Методическая статья

Легковесные протокол для создания Site-Specifically ацетилированный белков в Escherichia Coli

6.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57061

⸱

9 декабря 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Arkansas, 2Cell and Molecular Biology Program, University of Arkansas, 3Department of Biological Sciences, University of Arkansas, 4Fayetteville High School

В этой статье

Краткое содержание

Генетический код расширения служит мощным инструментом для изучения широкий спектр биологических процессов, включая белка ацетилирования. Здесь мы демонстрируем, что снисходительный протокол использовать этот метод для генерации однородно ацетилированные белков в конкретных местах в клетках Escherichia coli .

Аннотация

Показано, что столб-поступательные изменения, которые происходят в определенных позициях белков, играют важную роль в различных клеточных процессов. Среди них реверсивные лизин ацетилирования является одним из наиболее широко распространены во всех сферах жизни. Хотя были проведены многочисленные исследования acetylome массы на основе спектрометрии, далее характеристика этих целей предполагаемого ацетилирования был ограниченным. Одна из возможных причин является, что это трудно создать чисто ацетилированный белков в желаемой позиции, большинство классических биохимических подходов. Для преодоления этой проблемы, был применен метод расширения генетического кода использовать пары инженерии pyrrolysyl ТРНК синтетазы вариант и его родственных tRNA из Methanosarcinaceae видов, для прямого включения cotranslational из acetyllysine на конкретной площадке в протеина интереса. После первого применения в исследовании ацетилирование гистонов этот подход способствовал ацетилирования исследования на различных белков. В этой работе мы продемонстрировали снисходительный протокол производить site-specifically ацетилированный белки, используя модель бактерией Escherichia coli в качестве принимающей страны. Дегидрогеназа малат был использован как демонстрационный пример в этой работе.

Введение

Столб-поступательные изменения (PTMs) белков происходят после процесса перевода и возникают от ковалентных добавления функциональных групп аминокислотных остатков, играя важную роль в почти всех биологических процессов, в том числе ген Транскрипция, реакции на стресс, клеточной дифференцировки и метаболизм1,2,3. На сегодняшний день, около 400 отличительные PTMs были определены4. Замысловатость генома и протеома в значительной степени усугубляется белка PTMs, как они регулируют активность белка и локализации и влияет на взаимодействие с другими молекул, таких как белки, нуклеиновые кислоты, липиды и кофакторы5.

Белка ацетилирования был на переднем крае PTMs исследований в последние два десятилетия6,,78,9,10,11,12. Лизин ацетилирования был впервые обнаружен в гистонами более чем 50 лет назад13,14, были хорошо изучены и как известно, существуют в более чем 80 факторов транскрипции, регуляторы и различных белков15, 16,17. Исследования на ацетилирование белка не только предоставили нам более глубокое понимание ее механизмов регулирования, но также руководствуется лечения целого ряда заболеваний, вызванных неблагополучных ацетилирования18,19, 20 , 21 , 22 , 23. считалось, что лизин ацетилирования происходит только в клетках эукариот: у, но недавние исследования показали, что белки ацетилирования также играет ключевую роль в бактериальных физиологии, в том числе хемотаксис, кислотоустойчивость, активации и стабилизации острова патогенности и другие вирулентности связанных белков24,25,26,27,,2829.

Часто используемый метод биохимически характеризовать ацетилирования лизин является использование сайта Направленный мутагенез. Глютамин используется как имитировать acetyllysine из-за его аналогичного размера и полярности. Аргинин используется как лизин ацетилированные мнемосхемы, поскольку она сохраняет свой положительный заряд в физиологических условиях, но не может быть ацетилированные. Однако оба имитирует не реальная isosteres и не всегда дают ожидаемые результаты30. Наиболее строгий подход заключается в создании однородно ацетилированный белков в конкретных лизин остатков, который является трудным или невозможным для самых классических методов из-за низкой стехиометрии ацетилирования лизина в природе7,11. Эта задача была разгадана, стратегия расширения генетического кода, который использует инженерии pyrrolysyl тРНКГлу-синтетаза вариант от Methanosarcinaceae видов для зарядки tRNAпыль с acetyllysine, использует принимающей трансляционная техника для подавления UAG остановить кодон в мРНК и направляет включение acetyllysine в положение целевого белка31. Недавно мы оптимизировали этой системы с улучшение EF-ту привязки tRNA32 и модернизированный acetyllysyl ТРНК синтетазы33. Кроме того мы применили этой системы расширения включения в исследования ацетилирования малат дегидрогеназа34 и тирозил тРНК синтетазы35. Здесь мы демонстрируем протокол для генерации чисто ацетилированный белки от молекулярного клонирования для биохимической идентификации с помощью малат дегидрогеназа (MDH), который мы тщательно изучили как яркий пример.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. сайт Направленный мутагенез целевого гена

