Методическая статья

Промежуток времени, метки бесплатно, количественные фаза изображений исследования активных и неактивных человеческих раковых клеток

DOI:

10.3791/57035

⸱

16 февраля 2018 г.

 ,  , 
1Vascular Biology Program, Boston Children's Hospital, 2Department of Surgery, Harvard Medical School and Boston Children's Hospital

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Спящие и активный рак клеток фенотипов характеризовались с использованием количественных этапа визуализации. Клетки распространения, миграции и морфология анализы были интегрированы и проанализированы в один простой способ.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Приобретение ангиогенных фенотипа является важным компонентом побег из опухоли покоя. Хотя несколько классических в vitro анализов (например, распространение, миграция и другие) и в естественных условиях модели были разработаны для расследования и характеризуют ангиогенных и не ангиогенных клеток фенотипов, эти методы являются время и трудоемким и часто требуют дорогостоящих реагентов и инструментов, а также значительный опыт. В недавнем исследовании мы использовали Роман количественных этап визуализации (QPI) техника для проведения промежуток времени и без маркировки характеристики ангиогенных и не ангиогенных человека остеосаркома KHOS клеток. Группа клеточных параметров, включая морфологии клеток, распространение и моторики, измерялись количественно и анализируются с помощью QPI. Этот роман и количественный подход обеспечивает возможность непрерывно и неинвазивным изучить соответствующие клеточных процессов, поведения и характеристик раковых клеток и другие типы клеток в простой и комплексным образом. В настоящем докладе описываются наши экспериментальный протокол, включая подготовка клетки, QPI сбора и анализа данных.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Один из первых контрольно-пропускных пунктов в развитии и прогрессировании твердых опухолей является приобретение ангиогенных фенотип, признаком рака. Этот прогресс включает в себя целый ряд биохимических и молекулярных процессов в1,2,3. Техническая проблема в изучении этой ключевой шаг в опухолевой прогрессии является отсутствие инструментов непрерывно и количественно охарактеризовать и дифференцировать между ангиогенных и не ангиогенных фенотипов живой раковых клеток в непредвзято. Традиционные анализы, используется для изучения клеточного поведения ангиогенных и не ангиогенных клеток обычно требуют дорогостоящих реагентов и инструментов, например, клеток распространения/миграции assays4,5, 6,,78,9,10,11,12,,1314 или Дополнительные в естественных условиях оценки4,5,6,8,15,16, а также требует значительного опыта и интенсивной расход времени и труда.

Недавно количественные этап визуализации (QPI) стала Роман технику, которая позволяет промежуток времени и маркировки свободной оценки различных клеток морфологии и поведении параметров17,18,19, 20 , 21 , 22. в отличие от обычных оптической микроскопии, QPI количественно вариации сдвиг фазы попиксельно после того, как свет проходит через оптический объект и реконструирует собственноручно с преобразованной оптической толщины и объем, таким образом позволяя прямой анализ живых клеток и следующие возможности: (1) количественные изображений, изображений (2)-неинвазивные и промежуток времени, (3) лейбл свободных изображений и (4) одновременно нескольких параметров визуализации. Эти особенности делают QPI мощный инструмент для оценки и понимания патологических процессов на клеточном уровне.

В недавнем исследовании, мы использовали QPI количественно охарактеризовать и дифференцировать между ангиогенных KHOS-A и не ангиогенных KHOS-N фенотипов клеток человека остеосаркома на основе систематического и количественных, объединяя анализ морфологии клеток, распространение и моторики23. С помощью программного обеспечения для анализа изображений, группа клеток морфологических и поведения параметров были количественно сравнить между ангиогенных и не ангиогенных клеток человека остеосаркома и были определены пять характерных отличий между этими двумя фенотипов. Этот новаторский подход обеспечивает комплексное и количественные платформу для оценки различных биологически соответствующих характеристик сотовой.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все описанные здесь методы были одобрены Бостон Детская больница институциональных биобезопасности Комитета.

