Методическая статья

Исследования синтеза РНК с помощью 5-Bromouridine маркировки и иммунопреципитации

8.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57056

⸱

3 мая 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1DANDRITE - Danish Research Institute of Translational Neuroscience, Dept. of Biomedicine, Aarhus University, 2Dept. of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University

В этой статье

Краткое содержание

Этот метод может использоваться для измерения синтез РНК. 5-Bromouridine добавляется к клеткам и включены в синтезированных РНК. Синтез РНК измеряется РНК добыча сразу после маркировки, следуют 5-Bromouridine ориентированные иммунопреципитации помечены РНК и анализ обратной транскрипции и количественных полимеразной цепной реакции.

Аннотация

При установившемся РНК уровни сравнении между двумя условиями, невозможно отличить ли изменений вызванных изменений в производство или деградации РНК. Этот протокол описывает метод для измерения производства РНК, используя 5-Bromouridine маркировки РНК, следуют иммунопреципитация, который позволяет расследования РНК синтезируется в течение короткого периода времени (например, ч. 1). 5-Bromouridine маркировка и иммунопреципитации преимущество использования токсичных transcriptional ингибиторы, такие как α-аманитин и дактиномицин D, что есть нет или очень низкое воздействие на жизнеспособность клеток во время кратковременного использования. Однако потому что только 5-Bromouridine иммунопреципитация захватывает РНК в течение короткого времени маркировки, медленно производства, а также быстро деградируют РНК может быть трудно измерить этим методом. 5-Bromouridine помечены РНК, захвачен 5-Bromouridine иммунопреципитация могут быть проанализированы по обратной транскрипции, количественные полимеразной цепной реакции и следующего поколения последовательности. Все типы РНК могут быть исследованы, и этот метод не ограничивается измерения mRNA, как представлено в этом примере.

Введение

5-Bromouridine (BrU) иммунопреципитации (IP) позволяет исследование производства РНК в клетках с нет или очень ограниченное воздействие на клетки физиологии во время краткого маркировки периода1,2. Метод основан на включения синтетических уридина производной Бру в недавно синтезированных РНК после IP помечены РНК, с использованием антител анти Бру (рис. 1).

Он был известен за десятилетия этот синтез белка может регулироваться транскрипционно, и существование транскрипционных факторов было предположить более чем 50 лет назад3. Сегодня, как известно, что некоторые заболевания вызваны регуляции транскрипции и стабильности РНК (дополнительная цифра S1 в ссылка4), и способность измерять изменения в производстве РНК имеет большое значение в понимании болезни развития.

С другой стороны инструменты для регулирования производства РНК обеспечивают новые возможности для лечения заболеваний, вызванных слишком мало или слишком много белков, или накопление белка как при болезни Паркинсона (PD). Преобладающим белок, накапливается в нерастворимые агрегатов в PD-α-synuclein, и уровень α-synuclein непосредственно связан с этой болезни, как ген умножение гена α-synuclein вызывает семейная PD5. Кроме того α-synuclein агрегатов в концентрации зависимым образом. Даунрегуляция уровни mRNA α-synuclein поэтому является интересным терапевтические стратегии, которая успешно достигнут с помощью РНК-интерференции для уменьшения потери нейрональных клеток в PD грызунов модели6,7.

Важно иметь возможность измерить изменения в производстве РНК, вызванной болезнью или терапевтических вмешательств. Современные методы для измерения уровней устойчивого состояния РНК, например обратной транскрипции, следуют количественных полимеразной цепной реакции (RT-ПЦР), не способны различать между изменений, вызванных регуляцию или изменены РНК стабильности. Широко используемый метод для исследования РНК распада ставок блокируется транскрипционный анализ механизма, с помощью соединений, таких как α-аманитин или актиномицин Д следуют измерений распадаясь РНК. Однако существуют некоторые проблемы, связанные с общей блокировки транскрипции в клетках, таких как индукции апоптоза8,9. Рядом с цитотоксическими эффектами транскрипционный анализ ингибиторы также присутствует ряд технических вопросов, таких как медленно клеточного поглощения α-аманитин и неконкретный характер актиномицин Д (обзор в ссылка10).

