Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Характеристика и изоляция первичной микроглии мыши по плотности градиентного центрифугирования

19.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57065

⸱

16 февраля 2018 г.

 ,  ,  , 
1The Ritchie Centre, Hudson Institute of Medical Research, 2Department of Obstetrics & Gynaecology, Monash University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Протокол для изоляции первичных микроглии из мышиных мозги представлены. Этот метод помогает в углублении нынешнего понимания Неврологические заболевания. Плотность градиентного центрифугирования и магнитной сепарации объединяются для получения достаточного урожая высоки чисто образца. Кроме того мы наметим шаги для характеризации микроглии.

Аннотация

Микроглии, резидентов иммунные клетки в головном мозге, являются первыми реагируют воспаление или травмы в центральной нервной системе. Недавние исследования показали микроглии быть динамичной, способны взять на себя про воспалительных и противовоспалительным фенотипов. (Про воспалительных) М1 и м2 (pro репаративной) фенотипов играть важную роль в neuroinflammatory условиях, таких как перинатальной черепно-мозговой травмы и выставка различные функции в ответ на определенные экологические стимулы. Модуляция микроглии активации было отмечено придать нейропротекции, таким образом предлагая микроглии может иметь терапевтический потенциал в черепно-мозговой травмы. Однако дополнительные исследования необходимо лучше понять роль микроглии в болезни, и этот протокол облегчает что. Протокол описанных ниже сочетает плотность градиентного центрифугирования процесс уменьшения сотовой мусора, с магнитной сепарации, производить очень чистый образец первичных Микроглии клеток, которые могут использоваться для экспериментов в пробирке , без потребность в 2-3 недели культивирования. Кроме того характеристика шаги дают надежные функциональные данные о микроглии, пособничество исследования для улучшения нашего понимания поляризации и грунтовки этих клеток, которая имеет серьезные последствия в области регенеративной медицины.

Введение

Ущерб, приобретенные в перинатальный период от воспаления, гипоксическая ишемия и кровотечение может иметь массив долгосрочных осложнений. Привлечь воспаления и ишемии с последовавшей смерти нейронов и аксональной1предположил комплекс патофизиологии перинатальной черепно-мозговой травмы. Врожденный иммунный ответ играет важную роль в каскад событий, приведших к травмы2.

Микроглии, резидентов иммунные клетки в пределах центральной нервной системы (ЦНС), являются первыми реагируют на травмы3. Микроглии являются типы пластиковых клеток с способность быть защитные или токсичными, зависит от окружающей среды4. Они участвуют в хемотаксис, фагоцитоз, презентации антигена и производство цитокинов и реактивнооксигенных видов4,5. Стареющей микроглии постоянно обследования окружающей среды и активируются присутствие иностранных или вредные вещества,4. Активация приводит к про воспалительной реакции, критические в ЦНС защиты4. Эти М1 «про воспалительных» фенотип микроглии главным образом участвуют в презентации антигена и гибель патогенов4. Несмотря на решающую роль воспалительной реакции в нейропротекции неконтролируемое или длительное воспаление может быть вредным и привести к повреждения нейронов4. Однако при воздействии определенных экологических раздражителей, микроглии могут exhibit противовоспалительные фенотип. Эти про репаративной микроглии м2 имеют решающую роль в заживление ран и ремонт6, освобождение ряда цитокинов и других растворимых медиаторов, что помощью воспаления, усиливают фагоцитоз и поощрять ремонт4, 7. роли микроглии разнообразны и включают вождения Олигодендроциты дифференциация во время ре миелинизации8, защищая нейроны во время истощения кислорода и глюкозы в ход модели9 и поощрение neurite нарост в травмы спинного мозга моделей10.

Изучение этих глиальных клеток представляет собой важный аспект в понимании и манипулирования ответ на neuroinflammation. Описывается протокол позволяет для дальнейшего расследования терапевтический потенциал микроглии модуляции в neuroinflammatory расстройств.

Модуляция микроглии активации к роли нейропротекторной наблюдается в диапазоне условий11,12,13. Таким образом улучшение нынешнего понимания и дальнейшего изучения модуляции микроглии активации является критическим, требующих использования различных моделей, включая в пробирке и в естественных условиях. В vitro исследования представляют собой важный инструмент из-за их большей эффективности, Нижняя стоимость и возможность исследовать популяции изолированных клеток.

