Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В естественных условиях Blood - brain барьер проницаемость Assay мышей с использованием дневно помечены Трейсеры

26K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57038

⸱

26 февраля 2018 г.

 ,  ,  , 
1Institute of Neurology (Edinger Institute), Goethe University Hospital, 2Pharmazentrum Frankfurt, Institute for General Pharmacology and Toxicology, Goethe University Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем пробирного сосудистой проницаемости мозга мыши, используя внутрибрюшинного введения флуоресцентных Трейсеры следуют перфузии, которая применима к Животные модели blood - brain барьер дисфункции. Один hemi мозг используется для количественной оценки проницаемость и другой для трассировочного визуализации/иммуноокрашивания. Процедура занимает 5-6 ч для 10 мышей.

Аннотация

Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) является специализированным барьер, который защищает мозг микроокружения от токсинов и патогенных организмов в циркуляции и поддерживает гомеостаза головного мозга. Основные сайты барьера являются эндотелиальных клеток капилляров мозга, функции которого барьер результаты от плотные межклеточные соединения и измеряем транспортеров, выраженные на плазматической мембраны. Эта функция регулируется pericytes и астроциты, которые вместе образуют блок нервно-сосудистых (NVU). Несколько неврологических заболеваний, таких как инсульт, болезнь Альцгеймера (AD), опухоли мозга, связанные с нарушениями функции BBB. Поэтому оценка проницаемости BBB решающую роль в оценке тяжести неврологических заболеваний и успех стратегий лечения.

Мы представляем здесь простой, но надежные проницаемость assay, который успешно применялся для нескольких мыши модели оба, генетические и экспериментальных. Метод является высоко количественных и объективной по сравнению с трассирующими флуоресцентный анализ по микроскопии, который часто применяется. В этом методе мышей внутрибрюшинно вводили с сочетанием водный инертных флуоресцентные Трейсеры следуют обезболивающим мышей. Сердца перфузии животных производится до сбора урожая, мозга, почек и других органов. Органы гомогенизации и центрифугируют следуют измерения флуоресценции от супернатант. Кровь из сердца пункция перед перфузии служит для цели нормализации сосудистой отсек. Ткани флуоресценции нормируется для мокрой веса и сыворотки флуоресценции для получения количественных трассирующими индекса проницаемости. Для дополнительного подтверждения контралатеральной hemi мозга сохраняется для иммуногистохимии могут быть использованы для трассировочного флуоресценции визуализация целей.

Введение

Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) состоит из микрососудистой эндотелиальных клеток (ECs), поддерживаемых тесно связаны pericytes (шт.), которые являются муфтами в базальной пластинки, и астроциты (АКГ), которые окутывают базальной мембраны с их конец ноги1 ,2. ECs взаимодействовать с несколькими типами клеток, которые поддерживают и регулируют функцию барьера, главным образом ACs и ПК, а также нейронов и микроглии, которые вместе формируют нервно-сосудистого блок (NVU). NVU имеет решающее значение для функции BBB, который ограничивает транспорта кровь токсинов и патогенных въезд в мозг. Эта функция является результатом жесткие соединения молекул, таких как Клаудин-5, occludin, zonula occludens-1, которые присутствуют, между ECs, а также из-за действий перевозчиков например р гликопротеина (P-gp), измеряем молекулы, которые вводят эндотелия обратно в судно просвета1,2,3. BBB однако позволяет для перевозки необходимых молекул, таких как питательные вещества (глюкозу, железа, аминокислоты) конкретных перевозчиками, выразили ЕС мембраны плазмы1,2,3. EC слой сильно поляризованных распространение различных перевозчиков между Люминал (кровь облицовки) и abluminal (оболочек мозга облицовки) для конкретных и векторных транспорта функция4,5 . В то время как BBB защитные отношении плотно регулирующих окружение ЦНС, это серьезной проблемой для доставки лекарств ЦНС при заболеваниях, таких как болезнь Паркинсона с функциональной BBB. Даже в неврологических заболеваний с BBB дисфункции нельзя предположить, что мозг доставки лекарств увеличивается особенно дисфункции барьер может включать урон целям конкретных транспортер, например, как болезнь Альцгеймера (AD). В AD несколько бета амилоида перевозчиков, таких как LRP1, ярость, P-gp известны как dysregulated и следовательно ориентация этих перевозчиков может быть бесполезным6,,78. BBB нарушениями в нескольких неврологических заболеваний, таких как инсульт, AD, менингит, склероза и в мозгу опухоли9,10,11. Таким образом важно его оценки и восстановление барьерной функции является важной частью терапевтические стратегии.