Чтобы избежать общей блокировки транскрипции, были использованы нуклеотида аналогов, например уридина 5-ethynyl (5-ЕС), 4-thiouridine (4-ту) и Брю. Эти легко принятые mammalian клеток и включены в недавно синтезированных РНК, позволяя пульс маркировки РНК в конкретные сроки. Брю менее токсичен, чем 5-ЕС и 4-ту, что делает его предпочтительным аналог выбор11,12.

Бру-IP может использоваться для расследования скорость синтеза РНК и стабильности и таким образом отличать причины изменения в целом РНК. Эта статья будет сосредоточена на измерении синтез РНК и относится к ссылки2 подробную информацию о расследовании РНК стабильности. Расследовать синтез РНК, клетки обозначены кратко с BrU например за 1 ч, следуют IP Бру-1 (рис. 1 c). Это позволяет измерения РНК синтезируется в течение короткого времени маркировки и наблюдаемые изменения даст более точную оценку положения в синтез РНК, чем путем измерения изменений в целом РНК по RT-ПЦР. Следует отметить, однако, что хотя время маркировки, например, только 1 h, деградация все еще может иметь влияние на РНК уровней, наблюдаемых.

RNA от BrU-IP экспериментов подходят для вниз по течению анализа RT-ПЦР1 или2,последовательность следующего поколения13. Другие стандартные методы обнаружения РНК, например Северный blotting или анализа защиты рибонуклеаза, могут также применяться для некоторых РНК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Выполнить все шаги при комнатной температуре, если не указано иное и Храните буферы на льду или в холодильник (за исключением от Элюирующий буфер, содержащий SDS). Протокол состоит из 5 разделов: подготовка РНК образцов; подготовка бусы для IP; Связывание BrU помечены РНК бисером; Элюирующий и очистки связанных BrU помечены РНК экстракцией 3 шага фенол фенол/хлороформ хлороформе; анализ РНК (в этом примере с помощью RT-ПЦР)

1. Подготовка образцов РНК

  1. Фото HEK293T клетки, с помощью автоматизированных клеток противостоять и семян 3,500,000 клетки в чашке Петри 10 см в 10 мл средства роста (среднего изменения орла Дульбекко дополнена 10% плода телячьей сыворотки и 50 мкг/мл пенициллина/стрептомицина) получить в общей сложности > 40 мкг РНК После извлечения 48 ч позже. Сохранить клетки при 37 ° C и 5% CO2.
  2. 48 ч после посева, аспирационная 8 мл питательной среды и оставить 2 мл, чтобы избежать высыхания клетки. Добавить 2 мм Бру и любого обращения к 8 мл придыханием роста средств массовой информации и удалить остаточные 2 мл от клеток до повторное 8 мл Бру, содержащий роста средств массовой информации. Избегайте использования свежего СМИ по заявлению BrU клеток, так как это может вызвать изменения в экспрессии генов.
  3. Инкубируйте клетки за 1 час с Бру и лечения. Вымыть клетки в 5 мл Хэнк буфера и trypsinize клетки, используя 2 мл 0,05% трипсина. Добавьте 8 мл питательных сред для остановки реакции, передачи клетки в 15 мл трубку и спин вниз клетки на 2 мин на 1000 x g.
  4. Удалить супернатант и извлекать всего РНК из клеток гранул с помощью изоляции RNA комплекта (см. Таблицу материалов) или любой другой предпочтительный метод и элюировать РНКазы свободный H2O. Store РНК-80 ° c до готовности продолжить.