Существует целый ряд протоколов, описанные в литературе для изоляции микроглии из мышиных мозги, вызов эффективно производить высокий урожай образца с хорошей жизнеспособность и высокой чистоты. Часто используемые методы изоляции первичных Микроглии являются магнитной сепарации и длительной тряски смешанные глиальных культур. Через личный опыт было установлено, что существует высокая степень сотовой мусора, который препятствовали столбце магнитные. Таким образом был использован следующий протокол, который включает в себя шаг градиентного центрифугирования Начальная плотность, следуют CD11b магнитной сепарации. Производить очень чистый образец в достаточном количестве был оптимизирован протокол, описанные ниже. Это выгодно из-за его высокой чистоты и короткий период времени — одно можно выполнения анализов в течение 2 дней без культуры для 2-3 недели. Этот протокол потенциально может быть адаптирована для изоляции первичных мышиных астроциты.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Следующие процедуры были одобрены Комитет этики животных университета Монаш. C57Bl6/J P3-6 здорового без лечения новорожденных мышей были использованы для создания представительных результатов.

1. ферментативный пищеварения

Примечание: Важно рассмотреть стерильности при изоляции и культивирования клеток первичной. Хотя обеспечение окружающей среды является стерильной, насколько это возможно, первоначальных диссекции и урожай мышиных мозги может комплектоваться вне капотом Ламинальный потока, все последующие шаги, выполняемые в рамках Ламинарный шкаф.

  1. С помощью стерильных инструментов, усыпить мыши на шейки матки дислокации, обезглавить животного и сполосните 100% этанола. С помощью небольших стерильными ножницами, сделайте небольшие разрезы вдоль правой и левой стороны головы. В этом возрасте пилинг кожи прочь легко. Используя советы Изогнутый пинцет, аккуратно вставьте ткани к трибуне подвергать черепа, включая Bregma.
  2. Вставьте наконечник ножницы в открытии позвоночного канала и сделать боковой разрез в ушной канал. Сделать надрез вдоль сагиттального шва Bregma, мягко указывая кончиком ножниц вверх, чтобы предотвратить повреждение мозга. Вставьте наконечник ножницы в Bregma и сделать боковые разрезы в правой и левой стороны головы вдоль шва корональный.
  3. С помощью щипцов, осторожно удаляйте черепа, чтобы разоблачить мозга. Чтобы сделать это, возьмите края черепа, предоставляемые боковой разрез и осторожно потяните черепа в сторону. Череп следует очистить от легко. С помощью Изогнутый пинцет, нежно совок в мозг, чтобы удалить его.
  4. Мозг в 5 мл стерильного контейнера, мыть 2 - 3 раза с ледяной мыть СМИ (низкий глюкозы Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) дополнены 1% пенициллин стрептомицином), примерно в 5 мл СМИ за вымыть, удалить крови.
  5. В капюшоне ламинарного воздушного потока Поместите содержимое контейнера 5 мл в небольшой Петри (35 мм), опираясь на льду. С помощью лезвия стерильным скальпель или стерильными ножницами, удалите мозжечка и обонятельные луковицы. Сделайте срединной разрезается с целью разделения двух полушарий.
  6. Тщательно очистите от менингеальные слой с тонкой щипцами, стараясь не повредить коре. Идентифицировать менингеальные слой как очень тонкий слой клеток с красным оттенком на поверхности мозга, с видимым кровеносных сосудов. Сохраняя мозга холодной имеет важное значение для надлежащего мозговых оболочек удаления. Если менингеальные слой влезает, продолжают пилинг от разорванной фрагментов до тех пор, пока она полностью удаляется.
  7. Передать полушарий новой небольшой Петри (на льду) и заполнить с мыть СМИ. Мозг нарезать на мелкие кусочки с стерильным скальпель лезвие/ножницы.
    Примечание: Они должны быть2 ~ 1 мм в размер, и следует позаботиться не их слишком мелко нарезать как это может снизить доходность.
  8. Добавить 100 мкл папаин (17 U/мг запасов) и 150 мкл DNase I в СМИ и Инкубируйте 30 минут при 37 ° C
  9. После переваривания нарезанных ткани с помощью пипетки P1000. Если куски ткани слишком велики, чтобы войти пипеткой, рассмотрите возможность использования пара или стерильными ножницами расширить наконечник пипетки. В ходе этого процесса заботиться не ввести пузыри в средства массовой информации, как это может уменьшить жизнеспособность клеток.