1. Подготовка клетки

  1. Размораживание KHOS-A и -N клетки
    1. Разминка питательной среды, т.е., Дульбекко изменение среднего орла с 10% (vol/vol) плода телячьей сыворотки (ФБС) и 1% (vol/vol) пенициллина/стрептомицина.
    2. Возьмите криогенных флаконы клеток из бака жидким азотом, погрузиться в нижней части флаконов в теплую воду в водяной бане 37 ° C и осторожно встряхните криогенных флаконы для ускорения процесса размораживания. Держите крышку криогенных флаконов от контактов с воды во избежание загрязнения. Как только разморозить клетки, стерилизуйте криогенных флакона путем распыления 70% этанола раствор и вытирая флакона.
    3. Ламинарный шкаф немедленно аспирационная суспензию клеток от криогенных флакон и осторожно приостановить в 10 мл утепленные питательной среды (указанные в подпунктах 1.1.1). Центрифуга клеточных суспензий на примерно 200 g x 5-7 мин.
    4. Ресуспензируйте клетки лепешка с 10 мл утепленные питательной среды и передачи в T75 колбу. Аккуратно Пипетка несколько раз приостановить клетки, равномерно с помощью пипетки 10-мл.
    5. Поместите колбу в 37 ° C инкубатор с 5% (vol/vol) CO2 и увлажненные атмосферой. Позволяют клеткам вложить по крайней мере 12 часов.
    6. Инкубации клеток для примерно 3-7 дней до 80-100% притока. Изменение культуры среднего каждые 2-3 дня.
  2. Разделение KHOS-A и -N клетки
    1. Удалите медиа культуры из колбы.
    2. Вымыть клетки с 5 мл стерильной PBS (1 x) без кальция и магния, чтобы удалить не адэрентных клеток или дроби.
    3. Добавить 1 мл 0,05% раствора трипсина-ЭДТА в колбу, и кратко вихрем Фляга для обеспечения что трипсин ЭДТА рассеивается равномерно.
    4. Инкубируйте Фляга для 2-3 мин в инкубаторе 37 ° C или 3-5 мин при комнатной температуре. Проверьте клетки под микроскопом при примерно 400-кратном чтобы убедиться, что клетки окружили и отсоединена.
    5. После того, как отдельные клетки, добавить 10 мл питательной среды и аккуратно Пипетка средних вверх и вниз несколько раз, чтобы разрушить агрегатов ячеек в одну ячейку подвеска с помощью пипетки 10 мл.
    6. Подсчитать ячейки, используя счетчик соматических клеток. Семя суспензию клеток в новой T75 колбы на плотность 2 × 106 клеток или в соотношении 1:4.
    7. Позволяют клеткам расти до 80-100% слияния перед посевом для эксперимента QPI.
  3. Заполнение KHOS-A и -N клетки для QPI
    1. Семя KHOS-A и -N клетки в 6-ну пластины при плотности 50 000-300 000 клеток/колодец с 5 мл питательной среды после подсчета с счетчик соматических клеток.
      Примечание: Плотность посева зависит скорость распространения клеток и периода времени изображений для того чтобы иметь < 100% слияния во время обработки изображений приобретения.
    2. Инкубируйте клетки для по крайней мере 12 h Разрешить вложение.
    3. Изменения в среду с свежими СМИ перед проведением QPI.

2. QPI приобретение

  1. Крышка выскальзования, Настройка
    1. Очистите крышку выскальзования путем полоскания несколько раз с дейонизированной водой и стерилизуют с 75% этанола раствор путем погружения в воду на 15 мин, положите крышку выскальзования в стерильных Ламинарный шкаф для сушки.
    2. Осторожно поместите крышку выскальзования на пластину 6-Ну чтобы избежать очевидных пузыри. Убедитесь, что в нижней части крышки выскальзования погружается в культуру СМИ (минимум 5 мл/хорошо).
    3. Место пластину в инкубатор (37 ° C, 5% CO2и увлажненные атмосферу) сбалансировать по крайней мере 15 минут. Если туман образуется на крышку выскальзования, используйте стерильным ватным тампоном протирать чистой.
  2. Визуализации ячейки с помощью микроскопа
    1. Открытое программное обеспечение для инициализации системы, в том числе самостоятельной калибровки времени экспозиции, контраста шаблон и голограммы шума. Убедитесь, что значения являются приемлемыми (показан в диапазоне зеленый или желтый).
    2. Место пластину 6-Ну на этап микроскопа QPI.
    3. Нажмите кнопку «Динамический захват» и выберите «Руководство» в «Программное обеспечение внимание.» Крупно фокусировать изображения этап клеток, регулируя расстояние работы в «Микроскоп установка» для получения контуров для ячеек в фазе изображений. «Автоматический» в «Программное обеспечение внимание.»
    4. Нажмите кнопку «Новый эксперимент» создать новый эксперимент. Начните с выбора позиций приобретения изображений с помощью мыши или клавиш со стрелками на цифровой клавиатуре. После каждого выбора, нажмите «Запомнить». Обычно выбираются 3-5 места для каждого образца.
    5. Настройка визуализации интервалы и период времени в разделе «Timelapse».
      Примечание: Чтобы четко отслеживать раковые клетки, интервалы должны быть короче, чем 5 минут 48 часов как период времени для комбинации QPI анализ.
    6. Запустите эксперимент, нажав «Захвата», который будет автоматически сосредоточиться и получить изображения в точках времени настройки.