В этой работе мы описали объективную и количественный протокол для assay проницаемость грызунов, что мы успешно применяется несколько линий мыши оба заболевания трансгенных и экспериментальной модели10,12,13 ,14. Метод основан на простой внутрибрюшинного введения флуоресцентных Трейсеры следуют перфузии мышей для удаления Трейсеры из сосудистого отсека. Мозга и других органов являются собранные пост перфузии и проницаемость, оценивать объективную и абсолютной проницаемости индекс, основанный на измерениях флуоресценции гомогенатах ткани на тарелку читателя. Все сырье флуоресценции значения корректируются для фона с помощью ткани гомогенатах или сыворотки от Шам животных, которые не получают любой трассировщик. Достаточно нормировок включены в объем сыворотки, сыворотка флуоресценции и вес ткани, таким образом давая индекса проницаемости, которая является абсолютным и сопоставимых между экспериментов и типы тканей. Для облегчения сравнения между группами абсолютной проницаемости значения индекса могут быть легко преобразованы соотношений как мы выполняли ранее12. Одновременно хранимые hemi мозги и почек могут быть использованы для визуализации трассирующими микроскопии флуоресцирования10. Классический флуоресцентной микроскопии может быть ценным в получении региональные различия в проницаемости, хотя и громоздким из-за субъективный выбор разделов ткани и изображений для полуколичественного анализа. Подробные шаги представлены в протоколе и примечания добавлены при необходимости. Это обеспечивает необходимую информацию для успешного выполнения пробирного проницаемости в естественных условиях в мышей, которые можно масштабировать до других мелких животных. Assay может применяться для многих видов трассировщиков заряд и размер на основе оценки проницаемость сочетанием Трейсеры с спектры флуоресценции отдельных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все животные были обработаны с особой тщательностью, свести к минимуму боль или дискомфорт во время процедуры. Эта процедура руководящими животных ухода нашего института и был одобрен местным комитетом (Regierungspraesidium Дармштадт, номер официального утверждения FK/1044).

Схема работы шаги в vivo пробирного проницаемости в мышах показано на рисунке 1. Сведения о каждом шаге описаны ниже.