2. миелина мусора

  1. Под капотом ламинарного потока используют стерильные оборудование, подготовить 50 мл Конические трубки с 100 мкм клеток сетчатый фильтр, для каждого мозга. Залейте содержимое Петри, содержащий дайджест среднего и мозг штук на сито. Протолкнуть части мозга с помощью поршень 3 мл стерильного шприца в шлифовальных движения до тех пор, пока не больше ткани видна. После переваривания ткани мозга должна понизиться врозь легко.
  2. Постоянно стирать фильтр с мыть СМИ, долива ситечко клеток на протяжении всего этого процесса. Это будет мыть через любой клетки, захваченных в сетчатый фильтр.
    Примечание: Это следует сделать до тех пор, пока существует примерно ~ 15 мл в трубе. Это обеспечить, что фильтр достаточно мыть через и увеличить количество собранных клеток.
  3. Центрифуга для одной ячейки подвеска на 500 x g 5 мин при 4 ° C. В это время подготовьте средний градиент плотности, как описано.
    1. Подготовка запасов изотонический percoll (SIP), который плотность градиента среды используется. Сделать это путем добавления 10 x стерильные Хэнкс сбалансированного солевого раствора (HBSS) соотношение 9:1 градиента плотности среды.
    2. Подготовить градиентов как 30% SIP в среде DMEM и 70% SIP в 1 x HBSS. Например, чтобы подготовить 10 мл 30% SIP, добавить 3 мл SIP 7 мл DMEM.
  4. Аспирационная супернатант конические трубы и Ресуспензируйте клетки лепешка с 8 мл 30% SIP в среде DMEM. Полном объеме передать свежие 15 мл Конические трубки.
  5. Подложки решение SIP 70%. Для этого, заполните передачи пипетки с 70% SIP и тщательно push путем передачи пипетку в нижней части Конические трубки. После того, как кончик приближается к нижней, аккуратно вставьте через содержимое передачи пипеткой.
    Примечание: Делать это медленно так, чтобы не нарушить интерфейс 30/70. Должны существовать четкие линии, разделяющей два слоя.
  6. Центрифуга SIP слои, включая клетки, на 650 x g с тормоз 0 и ускорение 4, 25 мин при комнатной температуре.
    Примечание: Важно завершить спин с тормозом OFF и позволить центрифуги медленно прийти к остановке, как применение тормозов нарушить интерфаза и резко сократить коллекции ячеек между слоями SIP.
  7. Аспирационная сотовой мусора в верхней части трубки и извлеките из верхней примерно 4 мл. Это позволит облегчить удаление мононуклеарных клеток в следующем шаге. С помощью пипетки P1000, осторожно опустите кончик пипетки к интерфазе. Изолируйте мононуклеарных клеток от 30/70 плотность градиента средних интерфейса. Соберите около 3 мл облачно интерфейс и передача новой 15 мл Конические трубки. После этого разбавьте смесь с 9 мл HBSS помощи удаления градиента плотности среды.
  8. Центрифуга разреженных плотность градиента средних интерфаза, содержащие мононуклеарных клеток на 500 g x 5 мин аспирационная супернатант и Ресуспензируйте с 1 мл среднего роста (DMEM дополнена 10% плода bovine сыворотки и 1% антибиотиков). После этого краситель ресуспензированы клетки с Трипановый синий и выполнить подсчет клеток с помощью haemocytometer.

3. магнитные активированных клеток сортировка

Примечание: Эти шаги изменяются от производителей протокола.