2. Подготовка бусы для IP

  1. Подготовьте бусины в пакетах количество образцов должны расследоваться плюс один дополнительный для учета потерь во время закупорить и кружиться смешивания. Ресуспензируйте анти мыши IgG магнитные шарики тщательно смешивая кружить и вывезти 20 мкл бусы на сэмпл в свободной РНКазы 1,5 мл трубки. Место 1,5 мл трубки магнитного стенд и оставить около 20 s для бисера для сбора на стороне.
  2. Удалить супернатант, вынуть трубку от магнитного стенд и Ресуспензируйте в буфере Бру-IP 1 x 400 мкл, закупорить. Спиновые трубки очень кратко для 2 s в настольные центрифуги, поместите его обратно в магнитного стенд и удалить супернатант. Повторите шаг Стиральная один раз.
  3. Блок неспецифических привязка бусы, используя гепарина. Ресуспензируйте бисер в 1 мл 1 x BrU-IP + 1 мг/мл гепарина буфер и отпуск, ротационные для стирки 30 мин бисер один раз, как в шаге 2.2.
    Примечание: Гепарина-отрицательно заряженных полимер, который будет конкурировать с РНК для привязки. tRNA или другие не значения РНК может также использоваться если течению приложения не виртуализации.
  4. Ресуспензируйте бисер в 1 мл 1 x BrU-IP буфера и добавьте 1,25 антитела анти α-Бромдезоксиуридин мкг/образца, которая также признает Брю. Инкубировать Бусины для 1 h при вращении, или на ночь при комнатной температуре.
  5. Вымойте бусины три раза как в шаге 2.2. Ресуспензируйте бисер в 50 мкл/образца 1 x Бру-IP буфера с 1 мм Бру и отпуск, ротационные для 30 минут, чтобы снизить чувствительность антитела, связанный с бисером и настоящим риска неспецифических привязки во время IP.
  6. Вымойте бусины три раза как в шаге 2.2 и Ресуспензируйте 50 мкл/образец 1xBrU-IP буфера.

3. Привязка BrU помечены РНК бисером

  1. Измерять концентрации РНК РНК выдержек из шага 1.3 с помощью УФ видимые спектрофотометрии и разбавлять 40 мкг РНК от каждого образца в свободный РНКазы H2O к общим объемом 200 мкл.
  2. Тепло образцов РНК для 2 мин при 80 ° C до денатурировать РНК и спина кратко в настольной центрифуги. Добавьте 200 мкл 2 x BrU-IP + BSA/РНКазы ингибитора.
  3. Добавьте 50 мкл высокомобильна и подготовила бусы из шага 2.6 для каждой выборки и оставить вращающихся 1 ч. мыть бусины четыре раза как в шаге 2.2.

4. элюции и Очистка РНК экстракцией фенол фенол/хлороформ хлороформ 3 шага

  1. Элюировать РНК и выполнить извлечение фенола
    1. Ресуспензируйте бисер в 200 мкл Элюирующий буфер элюировать РНК и быстро после этого добавить 200 мкл рабочего раствора фенола, рН 6,6 (осторожно: токсичные, см. Примечание ниже шаг 4.1.2) чтобы удалить любые молекулы-РНК из образца.
    2. Вихрь смеси образца и спина 3 мин на 25000 х g в настольной центрифуги.
      Примечание: Фенол токсичных и обрабатываться в Зонта носить защиту кожи. Слегка кислой рН гарантирует, что только, ДНК и РНК не, извлекается. РНК будет оставаться в верхней водной фазе благодаря гидрофильные характер обвинения. Гидрофобные ядер белки связывают фенола и перейти к нижней органических фенол фазе.
  2. Выполнять извлечение фенола хлороформ
    1. Аспирационная столько Верхний этап как можно (около 190 мкл 200 мкл, в зависимости от опыта в обработке) и переместить его в трубку с 200 мкл фенол/хлороформ, рН 6,6 (осторожно: токсичные, см. Примечание). Убедитесь в том, чтобы аспирационная ту же сумму через образцы.
    2. Вихрь mix образца и спина на 3 мин на 25000 х g.
      Примечание: Хлороформ токсичных и обрабатываться в Зонта носить защиту кожи. Хлороформ добавляется удалить фенол, который может повлиять на течению анализ РНК путем ингибирования обратной транскрипции14 и полимеразной цепной реакции15.
  3. Выполнения извлечения хлороформ аспирационных водяной верхний участок как раньше (сейчас около 180 мкл) и передать трубка, содержащая 200 мкл хлороформ. Вихрь mix образца и Спиновое 3 мин на 25000 х g.
  4. Аспирационная водяной верхний участок как раньше (сейчас около 170 мкл) и передача его в пробирку, содержащую COONa, рН 6,0 17 мкл (1/10 объема) 3 M CH3. Для нейтрализации и осадить РНК от водного раствора, добавьте 2 мкл гликогена (20 мг/мл), который осаждает вместе с РНК и делает Пелле РНК более заметными.
  5. Добавьте 500 мкл Этанол 96% увеличить связывание ионов соли и РНК и микс, инвертирование трубки пару раз. Оставьте трубку на ночь-20 ° C или 15 мин на сухой лед.
  6. Спиновые образца на 25000 х g, 4 ° C на 30 мин удалить супернатант не нарушая гранулы и помыть лепешка в 185 мкл 75% этанол, чтобы удалить любые остаточные соли. Спина на 25 000 x g, 4 ° C за 5 мин.
  7. Отменить супернатант полностью не нарушая гранулы и оставить Пелле высохнуть 5-10 мин с открытой крышкой. Ресуспензируйте в 10 мкл РНКазы свободный H2O применяется на стороне трубки, чтобы не мешать гранулы.