Примечание: MDH выражается под T7 промоутер в векторе ПХДФ-1 с CloDF13 происхождения и копировать количество 20-40-34.

  1. Ввести янтаря стоп кодон в позиции 140 гена грунтовки (вперед грунтовка: GGTGTTTATGACтегAACAAACTGTTCGGCG и обратить вспять грунтовка: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC), следуя инструкциям сайта Направленный мутагенез комплекта.
  2. Усилить плазмида шаблон, содержащий Джин одичал тип малат дегидратазы и вставьте стоп кодон мутации полимеразной цепной реакции (ПЦР) реакции. В реакционной смеси, включают 12,5 мкл 2 X ДНК полимераза фермент смесь, 1,25 мкл 10 мкм вперед грунт, 1,25 мкл 10 мкм обратный грунт, 1 мкл шаблона ДНК (20 нг/мкл) (ПХДФ-1 плазмида, содержащие ген MDH одичал типа) и 9 мкл воды, свободной от нуклеиназы.
    1. Используйте параметры реакции PCR следующим: первоначальный денатурации на 98 ° C за 30 сек; 25 циклов 10 s на 98 ° C, 30 сек при 55 ° C и 3 мин при 72 ° C; окончательное расширение при 72 ° C на 3 мин. После ПЦР добавьте усиленный материал непосредственно к смеси фермента протеинкиназы-лигаза-ДПНИ из комплекта за 1 ч при комнатной температуре для удаления рецензий и шаблон.
      Примечание: Реакционную смесь содержит 1 мкл ПЦР продукта, 5 мкл 2 X буфер реакции, 1 мкл 10 X киназы-лигаза-ДПНИ смеси ферментов, и 3 мкл воды, свободной от нуклеиназы.
  3. Добавить 5 мкл реакция смеси для трубки 25 мкл талой сведущее Escherichia coli DH5α клеток из комплекта. Тщательно проведите трубки смешивать и поместите смесь на льду на 30 мин теплового шока смесь при 42 ° C 30 s, и место на льду для дополнительных 5 мин.
    1. Пипетка 600 мкл комнатной температуры Супер Оптимал бульон с Catabolite репрессий (SOC) СМИ из комплекта в смесь, инкубации при 37 ° C 60 мин с встряхивания на 250 об/мин, распространение 100 мкл на lysogeny бульон (LB) агар пластину с соответствующими антибиотиками и инкубировать на ночь при 37 ° C при встряхивании в 250 об/мин.
  4. Выбрать 4-6 единого колоний в 6 мл свежего LB СМИ с соответствующими антибиотиками и проинкубируйте при 37 ° C ночь с встряхивания на 250 об/мин. Извлечь плазмид из каждой ночи культуры, комплект очистки плазмида, после руководство производителя, а затем отправить плазмиды для секвенирования ДНК согласно протоколу поставщика услуг для подтверждения остановки кодон мутации в правильной позиции.
  5. Храните штамма с правильной последовательности при температуре-80 ° C, смешивая 1 мл ночь культуры и 300 мкл 100% ДМСО.