1. Транспортировка животных

  1. Подготовка и администрирование Трейсеры и анестетики
    1. Подготовьте помечены трубы и формы для встраивания по крайней мере за день до assay проницаемость тканей. Поддерживать стерильные условия во всем протокол, работая под чистой зонта и с помощью инструментов, очищены с 80% этанола. Использование мужского или женского пола одичал тип (WT) или Ангиопоэтин-2 (анг-2) получить из функция CD1 (Гоф) мышах в зрелых взрослых возрастной группе 3-6 месяцев для текущего протокола. Выполняют генотипирования мышей, как описано выше 10.
      Примечание: 80% алкоголя не приведет к стерильные инструменты, но позволит свести к минимуму загрязнение образцов подготовленных.
    2. Разбавить всех трассировщиков в стерильных PBS в акции 2 мм и хранить аликвоты, защищенном от света при-20 ° C.
    3. Выберите Трейсеры как (тетраметилсвинца родамин) ПМР и (флуоресцеин Изотиоцианаты) FITC с спектров различных возбуждения/выбросов и что являются лизин поправимо, что приводит к минимальным помех между красители по микроскопии флуоресцирования (с использованием ПМР или FITC фильтра соответственно) и флюометрия на тарелку читателя для assay проницаемости.
      Примечание: ПМР декстрана 3 kD и FITC декстрана 3 КД, используемые в исследовании как лизин поправимо и следовательно могут также использоваться для Иммуногистохимический анализ после фиксации с альдегиды с целью изучения региональных различий.
    4. Обрабатывать все животные с особой тщательностью инструкций институционального ухода. Придать внутрибрюшинно каждая мышь с 100 мкл трассирующими решение, которое может быть увеличено до 200 мкл, когда дополнительные трассирующими сочетается с помощью 100 мкл каждого трассировочного в смесь 1:110,13. Придать по крайней мере одно животное с PBS, только вместо Трейсеры служить Шам управления для аутофлюоресценция вычитание фона.
    5. 5 мин после инъекции трассирующими, анестезировать животное с i.p инъекции кетамина и ксилазина (5-10 мг и 100 мг в 0,9% физиологического раствора за кг тела соответственно, вес 150 мкл коктейль за 25 g мышь).
      Примечание: Vet мазь не применялась на глазах во время процедуры как краткий период между животных анестезии и перфузии/жертву (10 минут) где любой сушки глаз не наблюдалось.
  2. Коллекции и сердечная перфузии крови
    1. Готовить животных для сердца перфузии 10 мин после анестезии администрации. Проверьте отсутствие ответа дергаться лапы с тем чтобы обеспечить, что животное достиг хирургические плоскости анестезии.
    2. Положите животных на их обратно и применять 80% этанола на коже живота. С помощью маленькие ножницы, откройте брюшной стенки с небольшой разрез (2 см) чуть ниже грудной клетки. Отдельные функции печени от диафрагмы и затем медленно прорваться через диафрагму, подвергая плевральной полости 15.
    3. Разрезать грудную клетку на двусторонней основе и исправить отрезока грудины, чтобы разоблачить левого желудочка. Вставьте 21-калибруйте Бабочка иглы, подключенных к системе перистальтические перфузии в заднего левого желудочка.
    4. Прокол правого предсердия и быстро (в течение 10 s) собирать 200-300 мкл крови в грудной полости, используя советы Пипетка 1 мл (с конца отсечения) в сыворотке крови коллекции трубок и хранить его на льду.
      Примечание: Эта процедура перфузии является не выживание.
    5. Как только кровь собирается, переключитесь на системе перфузии (10-12 об/мин, 5 мл/мин) и perfuse животное на 3 мин с теплой (RT) 1 x PBS (бесплатно Ca2 +/мг2 + ионов).
      Примечание: PBS содержащие Ca2 +/Mg2 + ионы могут быть использованы для улучшения сердечной деятельности во время перфузии. Общее количество PBS для перфузии находится в диапазоне 15-20 мл.
    6. Оценить качество перфузии, отметив цвета печени, почек, которые появляются белые/Пале после перфузии.
      Примечание: Функции почек или печени перфузии не обязательно указывает перфузии мозга как артерии (сонной артерии/позвонков) достижение что мозг от аорты может получить разрыв во время подготовки в шаге 3 особенно во предсердий прокол.