  1. Центрифуга собранных мононуклеарных клеток на 300 g x 10 мин при 4 ° C для удаления среднего роста, как это будет вмешиваться с магнитной изоляцией. Использование же отсчет клетки, полученные из шаг 2.8, Ресуспензируйте 1 x 10-8 тому клеток/мл в PBS (++ Ca и Mg++ бесплатно) содержащие ЭДТА FBS и 1 мм 2%, в том диапазоне 0.1-2,5 мл.
  2. Добавьте полный объем ядерных клеток в PBS из предыдущего шага к трубе полистирольные круглые нижней свежий 5 мл (12 x 75 мм). Добавьте 50 мкл CD11b PE маркировки реагент на 1 мл образца. Инкубации при комнатной температуре в течение 15 мин, защищенном от света.
  3. Мкл 70 отбора коктейль (сочетание моноклональных антител против CD11b в PBS) в 1 мл образца. Инкубации при комнатной температуре в течение 15 мин, защищенном от света.
  4. Смешайте магнитные частицы, закупорить вверх и вниз более чем 5 раз. Добавьте 50 мкл/мл на образец. Инкубации при комнатной температуре в течение 10 мин, защищенном от света.
    Примечание: Эти частицы затем образуют комплекс tetrameric с антителами и будут привязываться к магнитной столбец.
  5. Если общий объем ячейки смесь менее чем 2,5 мл, сверху до этого тома с PBS (++ Ca и Mg++ бесплатно) содержащие ЭДТА FBS и 1 мм 2% и смешайте нежно закупорить 2 - 3 раза. Положите трубку (без крышки) в магнит и инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин.
  6. В одном непрерывном движении полностью Переверните магнит, содержащие трубки для 2-3 s, наливание покинуть супернатант. Возвращение магнит в вертикальном положении и извлеките трубку от магнита. Подготовка промыть остальные ячейки в столбце.
    Примечание: Супернатант содержит немаркированных и нежелательных клеток, которые удаляются путем инвертирования трубки еще в магнит. Трубка содержит вложенные Cd11b+ клеток.
  7. Вымойте клетки, повторив шаги 3.5 и 3.6 вдвое больше. Если образец имеет больше чем 1 мл, рекомендуется далее повторите шаги 3.5 и 3.6.
  8. Ресуспензируйте клеток в среде желаемого роста. Промойте стороны коллекции судна также (например. 15 мл) для сбора клеток от сторон трубки и увеличить урожайность.

4. Проверка чистоты Микроглия

Примечание: Основная микроглии, изолированных от 3 Л (n = 5 животных всего) были проверены через флуоресцентные активированных клеток, сортируя (FACS) для определения чистоты для представителя результаты.

  1. Культура клеток в T-25 колбу в среднего роста, содержащие 10% FBS в одночасье, посев на плотности 1-2 х 106 клеток за флакон.
  2. Вымыть клетки в T-25 колбы с PBS 3 x на 5 минут, чтобы удалить любые оставшиеся роста СМИ, которые могут помешать с trypsinization.
  3. Добавьте 2 мл 0,25% трипсина для отсоединения клетки из колбы. Убедитесь, что объем трипсин является достаточной для покрытия всей поверхности колбы. После нежной закрученного Фляга для обеспечения единообразного трипсина, инкубировать на 5 минут при 37 ° C.
  4. Утолить trypsinization процесс, добавив 2 мл питательных сред, содержащих 10% FBS в колбу.
  5. Соберите супернатанта, содержащий trypsinized клеток и центрифуги на 500 x g 5 минут при температуре 4 ° C для сбора клеток.
  6. Удалить супернатант, содержащий среднего роста и трипсина и Ресуспензируйте гранулы в 500 мкл буфера СУИМ. Выполнения подсчета клеток с помощью Трипановый синий.
  7. Центрифуга на 500 x g 5 мин при 4 ° C. Выполните Fc рецептор блок, добавляя 50 мкл буфера СУИМ + 1 мкл FcR блокиратор за 5 х 106 клеток. Инкубируйте 15 мин при 4 ° C.
    Примечание: Fc рецептор блок является важнейшим шагом в процедуре окрашивания для предотвращения привязки неспецифических иммуноглобулинов Fc рецепторов в популяции иммунных клеток. Эта блокада затрагивает не ниже по течению привязки других антител.
  8. Завершите процесс блокировки путем разбавления с 500 мкл буфера СУИМ. После этого центрифуга смеси, содержащие клетки на 500 g x 5 мин при 4 ° C.
  9. Ресуспензируйте свежие 500 мкл буфера СУИМ.
  10. Поместите в образец трубки большинство клеток (например если resuspending клетки в 500 мкл буфера СУИМ, использование 400 мкл). Распределить оставшиеся клетки среди управления трубы и топ до 100 мкл на управления трубки (например для 6 контроля труб, мириться 16,67 мкл в каждой управления трубки и топ с 83,33 мкл буфера FACS). Сделайте группы (управления трубы выделены жирным шрифтом), как Unstained, сингл Витражи (CD45, CD11b), единого жить/мертвые пятна, FMOs и образец трубки.
  11. Пелле клетки всех трубок центрифугированием на 500 g x 5 мин при 4 ° C.
  12. Пятно клетки в трубку с 1 мкл антител на 100 мкл буфера СУИМ за 5 х 106 клеток. Проинкубируйте втечение 20 мин при 4 ° C.
    Примечание: Используйте 50 мкл антител коктейль, если используются менее 2 х 106 клеток.
  13. Вымойте клетки с 500 мкл буфера СУИМ. Центрифуга клетки на 500 g x 5 мин при 4 ° C.
  14. Ресуспензируйте клетки в 300 мкл буфера СУИМ.
    Примечание: Используйте ~ 100 мкл, если меньше чем 2 x 106клеток.
  15. С помощью анализа цитометрия потоков, количественно клетки, которые CD45низкой и позитивным для CD11b окрашивания. Этот показатель соответствует изолированной первичного микроглии.