5. анализ РНК

  1. Подготовить cDNA, используя cDNA обратной транскрипции Кит (см. Таблицу материалов) или любой другой предпочтительный метод с использованием 2 мкл пример РНК и 1 мкг дрожжи всего РНК как несущая РНК для реакции синтеза cDNA (не используется, если cDNA используется для следующего поколения секвенирования). Используйте 1 мкг РНК без дрожжей РНК для cDNA подготовки соответствующего вклада.
  2. Разбавить cDNA 1:25 и микс 9 мкл разбавленный cDNA с 10 мкл ПЦР мастер смесь и 1 мкл fluorogenic зонд, оба указанных в Таблице материалов.
    Примечание: CDNA разрежения зависит от подготовки cDNA и используемого метода ПЦР.
  3. Запустите следующую программу ПЦР (например, на 7500 быстро Real-time PCR системы или эквивалент): 2 мин при 50 ° C, 20 s при 95 ° C, 40 циклов 3 s при 95 ° C и 30 s при температуре 60 ° C.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Наши первоначальные испытания BrU маркировки времени выполнялись в клетках AsPC-1. Клетки были относиться с BrU для 0, 1, 2 и 4,5 часа, следуют общей РНК добыча и Бру-IP. GAS5 и GAPDH были измерены в BrU-IP РНК, которая продемонстрировала, что 1 h маркировки было достаточно, чтобы достичь примерно 9 - и 44 раза изменения, по сравнению с фон (0 h) для GAPDH и GAS5, соответственно.