3. анализ данных

  1. Анализ морфологии клеток
    1. Нажмите кнопку «Определить клетки.» Настройка числового параметра для «Фон порог» так, что клетки районы отделены от фонового шума. Задайте значение параметра параметр «Размер объекта» чтобы убедиться, что каждая клетка имеет одно ядро. Поддерживать последовательную параметры для образцов, которые нужно сравнить, как они могут повлиять на окончательный измерения площади и объема. Вручную измените клетки сегменты с помощью «Изменения вручную», если необходимо.
    2. Используйте функцию «Анализ данных» программного обеспечения для анализа клеток. Начать новый анализ данных, нажав кнопку «Новый анализ.» Перетащите выбранные изображения в «Источник кадров» вкладку ячейка морфология параметры и включая область ячейки (2мкм), оптической толщины (мкм) и объем (3мкм) для каждой отдельной ячейки. Выберите Точечная график или Гистограмма режим и экспорта данных как таблицы или рисунки.
  2. Анализ распространения клеток
    1. Выберите по крайней мере 5 изображений для различных временных точек интереса (например, первоначальный, 12 h, 24 h, 36 h и 48 ч). Номера записи ячейки, предоставляемые программного обеспечения.
    2. Чтобы оценить время удвоения, участок числа клеток после нормализации с первоначальной цифры и подходят с кривых экспоненциального роста.
  3. Анализ движения клеток
    1. Используйте функцию «Трек клетки» в программном обеспечении. Нажмите кнопку «Новый анализ» чтобы начать новый анализ данных. Перетащите серии изображений для выбранного периода времени (например, 4 h после 24 ч инкубации) в закладке «Источник кадров» случайным образом выбирать ячейки 10-30, нажав клетки под режим выделения «Добавить клетки». Исключите ячейки по краям и тех, кто перемещается из поля зрения.
    2. Тщательно проверьте отслеживания в серии изображений. В том случае, если система теряет ячейки или отслеживает неправильные ячейки, вручную настройте Отслеживание Сотовые, нажав «Определение» для выявления клеток или нажав кнопку «Изменить место» в режиме «Выбрать» Изменить место расположения ячейки.
    3. Выберите розы участок клеток траекторий в «Участок движения» или участок для движения связанных параметров в «Участок функции, «подвижности скорость (микрон/ч), подвижность (мкм), миграция (мкм) и миграции прямого. Экспорт данных в таблицы или рисунки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рисунок 1 изображает морфология характеристика типичной клетки. Изображения представлены как голографии (рис. 1A-B) и 2D изображения (Рисунок 1 c-D). Оптическая ячейка толщины (рассчитывается от преломления и длиной оптического пути) количественно через линии профиля или клеточных измерения. Точечные и толщина KHOS-a и KHOS-N клеток измеряется для всей ячейки были по...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мы описываем в пробирке, неинвазивная и этикетка бесплатно использование метода QPI количественно характеризовать ангиогенных и не ангиогенных фенотипов клеток человека остеосаркома. Одновременно были проанализированы несколько клеточных параметров этим методом комплексной, высокой пропускной способности, включая область ячейки, ячейки толщина, объем ячейки, скорость распространения, удвоение время, миграции непосредственность, подвижности скорость, миграции и подвижности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Отсутствие конфликта интересов объявил.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы с благодарностью признаем поддержку Фонд исследований рака молочной железы и расширенный медицинский исследовательский фонд.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Колба T75Corning, Нью-Йорк, США 353136
6-луночных планшетов Корнинг, штат Нью-Йорк, США3506
Dulbecco' s модифицированная среда Eagle (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA, США 11965092
Фетальная бычья сыворотка (FBS) Atlanta Biologicals, GA, СШАS11550
Пенициллин стрептомицинThermo Fisher Scientific, MA, США15140122
Фосфатный буферный раствор (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, США 10010023
Beckman Z1 Coulter counterBeckman Coulter, IN, СШАZ1 
HoloMonitor M4Phase Holographic Imaging Phi AB, Лунд, ШвецияM4Микроскоп
HololidPhase Holographic Imaging Phi AB, Лунд, ШвецияPHI 8020
HStudioM4Фазовая голографическая визуализация Phi AB, Лунд, ШвецияПрограммное обеспечениеHStudioM4