5. иммуногистохимическое окрашивание первичных Микроглия

  1. Пластина клетки в 96-луночных пластины на плотности 1 х 105 клеток с среднего роста и инкубировать на ночь.
  2. Удалить супернатант и мыть 3 раза с PBS.
  3. Исправить клетки с параформальдегида 4% в PBS на 15 мин удалить PFA с P1000 пипеткой, а затем вымыть их 3 раза с PBS + 0.1% тритон-X.
  4. Блок для неспецифической привязки с бычьим сывороточным альбумином 3% за 1 час при комнатной температуре.
  5. Проинкубируйте с кролик Iba-1 (1: 100) за 24 ч при 4 ° C. После этого снимите смесь основного антитела и мыть 3 раза с PBS.
  6. Проинкубируйте с вторичной конъюгат анти кролик GFP (1: 200) за 1 ч при комнатной температуре. После этого снимите смесь вторичного антитела и мыть 3 раза с PBS.
  7. Крепление слайды с флуоресцентных монтажа средних и захвата изображения с помощью флуоресцентный Микроскоп.

6. Количественная оценка микроглии с использованием pHrodo Assay

Примечание: PHrodo assay позволяет выявить уровень фагоцитоза в культивируемых клеток. После поглощения через эндоцитоза интернализации в более кислой среде увеличивает уровни флюоресценции bioparticle конъюгатов. Уровни флюоресценции затем может быть определена количественно, СУИМ. Следующие шаги изменяются от производителей протокола.

  1. Культура клетки в T-25 колбу в среднего роста в одночасье, посев на плотности 1-2 х 106 клеток за флакон. Вымойте клетки в T-25 колбы с PBS 3 раза за 5 мин.
  2. Отсоедините ячейки, используя 2 мл 0,25% трипсина. Инкубировать в течение 5 минут при 37 ° C.
  3. Утолить trypsinisation процесс, добавив 2 мл питательных сред, содержащих 10% FBS в колбу.
  4. Центрифуга суспензию клеток на 500 g x 5 мин при 4 ° C для пеллет клетки.
  5. Удалить супернатант и Ресуспензируйте пеллет, содержащий основной микроглии в питательной среды на 106 клеток/мл.
    Примечание: в качестве альтернативы, плита клетки в плиту 96-ну по крайней мере за день до и цель для 1 х 105 жизнеспособных клеток в колодец на тот день, когда проба должна выполняться.
  6. Плита клетки в 96-луночных пластины на 1 х 105 клеток/Ну, 100 мкл в колодец. Пластина управления и экспериментальной скважины в трех экземплярах и оставить один пустой колодец за положительный контроль для вычитание фона нет-ячейки.
  7. Добавьте 100 мкл роста средств массовой информации к скважинам, оставить пустым для вычитание фона без ячейки.
    Примечание: Как любой другой в vitro пробирного, соответствующие элементы управления имеют жизненно важное значение для точности показаний. Наряду с без ячейки управления (фон чтения), также включают в себя негативные управления хорошо (pHrodo конъюгата добавил, но помещен на льду).
  8. Крышка и инкубировать в течение 1 ч в инкубаторе с 5% CO2 при 37 ° C.
  9. Подготовка экспериментальной скважины путем добавления стимулятор и лечения. Добавьте элементы управления транспортного средства (только для СМИ роста) неочищенные скважин.
    Примечание: Липополисахарида 1 мкг/мл [стимулятор] и эпителиальных клеток человека амнион (hAEC)-кондиционером СМИ [лечения] были использованы для создания представительных результатов.
  10. Оттепель флакон конъюгированных красителя, добавить 2 мл поглощение буфер и кратко вихря. Перенесите содержимое трубки в чистой стеклянной трубки и sonicate за 5 минут, чтобы равномерно рассеяны частицы.
  11. Аспирационная питательной среды из микропланшетов скважин и быстро заменить 100 мкл суспензии красителей. Накрыть крышкой и инкубировать при 37 ° C в течение 1 ч.
    Примечание: Не забудьте пятно управления трубы также.
  12. С помощью анализа цитометрия потоков, количественно клетки, окрашивание позитивные для конъюгированных pHrodo бусы и представить в процентах (родительского) от активно phagocytosing микроглии.