2. выражение ацетилированный белка

  1. Вставьте гены оптимизированный acetyllysyl ТРНК синтетазы33 и оптимизированный tRNA 32 пыль в плазмиду pTech . Место tRNA синтетаза гена под учредительного lpp промоутер. Место tRNA гена под учредительный прок промоутер34.
    1. Совместное преобразование вектора выражения34 , содержащие мутировавших генов TAG-содержащих малат дегидрогеназы, и плазмиды, укрывательство включение системы оптимизированного acetyllysine, в 25 мкл талой компетентным E. coli BL21(DE3) клетки теплового шока при 42 ° C 10 s, и место на льду для дополнительных 5 мин.
    2. Пипетка 600 мкл комнатной температуре SOC СМИ в смесь, инкубации при 37 ° C 60 мин при встряхивании в 275 об/мин, распространение 100 мкл на тарелку с 100 мкг/мл стрептомицина и 50 мкг/мл хлорамфеникола и инкубировать на ночь при 37 ° C при встряхивании в 275 об/мин.
  2. Возьмите одной колонии от плиты и инокуляции в 15 мл свежего LB СМИ с 100 мкг/мл стрептомицина и хлорамфеникол 50 мкг/мл в 50 мл трубки на ночь при 37 ° C при встряхивании со скоростью 250 об/мин. Передача на ночь культуры 15 мл 300 мл свежего LB СМИ с антибиотиками в колбе 1 Л и инкубировать при 37 ° C с встряхивания на 250 об/мин.
  3. Растворяют acetyllysine с водой, чтобы сделать Стоковый раствор 100 мм, хранить при 4 ° C. Добавить acetyllysine 5 мм и 20 мм никотинамид (ингибитор комплексы) в СМИ роста когда поглощения достигает 0,5 на 600 Нм.
    1. Расти клеток для дополнительного 1 ч при 37 ° C, тряски на 250 об/мин, затем добавить 0,5 мм ИПТГ для выражения протеина и расти клеток при 25 ° C на ночь, с встряхивания на 180 об/мин.
      Примечание: Выражения условий может потребоваться оптимизация для различных белков.
  4. Собрать клетки центрифугированием в 3000 x g при 4 ° C на 15 мин, отбросить супернатанта и мыть ячейки окатышей с фосфат амортизированное физиологический (PBS) буфера (10 мм Na2HPO4, 1.8 мм х2PO4, 137 мм NaCl, 2.7 KCl). Собирать вымыть клетки на 10000 x g при 4 ° C за 5 мин, удалить супернатант и хранить клетки окатышей на-80 ° C.

3. Очистка ацетилированный белка

  1. Оттепель замороженных клеток окатышей на льду и вновь приостановить с 15 мл буфера lysis (50 мм трис (гидроксиметил) aminomethane (Tris) рН 7,8, 300 мм NaCl, имидазола 20 мм и 20 мм никотинамид), 5 мкл β-меркаптоэтанол и 1 мкл Benzonase Нуклеаза (250 единиц).
  2. Разбить ячейки на sonication 40 кГц на 70% мощности с 10 циклов 10 коротких очередей s, а затем каждые 30 s для охлаждения в виде сырой экстракт. Центрифуга сырой экстракт на 20000 x g 25 мин при 4 ° C. Фильтр супернатант с 0,45 мкм мембранный фильтр и загрузить в столбец, содержащий 1 мл никель Нитрилотриуксусная кислота (Ni-НТА) смолы достижение равновесного уровня с 20 мл воды и 20 мл буфера lysis.
    Примечание: Клетки также может быть нарушена мягкими моющими средствами, если sonication не доступен.
  3. Промойте колонку с 20 мл буфера мытья (имидазола 50 мм, 50 мм трис рН 7,8, 300 мм NaCl и никотинамид 20 мм), а затем элюировать с 2 мл буфера (50 мм трис рН 7,8, 300 мм NaCl, имидазола 150 мм и 20 мм никотинамид).
  4. Опреснения элюции дроби с обессоливания буфера (25 мм трис pH 7,8 и 10 мм NaCl) в столбце адаптер PD-10, следуя инструкцией производителя. Измерьте концентрацию eluted белка, следуя инструкции реагента assay протеина Брэдфорд. Обессоленной белок готова для дальнейших экспериментов.
    Примечание: Сделайте запас глицерина 50% белка и храните в-80 ° C для хранения.