2. ткань обработка

  1. Орган сбор и хранение
    1. В конце перфузии подтвердите смерть животного шейки матки вывихов и урожай мозга и почек. Проверка перфузии мозга по цвету мозги (не видимой крови в сосудах мозговых оболочек), с тем чтобы исключить животных от проницаемости анализа, когда качество перфузии не является хорошим. Разделите мозга на 2 hemibrains, с помощью скальпеля (рис. 1).
    2. Препарировать скальпелем один hemibrain бесплатно обонятельные лопастями и мозжечке и передачи hemicerebrum 2-мл пробирку. Хранить hemi мозжечка в дополнительной трубки, если необходимые для оценки мозжечковой проницаемости.
    3. Перевести одну почку в другой 2-мл пробирку. Храните образцы сразу на сухой лед.
    4. Внедряйте изначально оставшиеся почек и геми мозга (включая мозжечка и обонятельные доли) в ткани tek оптимального раскроя температуры (O.C.T) соединение на сухой лед.
    5. В конце концов Центрифугуйте образцы крови, хранящиеся на льду в сыворотке крови коллекции трубок на 10, 000 g, 10 мин при 4 ° C. Передача supernatants сыворотки для 1.5 мл пробирок и поместите их в контейнер сухого льда.
    6. Передача всех образцов, собранных на сухого льда в морозильной камере-80 ° C до дальнейшей обработки.
      Примечание: Важно, заморозить образцов, прежде чем приступать к гомогенизации шаги как повышение эффективности гомогенизации после, как замораживание оттаивания.
  2. Гомогенизация и центрифугирования
    1. Оттепель на льду образцы hemi головного мозга и почек, замороженные вниз на-80 ° C и весят пробирки, содержащие органов. От этих весов вычтите среднее значение нескольких пустых труб (около 20) чтобы получить вес ткани. Добавить 300 мкл и 200 мкл холодной 1 X PBS в пробирки, содержащие почек и геми-головного мозга, соответственно.
      Примечание: для более низких объемов ткани (как hemi мозжечка, ниже 100 мг) весом отдельные трубы рекомендуется.
    2. Однородный каждый образец в оригинальной eppendorf трубки с пестиком из политетрафторэтилена (ПТФЭ) придает электрические накладных мешалкой (1, 000 об/мин), выполняя около 15 ударов (1 ход = 1 вверх и вниз 1). Прополощите толкателем с PBS между образцы и протрите сухой перед переходом к следующему образцу.
      Примечание: Из-за возможных помех с флюометрия было избегать использования моющих средств во время гомогенизации. Однако внутриклеточный трассирующими также обнаружен в этот протокол, как ткань тщательно гомогенизированные, который является более эффективным, после того, как один раунд заморозить оттаивания.
    3. Храните гомогенизированных образцов на льду, защищенном от света и все вместе в конце на 15000 g, 20 мин, 4 ° C в центрифугу настольная центрифуга. Передавать supernatants новой 1.5 мл пробирок на льду для немедленного флюометрия или на-80 ° C до быть проанализированы позднее.
  3. Флуоресценции измерение и количественное определение
    1. Если заморожен в конце предыдущего шага, оттепели на льду супернатант и сыворотки образцов ткани, хранящиеся в-80 градусов, защищая их от света с фольгой.
    2. Пипетка 50 мкл разбавленного сыворотки (30 мкл ПБС + 20 мкл сыворотки) или supernatants ткани (как) 384-ну черный знаке. Включать по крайней мере один образец из Шам животного для сыворотки крови и тканей supernatants для обеспечения надлежащего фон вычитание, как этот фон огневки ткани обычно выше, чем у PBS, используется как растворитель.
      Примечание: В среднем 3 Шам животных может использоваться для аутофлюоресценция, хотя было отмечено очень немного изменчивости в Шам аутофлюоресценция значения (данные не показаны). Количество сыворотки используется может быть уменьшена разбавления с PBS, который также может увеличить соотношение сигнал-шум для образцов с низкой флуоресценции таких образцов мозга. До 10 мкл сыворотки был испытан, разбавляя его с 40 мкл PBS. Убедитесь, что нет пузырьков присутствуют в скважинах.
    3. Вставьте пластину 384-ну черный в пластине читатель и открыть новый сценарий выбора измерений флуоресценции.
    4. Установить коэффициент усиления для оптимального и использовать значения возбуждения/выбросов (Нм) 550/580 или 490/520 для ПМР или FITC dyee соответственно и начать измерения для получения сырья флуоресценции единиц (RFUs).
    5. Используйте сырой флуоресценции единиц (RFUs) от читателя пластины для вычисления индекса проницаемости (PI) после вычитания значения соответствующих Шам.
      1. * Индекса проницаемости (мл/г) = (Вес ткани ткани RFUs/г) / (сыворотка RFUs/мл сыворотки)
    6. Пример расчета индекса проницаемости мозга (PI) животного GOF1 (Таблица 1):
      1. GOF1 мозг RFUs - Шам мозга RFUs = 154-22,5 = 131,5
      2. GOF1 сыворотка RFUs - Шам сыворотки RFUs = 38305-27 = 38278
      3. Мозг вес (г) = 0.195
      4. Объем (мл) сыворотки = 0.02
      5. Мозг индекса проницаемости (10-3 мл/г) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = 0.352