Бру-IP и анализ описанных выше были использованы ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол описывает использование BrU-IP для определения РНК производства, маркировки вновь производится РНК за 1 час с Бру, затем немедленное извлечение RNA и иммунопреципитации BrU помечены РНК. Этот метод был описан ранее в ссылка16, и эта статья включает в себя некоторые дополнительные шаги для увеличения IP специфичность и чистоту РНК, предварительно обрабатывая бисером с низкой концентрацией Бру, а также Фенол хлороформ очистки шаг к повышение чистоты РНК после IP. Кроме того, мы также п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Фонд компании «Лундбек», Орхусе университет, Dandrite и Lundbeck антиспама поддерживает эту работу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ингибитор риболок рназыThermoFisherEO0381
Dynabeads M-280 Sheep антимышиный IgGLife Technologies11202D
α-Bromodeoxyuridine мышиное антителоBD Bioscience555627
Nanodrop 1000Thermo FisherУльтрафиолетовая видимая спектрофотометрия
Водонасыщенный фенол pH 6,6ThermoFisherAM9712
Фенол:Хлороформ:IAA 25:24:1 pH 6,6ThermoFisherAM9732
для выделения высокочистой РНКRoche11828665001
Набор для обратной транскрипции кДНК с высокой емкостьюThermoFisher4368814
Taqman Fast Advanced Master MixThermoFisher4444557qPCR Master Mix
РНК-зонды TaqmanThermoFisherSNCA: Hs01103383_m1, 18sРНК: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1Флурогенные зонды
7500 Система быстрой ПЦР в реальном времениПрикладные биосистемы
HEK293T клеточной линииATCC
Dulbecco's Modified Eagle's MediumLonzaBE12-604F
Эмбриональная сыворотка теленкаBiochromS0115
Пенициллин/СтрептомицинBiochromA2213
Hank's buffer5,3 мМ KCl, 0,44 мМ KH2PO4, 0,2 мМ Na2HPO4 и 136,8 мМ NaCl pH 6,77, автоклавированный.
DEPC-H2O0,1% диэтилпирокарбонат обработанный H2O
2xBrU-IP буфер40 мМ Tris-HCl pH 7,5 и 500 мМ NaCl в DEPC H2O
2xBrU-IP+BSA/РНКазный ингибитор2xBrU-IP буфер с добавлением 1 μ g/μ L BSA и 80 ЕД/мл Ribolock
BrU-IP+ 1 мг/мл гепарина2xBrU-IP буфер разведенный 1:1 DEPC-H2O и дополненный гепарином 1 мг/мл
2xBrU-IPбуфер разведенный 1:1 в DEPC-H2O и дополненный 0,5 мкм; g/μ L BSA и 20 Ед/мл Ribolock
Elution буфер0,1% SDS в H2O без РНКазы
Набор

Ссылки

  1. Kofoed, R. H., et al. Polo-like kinase 2 modulates α-synuclein protein levels by regulating its mRNA production. Neurobiol. Dis. 106, 49-62 (2017).
  2. Imamachi, N., et al. BRIC-seq: A genome-wide approach for determining RNA stability in mammalian cells. Methods. 67, 55-63 (2014).
  3. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).
  4. Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2014).
  5. Farrer, M., et al. Comparison of kindreds with parkinsonism and α-synuclein genomic multiplications. Ann. Neurol. 55, 174-179 (2004).
  6. Khodr, C. E., Becerra, A., Han, Y., Bohn, M. C. Targeting alpha-synuclein with a microRNA-embedded silencing vector in the rat substantia nigra: Positive and negative effects. Brain Res. , 47-60 (2014).
  7. Cooper, J. M., et al. Systemic exosomal siRNA delivery reduced alpha-synuclein aggregates in brains of transgenic mice. Mov. Disord. 29, 1476-1485 (2014).
  8. Magdalan, J., et al. alpha-Amanitin induced apoptosis in primary cultured dog hepatocytes. Folia Histochem. Cytobiol. 48, 58-62 (2010).
  9. Lu, D. F., et al. Actinomycin D inhibits cell proliferations and promotes apoptosis in osteosarcoma cells. Int. J. Clin. Exp. Med. 8, 1904-1911 (2015).
  10. Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription. Which compound to choose? How to evaluate its activity? Transcription. 2, 103-108 (2011).
  11. Tani, H., et al. Nuclear Bodies and Noncoding RNAs. Methods in Molecular Biology. 1262, 305-320 (2015).
  12. Meneni, S., et al. 5-Alkynyl-2'-deoxyuridines: chromatography-free synthesis and cytotoxicity evaluation against human breast cancer cells. Bioorg. Med. Chem. 15, 3082-3088 (2007).
  13. Meola, N., et al. Identification of a Nuclear Exosome Decay Pathway for Processed Transcripts. Mol. Cell. 64, 520-533 (2016).
  14. Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 31-42 (2016).
  15. Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J. Appl. Microbiol. 113, 1014-1026 (2012).
  16. Paulsen, M. T., et al. Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA. Methods. 67, 45-54 (2014).
  17. Dölken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. Rna. , 1959-1972 (2008).
  18. Raghavan, A., et al. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30, 5529-5538 (2002).
  19. Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16, 45-58 (2009).
  20. Pandya-Jones, A., et al. Splicing kinetics and transcript release from the chromatin compartment limit the rate of Lipid A-induced gene expression. RNA. 19, 811-827 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

HEK293TIP

Похожие статьи