7. Количественная оценка апоптоза микроглии после воспалительных оскорбление

  1. Повторите шаги 1-7 из раздела «Проверка микроглии чистоты».
  2. Поместите в образец трубки большинство клеток (например если вы высокомобильна клетки в 500 мкл буфера СУИМ, использование 400 мкл). Распределить оставшиеся клетки среди управления трубы и топ 100 мкл на управления трубки (например для трубки 6 управления, мириться 16,67 мкл в каждой управления трубки и топ с СУИМ 83,33 мкл буфера). Группы (управления трубы выделены жирным шрифтом): безупречная, одного пятна (AnnexinV, пропидий йодидом), Одноместный жить/мертвые пятна, FMOs, пробоотборные трубки.
  3. Пелле клетки все трубы центрифугированием на 500 g x 5 мин.
  4. Инкубировать 1 мкл антител/100 мкл СУИМ буфера/5 х 106 клеток для 20 мин при 4 ° C.
    Примечание: Используйте 50 мкл, если меньше чем 2 х 106 клеток.
  5. Вымойте клетки путем добавления 500 мкл буфера СУИМ и центрифуги на 500 g x 5 мин.
  6. Ресуспензируйте Пелле клеток в 300 мкл буфера СУИМ.
    Примечание: ~ 100 мкл, если меньше чем 2 x 106клеток.
  7. Подсчитать ячейки в течение каждого квадранта (Q1: некротические, Q2: поздно apoptotic, Q3: жизнеспособным, Q4: ранние apoptotic).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Используя методы, описанные здесь, чисто популяций микроглии могут быть изолированы и могут быть готовы для характеристик, используя in vitro и анализ СУИМ. С самого начала до 18 животных может использоваться за калл, с ожидаемой доходности примерно 450 000-600 000 Микроглии клеток. Важно, чтобы сначала подтвердить чистоту изолированных клеток, и сделать анализ СУИМ была выполнена путем пятнать для двух маркеров CD45 и CD11b. выявление микроглии может оказаться хлопотно, как мног...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Микроглии имеют способность быть про - и противовоспалительными, изменено на стимулы окружающей среды. Предыдущие исследования показали, что модуляции микроглии активации может придать нейропротекции. Их способность обеспечивать защиту нейронов и ремонт повреждений требует дополнительных исследований для дальнейшего нынешнего понимания этих сложных клеток. Таким образом изоляция высокой чистоты первичного микроглии является важным и полезным техника. Это сравнительно быстрый метод для получения чистой первичной микроглии...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEM, низкий уровень глюкозы, пируватGibco11885084
антибиотик-антимикотик (100X)Gibco15240062
DNaseI степени II степени из поджелудочной железы крупного рогатого скотаSigma-Aldrich10104159001
папаин из латекса папайи, буферный водный растворSigma-AldrichP3125-100mg
Фетальная бычья сыворотка, квалифицированная, инактивированная при нагреванииGibco16140071
PercollGE Healthcare17-0891-01
Сбалансированный солевой раствор Хэнка (1X)Gibco14175-103
Сбалансированный солевой раствор Хэнка (10X)Gibco14185052
EasySep Mouse CD11b Набор для положительного отбораStemCell Technologies18770Вариант магнита
EasySepEasySep магнитStemCell Technologies18000
EasySep BufferStemCell Technologies20144
Фосфат Dulbecco буферизованный физиологический растворGibco14040182
трипсином (2,5%) (10X)Gibco15090-046
Очищенный крысиный анти-мышь CD16/CD32 (мышь BD Fc Block™)BD Biosciences553141
Falcon 5 мл Пробирка из полипропилена с круглым дном и высокой прозрачностью, с защелкивающейся крышкой, стерильнаяCorning175
см и 2; Колба для культивирования клеток с угловым горлышком и вентиляционной крышкойCorning431080
Липополисахариды из Escherichia coli O127:B8Sigma-AldrichL5024
96 лунок TC-обработанные микропланшеты размер 96 лунок, прозрачные, полистирол, круглое дноCorningCLS3799
параформальдегид (порошок, 95%)Sigma-Aldrich158127
Triton-XSigma-AldrichX100
Rabbit Anti-Iba1Wako01919741 
Козий антикролик IgG H& L (Alexa Fluor 488)Abcamab150077
FACS Антитела<strong>CompanyКаталожный номер
V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUOBD Biosciences560501
PerCP-Cy5.5 CD11b eBiosciences45-0112-82
ZombieNIRBiolegend423105
pHrodo Red E. coli BioParticles ConjugateThermo Fisher ScientificP35361
Annexin.V_FITCMiltenyi Biotech130-093-060
Propodium Iodide solutionMiltenyi Biotech130-093-233
352063