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
  2. Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
  3. Harper, J., Moses, M. A. Molecular regulation of tumor angiogenesis: mechanisms and therapeutic implications. EXS. (96), 223-268 (2006).
  4. Naumov, G. N., et al. A model of human tumor dormancy: an angiogenic switch from the nonangiogenic phenotype. Journal of the National Cancer Institute. 98 (5), 316-325 (2006).
  5. Fang, J., et al. Matrix metalloproteinase-2 is required for the switch to the angiogenic phenotype in a tumor model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (8), 3884-3889 (2000).
  6. Almog, N., et al. Transcriptional switch of dormant tumors to fast-growing angiogenic phenotype. Cancer Research. 69 (3), 836-844 (2009).
  7. Hu, J., et al. Gene expression signature for angiogenic and nonangiogenic non-small-cell lung cancer. Oncogene. 24 (7), 1212-1219 (2005).
  8. Harper, J., et al. Repression of vascular endothelial growth factor expression by the zinc finger transcription factor ZNF24. Cancer Research. 67 (18), 8736-8741 (2007).
  9. Jia, D., et al. Transcriptional repression of VEGF by ZNF24: mechanistic studies and vascular consequences in vivo. Blood. 121 (4), 707-715 (2013).
  10. Jia, D., Huang, L., Bischoff, J., Moses, M. A. The endogenous zinc finger transcription factor, ZNF24, modulates the angiogenic potential of human microvascular endothelial cells. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (4), 1371-1382 (2015).
  11. Almog, N., et al. Prolonged dormancy of human liposarcoma is associated with impaired tumor angiogenesis. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (7), 947-949 (2006).
  12. Almog, N., et al. Consensus micro RNAs governing the switch of dormant tumors to the fast-growing angiogenic phenotype. PloS One. 7 (8), e44001(2012).
  13. Satchi-Fainaro, R., et al. Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors. PloS One. 7 (9), e44395(2012).
  14. Almog, N., et al. Transcriptional changes induced by the tumor dormancy-associated microRNA-190. Transcription. 4 (4), 177-191 (2013).
  15. Gao, D., Nolan, D. J., Mellick, A. S., Bambino, K., McDonnell, K., Mittal, V. Endothelial progenitor cells control the angiogenic switch in mouse lung metastasis. Science. 319 (5860), New York, N.Y. 195-198 (2008).
  16. Folkman, J., Watson, K., Ingber, D., Hanahan, D. Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia. Nature. 339 (6219), 58-61 (1989).
  17. Popescu, G. Quantitative phase imaging of cells and tissues. , McGraw-Hill: New York. (2011).
  18. Lee, K., et al. Quantitative Phase Imaging Techniques for the Study of Cell Pathophysiology: From Principles to Applications. Sensors. 13 (4), 4170-4191 (2013).
  19. Mir, M., Bhaduri, B., Wang, R., Zhu, R., Popescu, G. Quantitative Phase Imaging. Progress in Optics. 57, 133-217 (2012).
  20. Marrison, J., Räty, L., Marriott, P., O'Toole, P. Ptychography--a label free, high-contrast imaging technique for live cells using quantitative phase information. Scientific Reports. 3, 2369(2013).
  21. Falck Miniotis, M., Mukwaya, A., Gjörloff Wingren, A. Digital holographic microscopy for non-invasive monitoring of cell cycle arrest in L929 cells. PloS One. 9 (9), e106546(2014).
  22. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. AJP: Cell Physiology. 295 (2), C538-C544 (2008).
  23. Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. Characterization of dormant and active human cancer cells by quantitative phase imaging. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Advancement of Cytometry. 91 (5), 424-432 (2017).
  24. Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response. PloS One. 9 (2), e89000(2014).
  25. Mir, M., Tangella, K., Popescu, G. Blood testing at the single cell level using quantitative phase and amplitude microscopy. Biomedical Optics Express. 2 (12), 3259-3266 (2011).
  26. Park, Y., et al. Measurement of red blood cell mechanics during morphological changes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6731-6736 (2010).
  27. Pham, H. V., Bhaduri, B., Tangella, K., Best-Popescu, C., Popescu, G. Real time blood testing using quantitative phase imaging. PloS One. 8 (2), e55676(2013).
  28. Sridharan, S., Macias, V., Tangella, K., Kajdacsy-Balla, A., Popescu, G. Prediction of prostate cancer recurrence using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 5, 9976(2015).
  29. Park, H., et al. Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 6, 34257(2016).
  30. Bishitz, Y., Gabai, H., Girshovitz, P., Shaked, N. T. Optical-mechanical signatures of cancer cells based on fluctuation profiles measured by interferometry. Journal of Biophotonics. 7 (8), 624-630 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Time lapse ImagingCell Morphology AnalysisProliferation Rate MeasurementMotility Speed TrackingAngiogenic Phenotype CharacterizationNon angiogenic Phenotype CharacterizationHuman Osteosarcoma CellsLabel free ImagingCancer Cell Dormancy

Похожие статьи