4. биохимическая характеристика ацетилированный белка

  1. SDS-PAGE и масс спектрометрии анализы.
    1. Денатурировать белки с натрия Додециловый сульфат (SDS) буфер образца (5 мкл белка образца с 2 мкл 4 X буфер образца SDS) в 2-мл пробирку при 105 ° C за 5 мин, центрифуга смеси на 2000 x g 10 s, нагрузка на 4-20% натрия Додециловый сульфат полиакриламидный гель electroph гель oresis (SDS-PAGE) и запустить на 200 V за 30 мин.
    2. Промойте гель с дистиллированной водой и поколебать мягко в течение 5 минут, повторяя этот процесс 3 раза. Слейте воду и пятно гель с Кумасси синий пятно за 1 час с нежным встряхивания. Де краситель гель с дистиллированной водой, слегка встряхните 30 мин, и повторите, это снять пятно 3 раза.
    3. Вырезать группу на 33 кДа на Кумасси синим окрашенных геля SDS-PAGE и отправить его в масс-спектрометрии зал или компании, чтобы убедиться, что acetyllysine была включена в положение.
      Примечание: В протоколе анализа масс-спектрометрии вслед за предыдущий эксперимент34.
  2. Западный Blotting
    1. Запустите геля SDS-PAGE для одного протокола на шаге 4.1. После запуска гель Замочите гель с буфера передачи (25 мм трис, 192 мм глицин, pH 8.3 и 20% метанола) за 15 мин.
    2. Активировать 0,2 мкм, 7 x 8.5 см винилидена фторид (PVDF) мембраны с метанолом за 1 мин и промыть передачи буфера перед подготовкой передачи сэндвич.
      Примечание: Метанол является опасным в случае контакта с кожей, зрительный контакт, при приеме внутрь или ингаляции. Тяжелые чрезмерное воздействие может привести к смерти.
    3. Сделайте бутерброд передачи от катода к аноду (Губка, Бумага фильтровальная, SDS-PAGE гель, PVDF мембрану, фильтровальная бумага и Губка). Поместить в стек в передаче танк, на постоянный ток 350 мА по 45 мин.
      Примечание: Время переноса может потребоваться оптимизация.
    4. Вымойте PVDF мембрану с 25 мл трис буфер солевой, 0.1% 20 анимации (TBST) (137 мм NaCl, 20 мм трис, 0,1% Tween-20, pH 7,6) буфер для 5 мин с нежным встряхивания. Блокировать мембраны с 5% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в TBST буфер для 1 ч при комнатной температуре.
    5. Проинкубируйте мембрану с ПХ конъюгированных acetyllysine антитела с конечной концентрации 1 мкг/мл разбавляют 5% BSA в TBST на 4 ° C на ночь с нежным встряхивания.
      Примечание: Для быстрых результатов этот шаг может быть выполнена в комнатной температуре в течение 1 ч. Разбавления антитела может потребоваться оптимизация.
    6. Вымойте мембраны с буфером TBST 20 мл на 5 мин с нежно тряска, повторив шаг 4 раза. Применить хемилюминесценции субстрата к мембране, следуя инструкциям производителя. Захват сигнала с зарядовой (связью ПЗС) на основе камеры тепловизор.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Доходность ацетилированный MDH белка был 15 мг на 1 Л культуры, в то время как одичал тип MDH-31 мг на 1 Л культуры. Очищенные белки были проанализированы на SDS-PAGE, как показано на рисунке 1. MDH одичал тип использовался в качестве позитивного управления34. Белка, очищенного от клетки укрывательство включение системы acetyllysine (AcK) и ген мутанта mdh , но без AcK в СМИ роста, использовался в качестве отрицательного контр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Генетических включение канонические аминокислот (ncAAs) основана на подавление назначенного кодон, главным образом янтаря стоп кодон UAG36,37,38,39, ncAA заряженные tRNA содержащие соответствующие антикодон. Как известно, UAG кодон признается выпуска фактор-1 (RF1) бактерий, и это может также быть подавлено вблизи родственных tRNAs от узлов, взимаемые канонические аминокислоты (cAAs) как лизин ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана NIH (AI119813), запуск из университета Арканзас и награда от Институт бионауки Арканзас.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Анализ белка BradfordBio-Rad5000006Концентрация белка
4x Laemmli Буфер для образцовBio-Rad1610747SDS Буфер для образцов
Coomassie G-250 StainBio-Rad1610786SDS-PAGE окрашивание гелем
4-20% SDS-PAGE готовый гельBio-Rad4561093Определение белка
Ac-K-100 (конъюгат HRP)Cell Сигнализация6952Антитело
IPTGCHEM-IMPEX194Индуктор экспрессии
Nε -ацетил-L-лизинCHEM-IMPEX5364неканонической аминокислоты
PD-10GE Healthcare17085101Набор для антиоксидантного
мутагенеза Q5NEBE0554Введение в клетки стоп-кодона
BL21 (DE3)NEBC2527Экспрессирующий штамм
QIAprep Spin Miniprep KitQIAGEN27106Экстрагирование плазмид
Смола Ni-NTAQIAGEN30210Аффинная очистка смола
никотинамидSigma-AldrichN3376Ингибитор деацетилазы
&бета;-меркаптоэтанолСигма-ОлдричM6250Восстановитель
BugBuster Реагент для экстракции белкаSigma-Aldrich70584Разрушение клеток
Бензоназа нуклеазаSigma-AldrichE1014ДНКаза
ECL Вестерн Блоттинг СубстратThermoFisher32106Хемилюминесценция
Предварительно смешанный LB БульонVWR97064Клеточная среда для роста
крупного рогатого скота Бычий сывороточный альбуминVWR97061-416блокирование вестерн-блоттинга
Колонка для обессоливания