        Примечание: Расчеты индекса проницаемости выход значений, которые являются абсолютными и сопоставимых между экспериментов и типы тканей. Однако они могут быть представлены как коэффициенты для облегчения сравнения между 2 группы 12. Это может быть достигнуто путем деления PI каждого животного в обеих группах с средняя PI контрольной группы, вождение средней группы управления через 1 еще сохраняя Интер животных вариации в контрольной группе. Это преобразование содержит значения для экспериментальной группы (или групп) по отношению к группе управления, равным 1.
  4. Визуализация иммунофлюоресценции трассировщика
    1. Вырежьте блоков почки/hemi мозг, изначально встроен в ткани tek соединения (O.C.T) (шаг 2.1) в 10 мкм разделы на криостата набор до-20 ° C и передать разделы слайды размещены при комнатной температуре. Как только разделы сушатся (около 30 мин), передача слайды морозильник-80 ° C до использования.
    2. В день окрашивания оттепель слайды при 37 ° C 10 мин и затем исправить разделы с 4% paraformaladehyde (PFA) для 10 мин при комнатной температуре, после быстрой стирки в PBS.
    3. Инкубируйте в подразделах permeabilization/блокирование буфера из стерильных PBS, содержащие BSA 1% и 0,5% Тритон X-100 pH 7.5 за 1 ч при комнатной температуре.
    4. Инкубируйте слайды для 1,5 ч при комнатной температуре с CD31 основное антитело (0.5 мг/мл, клонировать MEC 13.3), разводят в 1: 100 в буфер, содержащий стерильные PBS, BSA 0,5%, 0,25% Тритон X-100 (рН 7,2) следуют три автомойки 5 мин в PBS.
    5. Выполните вторичное антитело инкубации в буфере выше на 1 ч при комнатной температуре с вегетационных дневно помечены антитела разбавленных 1: 500 (2 мг/мл). Для CD31 коза анти крыса Alexa 568 или Alexa 488 может использоваться в разведении 1: 500. Включать DAPI (300 мкм) в вторичное антитело смесь (1:1, 000 разрежения из запаса) пятно для ядер.
    6. Маунт окрашенных участков с Аква polymount и оставить его на ночь для полимеризации при комнатной температуре в темноте.
    7. Получение изображений с помощью спектральных тепловизионных Конфокальная лазерная сканирующая система микроскопа. Анализ изображений с NIS элементы программного обеспечения (версия 4.3). Программное обеспечение как Photoshop может использоваться для генерации монтаж фигур.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Недавно мы показали, что Ангиопоэтин-2 (анг-2) получить из функции (Гоф) мышах имеют выше проницаемости сосудов мозга чем управления мышей в здоровых условий10. В ход наведенные мышей он был также показывает, что GOF мышей больше инфаркте размеры и большей проницаемостью чем однопометники управления. Эти результаты показывают важную роль анг-2 проницаемости на BBB. Протокол поэтому использовали мышей GOF и сравнили их контролировать однопометники описать пробирного...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Дисфункции Blood - brain барьер связан с рядом неврологических расстройств, в том числе начального и среднего мозга опухоли или инсульта. BBB разбивка часто ассоциируется с угрожающей жизни ЦНС отек. Выяснение молекулярных механизмов, которые вызывают открытие или закрытие BBB поэтому терапевтическое значение в неврологических расстройств и обычно исследуется исследователями. Однако методы расследования в литературе, о BBB проницаемости в естественных условиях часто связаны с техническими трудностями, которые за...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы признать Sphingonet консорциум, финансируемой Фондом Leduq для поддержки этой работы. Эта работа была также поддержана сотрудничество исследовательский центр «сосудистые дифференциации и реконструкции» (CRC / Transregio23, проект C1) и 7. FP, COFUND, Гете международного постдока программы GO-IN, № 291776 финансирования. Мы также признаете Кэтлин Sommer ее технической помощи с мышами, обработки и генотипирования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Тетраметилромамин (TMR) декстран 3kDThermosfisherD3308
Флуоресцеин изотиоцианат (FITC) декстран 3kDThermosfisherD3306
Кетамин (Ketavet)Zoetis
Xylazine (Rompun)Bayer
0,9% физиологический растворFresenius Kabi Deutschland GmbH
1X PBSGibco10010-015
Ткань-тек O.C.T соединениеСакура Finetek4583
37% Раствор формгегидаSigma252549-1Lприготовить 4% раствор
бычьей сыворотки Альбумин, фракция VRoth8076.3
Triton X-100SigmaT8787
крыса анти CD31 антитело, клон MEC 13.3BD Pharmingen553370
козы против крыс alexa 568Молекулярные зондыA-11077
козы против крыс alexa 488Молекулярные зондыA-11006
DAPIМолекулярные зондыD1306
Aqua polymountPolyscience Inc18606
21-го калибра игла-бабочкаBD387455
сыворотка пробирка для сбораSarstedt41.1500.005
2 мл пробирки eppendorf ПробиркиSarstedt72.695.500
Прецизионные салфетки Kimtech салфетки для салфетокKimberley-Clark Professional05511
384-луночная черная пластинаGreiner781086
горки superfrost plusТермонаучныйJ1800AMNZ
пестик из ПТФЭWheaton358029
электрическая верхнеприводная мешалкаVWRVWR VOS 14
планшетный ридерTecanInfinite M200
CryostatMicrom GmbHHM 550
Nikon C1 Спектральная визуализация конфокальная лазерная сканирующая микроскопическая системаNikon
Ismatec
микроцентрифугаeppendorf5415R
перистальтическая перфузионная система BVK