Ссылки

  1. Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report). Lancet Neurology. 8 (1), 110(2009).
  2. Saliba, E., Henrot, A. Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage. Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).
  3. Uwe-Karsten, H., Helmut, K. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nature Neuroscience. 10 (11), 1387(2007).
  4. Cherry, J. D., Olschowka, J. A., O'Banion, M. K. Neuroinflammation and M2 microglia: the good, the bad, and the inflamed. Journal of neuroinflammation. 11, 98(2014).
  5. Michell-Robinson, M. A., et al. Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair. Brain. 138 (5), 1138-1159 (2015).
  6. Guohua, W., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics in white matter after traumatic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1864(2013).
  7. Neumann, H., Kotter, M. R., Franklin, R. J. M. Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration. Brain. 132 (2), 288-295 (2009).
  8. Veronique, E. M., et al. M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nature Neuroscience. 16 (9), 1211(2013).
  9. Hu, X., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics reveal novel mechanism of injury expansion after focal cerebral ischemia. Stroke. 43 (11), 3063(2012).
  10. Kigerl, K. A., et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (43), 13435(2009).
  11. Suzuki, T. Microglial α7 nicotinic acetylcholine receptors drive a phospholipase C/IP3 pathway and modulate the cell activation toward a neuroprotective role. Journal of neuroscience research. 83, (2006).
  12. Bedi, S. S. Intravenous multipotent adult progenitor cell therapy attenuates activated microglial/macrophage response and improves spatial learning after traumatic brain injury. Stem cells translational medicine. 2, (2013).
  13. Tran, T. A., McCoy, M. K., Sporn, M. B., Tansey, M. G. The synthetic triterpenoid CDDO-methyl ester modulates microglial activities, inhibits TNF production, and provides dopaminergic neuroprotection. Journal of neuroinflammation. 5, 14(2008).
  14. Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A (7), 643-647 (2010).
  15. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147-147 (2012).
  16. Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel Applications of Magnetic Cell Sorting to Analyze Cell-Type Specific Gene and Protein Expression in the Central Nervous System. PLOS ONE. 11 (2), e0150290(2016).
  17. Leaw, B., et al. Human amnion epithelial cells rescue cell death via immunomodulation of microglia in a mouse model of perinatal brain injury. Stem cell research & therapy. 8 (1), 46(2017).
  18. Moujalled, D., et al. TDP-43 mutations causing amyotrophic lateral sclerosis are associated with altered expression of RNA-binding protein hnRNP K and affect the Nrf2 antioxidant pathway. Human Molecular Genetics. 26 (9), 1732-1746 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Изоляция микроглиимагнитная сепарацияградиент Percollподсчет клетококрашивание трипановым синиммаркировка CD11bанализ с помощью гемоцитометранаслоение Percoll
Характеристика и изоляция первичной микроглии мыши по плотности градиентного центрифугирования
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.