Ссылки

  1. Krishna, R. G., Wold, F. Post-translational modification of proteins. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 67, 265-298 (1993).
  2. Lothrop, A. P., Torres, M. P., Fuchs, S. M. Deciphering post-translational modification codes. FEBS Lett. 587 (8), 1247-1257 (2013).
  3. Walsh, C. T. Posttranslational modification of proteins : expanding nature's inventory. , Roberts and Company Publishers. Englewood, Colorado. (2006).
  4. Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Sci Rep. 1, (2011).
  5. Grotenbreg, G., Ploegh, H. Chemical biology: dressed-up proteins. Nature. 446 (7139), 993-995 (2007).
  6. Arif, M., Selvi, B. R., Kundu, T. K. Lysine acetylation: the tale of a modification from transcription regulation to metabolism. Chembiochem. 11 (11), 1501-1504 (2010).
  7. Cohen, T., Yao, T. P. AcK-knowledge reversible acetylation. Science's STKE : signal transduction knowledge environment. (245), pe42(2004).
  8. Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. The world of protein acetylation. Biochim Biophys Acta. 1864 (10), 1372-1401 (2016).
  9. Escalante-Semerena, J. C. Nε-acetylation control conserved in all three life domains. Microbe. 5, 340-344 (2010).
  10. Kouzarides, T. Acetylation: a regulatory modification to rival phosphorylation? The EMBO journal. 19 (6), 1176-1179 (2000).
  11. Soppa, J. Protein acetylation in archaea, bacteria, and eukaryotes. Archaea. , (2010).
  12. Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (4), 258-264 (2015).
  13. Allfrey, V. G., Faulkner, R., Mirsky, A. E. Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of Rna Synthesis. P Natl Acad Sci USA. 51, 786-794 (1964).
  14. Phillips, D. M. The presence of acetyl groups of histones. Biochem j. 87, 258-263 (1963).
  15. Sterner, D. E., Berger, S. L. Acetylation of histones and transcription-related factors. Microbiology and molecular biology reviews: MMBR. 64 (2), 435-459 (2000).
  16. Glozak, M. A., Sengupta, N., Zhang, X., Seto, E. Acetylation and deacetylation of non-histone proteins. Gene. 363, 15-23 (2005).
  17. Close, P., et al. The emerging role of lysine acetylation of non-nuclear proteins. Cell Mol Life Sci. 67 (8), 1255-1264 (2010).
  18. Iyer, A., Fairlie, D. P., Brown, L. Lysine acetylation in obesity, diabetes and metabolic disease. Immunol Cell Biol. 90 (1), 39-46 (2012).
  19. You, L., Nie, J., Sun, W. J., Zheng, Z. Q., Yang, X. J. Lysine acetylation: enzymes, bromodomains and links to different diseases. Essays Biochem. 52, 1-12 (2012).
  20. Bonnaud, E. M., Suberbielle, E., Malnou, C. E. Histone acetylation in neuronal (dys)function. Biomol Concepts. 7 (2), 103-116 (2016).
  21. Fukushima, A., Lopaschuk, G. D. Acetylation control of cardiac fatty acid beta-oxidation and energy metabolism in obesity, diabetes, and heart failure. Biochim Biophys Acta. 1862 (12), 2211-2220 (2016).
  22. Kaypee, S., et al. Aberrant lysine acetylation in tumorigenesis: Implications in the development of therapeutics. Pharmacol Ther. 162, 98-119 (2016).
  23. Tapias, A., Wang, Z. Q. Lysine Acetylation and Deacetylation in Brain Development and Neuropathies. Genomics Proteomics Bioinformatics. 15 (1), 19-36 (2017).
  24. Hu, L. I., Lima, B. P., Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: the dawning of a new age. Molecular microbiology. 77 (1), 15-21 (2010).
