нам с линией клеток Bosc23. Эта работа была поддержана грантов грант агентства Чешской Республики (GACR 15-03796S и GACR 17-02177S) для ма-J, поддержки от Института молекулярной генетики Чешской академии наук (РВО 68378050) ма-j, Стипендия Великобритании GA (проект № 341015) от Карлова университета в Праге МК, и Стипендия Великобритании GA (проект № 1278217) от Карлова университета в Праге, PD.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 порошковая среда | Merck, Кенилворт, Нью-Джерси, США | T 121-10 | без NaHCO3, с L-глутамином |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, США | 15028 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, США | 31985-047 | L-глютамин, фенол Сыворотка |
| крупного рогатого скота красного плода (FBS) | PAA Laboratories (GE Healthcare, Чикаго, Иллинойс, США) | MT35011CV | Для дифференцировки клеток 32D/G-CSF-R Фетальная |
| бычья сыворотка (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, США | 10270 | Используется для культивирования клеток HEK293T, NIH3T3, BOSC23 |
| Пенициллин | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, США) | P3032 | |
| Стрептомицин | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, США) | S9137 | Порошок соли сульфата стрептомицина |
| Гентамицин | Сигма-Олдрич (Merck, Кенилворт, Нью-Джерси, США) | G1914 | |
| мышиный IL-3 | PeproTech, Роки Хилл, Нью-Джерси, США | 213-13 | |
| человек G-CSF | PeproTech, Роки Хилл, Нью-Джерси, США | 300-23 | |
| Полиэтиленимин | Polyscience, Уоррингтон, Пенсильвания, США | 23966 | Линейный, МВт 25,000 (PEI 25000) |
| Полибрен | сигма-Олдрич (Merck, Kenilworth, Нью-Джерси, США) | H9268 | |
| Трипсин | VWR Chemicals, Раднор, Пенсильвания, США | 0458 | |
| ЭДТА | Сигма-Олдрич (Мерк, Кенилворт, Нью-Джерси, США) | E5134 | |
| Кристаллический фиолетовый | Сигма-Олдрич (Мерк, Кенилворт, Нью-Джерси, США) | C0775 | |
| Трипановый синий | Сигма-Олдрич (Мерк, Кенилворт, Нью-Джерси, США) | T6146 | |
| Диметилсульфоксид (ДМСО) | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, США) | D2650 | |
| May-Grü nwald Giemsa | DiaPath, Martinengo, BG, Италия | 10802 |
Ссылки
- Bonilla, M. A., et al. Effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on neutropenia in patients with congenital agranulocytosis. N Engl J Med. 320 (24), 1574-1580 (1989).
- Bennett, C. L., Djulbegovic, B., Norris, L. B., Armitage, J. O.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