Ссылки

  1. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  2. Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
  3. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
  4. Devraj, K., Klinger, M. E., Myers, R. L., Mokashi, A., Hawkins, R. A., Simpson, I. A. GLUT-1 glucose transporters in the blood-brain barrier: differential phosphorylation. Journal of neuroscience research. 89 (12), 1913-1925 (2011).
  5. Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature reviews. Drug discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
  6. Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders. Nature reviews. Neuroscience. 12 (12), 723-738 (2011).
  7. Paganetti, P., Antoniello, K., et al. Increased efflux of amyloid-β peptides through the blood-brain barrier by muscarinic acetylcholine receptor inhibition reduces pathological phenotypes in mouse models of brain amyloidosis. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 38 (4), 767-786 (2014).
  8. Devraj, K., Poznanovic, S., et al. BACE-1 is expressed in the blood-brain barrier endothelium and is upregulated in a murine model of Alzheimer's disease. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (7), 1281-1294 (2016).
  9. Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
  10. Gurnik, S., Devraj, K., et al. Angiopoietin-2-induced blood-brain barrier compromise and increased stroke size are rescued by VE-PTP-dependent restoration of Tie2 signaling. Acta neuropathologica. 131 (5), 753-773 (2016).
  11. Scholz, A., Harter, P. N., et al. Endothelial cell-derived angiopoietin-2 is a therapeutic target in treatment-naive and bevacizumab-resistant glioblastoma. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 39-57 (2016).
  12. Gross, S., Devraj, K., Feng, Y., Macas, J., Liebner, S., Wieland, T. Nucleoside diphosphate kinase B regulates angiogenic responses in the endothelium via caveolae formation and c-Src-mediated caveolin-1 phosphorylation. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (7), 2471-2484 (2017).
  13. Ziegler, N., Awwad, K., et al. β-Catenin Is Required for Endothelial Cyp1b1 Regulation Influencing Metabolic Barrier Function. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 36 (34), 8921-8935 (2016).
  14. Vutukuri, R., Brunkhorst, R., et al. Alteration of sphingolipid metabolism as a putative mechanism underlying LPS-induced BBB disruption. Journal of Neurochemistry. , (2017).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J Vis Exp. (65), e3564(2012).
  16. Hoffmann, A., Bredno, J., Wendland, M., Derugin, N., Ohara, P., Wintermark, M. High and Low Molecular Weight Fluorescein Isothiocyanate (FITC)-Dextrans to Assess Blood-Brain Barrier Disruption: Technical Considerations. Translational stroke research. 2 (1), 106-111 (2011).
  17. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  18. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  19. Bell, R. D., Winkler, E. A., et al. Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging. Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).
  20. Banks, W. A., Gray, A. M., et al. Lipopolysaccharide-induced blood-brain barrier disruption: roles of cyclooxygenase, oxidative stress, neuroinflammation, and elements of the neurovascular unit. Journal of Neuroinflammation. 12, 223(2015).
  21. Krause, G., Winkler, L., Mueller, S. L., Haseloff, R. F., Piontek, J., Blasig, I. E. Structure and function of claudins. Biochimica et biophysica acta. 1778 (3), 631-645 (2008).
  22. Johansson, B. B. Blood-Brain Barrier: Role of Brain Endothelial Surface Charge and Glycocalyx. Ischemic Blood Flow in the Brain. , 33-38 (2001).
  23. Fu, B. M., Li, G., Yuan, W. Charge effects of the blood-brain barrier on the transport of charged molecules. The FASEB Journal. 22 (1 Supplement), (2008).
  24. Goebl, N. A., Babbey, C. M., Datta-Mannan, A., Witcher, D. R., Wroblewski, V. J., Dunn, K. W. Neonatal Fc receptor mediates internalization of Fc in transfected human endothelial cells. Molecular biology of the cell. 19 (12), 5490-5505 (2008).
  25. Lopez-Quintero, S. V., Ji, X. -Y., Antonetti, D. A., Tarbell, J. M. A three-pore model describes transport properties of bovine retinal endothelial cells in normal and elevated glucose. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (2), 1171-1180 (2011).
  26. Hallmann, R., Mayer, D. N., Berg, E. L., Broermann, R., Butcher, E. C. Novel mouse endothelial cell surface marker is suppressed during differentiation of the blood brain barrier. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 202 (4), 325-332 (1995).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

CD31
В естественных условиях Blood - brain барьер проницаемость Assay мышей с использованием дневно помечены Трейсеры
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.