  25. Jones, J. D., O'Connor, C. D. Protein acetylation in prokaryotes. Proteomics. 11 (15), 3012-3022 (2011).
  26. Bernal, V., et al. Regulation of bacterial physiology by lysine acetylation of proteins. New biotechnol. 31 (6), 586-595 (2014).
  27. Hentchel, K. L., Escalante-Semerena, J. C. Acylation of Biomolecules in Prokaryotes: a Widespread Strategy for the Control of Biological Function and Metabolic Stress. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 79 (3), 321-346 (2015).
  28. Ouidir, T., Kentache, T., Hardouin, J. Protein lysine acetylation in bacteria: Current state of the art. Proteomics. 16 (2), 301-309 (2016).
  29. Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: new discoveries unanswered questions. Curr Genet. 62 (2), 335-341 (2016).
  30. Albaugh, B. N., Arnold, K. M., Lee, S., Denu, J. M. Autoacetylation of the histone acetyltransferase Rtt109. J Biol Chem. 286 (28), 24694-24701 (2011).
  31. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding Nε-acetyllysine in recombinant proteins. Nat chem biol. 4 (4), 232-234 (2008).
  32. Fan, C., Xiong, H., Reynolds, N. M., Soll, D. Rationally evolving tRNAPyl for efficient incorporation of noncanonical amino acids. Nucleic Acids Res. 43 (22), e156(2015).
  33. Bryson, D., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases to alter amino acid specificity and enhance activity. Nat Chem Biol. , (2017).
  34. Venkat, S., Gregory, C., Sturges, J., Gan, Q., Fan, C. Studying the Lysine Acetylation of Malate Dehydrogenase. J Mol Biol. 429 (9), 1396-1405 (2017).
  35. Venkat, S., Gregory, C., Gan, Q., Fan, C. Biochemical characterization of the lysine acetylation of tyrosyl-tRNA synthetase in Escherichia coli. Chembiochem. 18 (19), 1928-1934 (2017).
  36. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  37. Mukai, T., Lajoie, M. J., Englert, M., Soll, D. Rewriting the Genetic Code. Annu Rev Microbiol. , (2017).
  38. O'Donoghue, P., Ling, J., Wang, Y. S., Soll, D. Upgrading protein synthesis for synthetic biology. Nat Chem Biol. 9 (10), 594-598 (2013).
  39. Chin, J. W. Expanding and reprogramming the genetic code of cells and animals. Annu Rev Biochem. 83, 379-408 (2014).
  40. O'Donoghue, P., et al. Near-cognate suppression of amber, opal and quadruplet codons competes with aminoacyl-tRNAPyl for genetic code expansion. FEBS Lett. 586 (21), 3931-3937 (2012).
  41. Aerni, H. R., Shifman, M. A., Rogulina, S., O'Donoghue, P., Rinehart, J. Revealing the amino acid composition of proteins within an expanded genetic code. Nucleic Acids Res. 43 (2), e8(2015).
  42. Huang, Y., et al. A convenient method for genetic incorporation of multiple noncanonical amino acids into one protein in Escherichia coli. Mol Biosyst. 6 (4), 683-686 (2010).
  43. Venkat, S., et al. Genetically encoding thioacetyl-lysine as a nondeacetylatable analog of lysine acetylation in Escherichia coli. FEBS Open. , (2017).
  44. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
  45. Gregoretti, I. V., Lee, Y. M., Goodson, H. V. Molecular evolution of the histone deacetylase family: functional implications of phylogenetic analysis. J Mol Biol. 338 (1), 17-31 (2004).
  46. Weinert, B. T., et al. Acetyl-phosphate is a critical determinant of lysine acetylation in E. coli. Mol cell. 51 (2), 265-272 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Escherichia coliBL21 DE3

Похожие статьи