Характеристика и изоляция первичной микроглии мыши по плотности градиентного центрифугирования

Summary

Протокол для изоляции первичных микроглии из мышиных мозги представлены. Этот метод помогает в углублении нынешнего понимания Неврологические заболевания. Плотность градиентного центрифугирования и магнитной сепарации объединяются для получения достаточного урожая высоки чисто образца. Кроме того мы наметим шаги для характеризации микроглии.

Abstract

Микроглии, резидентов иммунные клетки в головном мозге, являются первыми реагируют воспаление или травмы в центральной нервной системе. Недавние исследования показали микроглии быть динамичной, способны взять на себя про воспалительных и противовоспалительным фенотипов. (Про воспалительных) М1 и м2 (pro репаративной) фенотипов играть важную роль в neuroinflammatory условиях, таких как перинатальной черепно-мозговой травмы и выставка различные функции в ответ на определенные экологические стимулы. Модуляция микроглии активации было отмечено придать нейропротекции, таким образом предлагая микроглии может иметь терапевтический потенциал в черепно-мозговой травмы. Однако дополнительные исследования необходимо лучше понять роль микроглии в болезни, и этот протокол облегчает что. Протокол описанных ниже сочетает плотность градиентного центрифугирования процесс уменьшения сотовой мусора, с магнитной сепарации, производить очень чистый образец первичных Микроглии клеток, которые могут использоваться для экспериментов в пробирке , без потребность в 2-3 недели культивирования. Кроме того характеристика шаги дают надежные функциональные данные о микроглии, пособничество исследования для улучшения нашего понимания поляризации и грунтовки этих клеток, которая имеет серьезные последствия в области регенеративной медицины.

Introduction

Ущерб, приобретенные в перинатальный период от воспаления, гипоксическая ишемия и кровотечение может иметь массив долгосрочных осложнений. Привлечь воспаления и ишемии с последовавшей смерти нейронов и аксональной¹предположил комплекс патофизиологии перинатальной черепно-мозговой травмы. Врожденный иммунный ответ играет важную роль в каскад событий, приведших к травмы².

Микроглии, резидентов иммунные клетки в пределах центральной нервной системы (ЦНС), являются первыми реагируют на травмы³. Микроглии являются типы пластиковых клеток с способность быть защитные или токси....

Protocol

Следующие процедуры были одобрены Комитет этики животных университета Монаш. C57Bl6/J P3-6 здорового без лечения новорожденных мышей были использованы для создания представительных результатов.

1. ферментативный пищеварения

Примечание: Важно рассмотреть стерильности при изоляции и культивирования клеток первичной. Хотя обеспечение окружающей среды является стерильной, насколько это возможно, первоначальных диссекции и урожай мышиных мозги может комплектоваться вне капотом Ламинальный потока, все последующие шаги, выполняемые в рамках Ламинарный шкаф.

1. С помощью стерильных инструментов, усыпить мыши на ше....

Results

Используя методы, описанные здесь, чисто популяций микроглии могут быть изолированы и могут быть готовы для характеристик, используя in vitro и анализ СУИМ. С самого начала до 18 животных может использоваться за калл, с ожидаемой доходности примерно 450 000-600 000 Микроглии клеток. Важно, чтобы сначала подтвердить чистоту изолированных клеток, и сделать анализ СУИМ была выполнена путем пятнать для двух маркеров CD45 и CD11b. выявление микроглии может оказаться хлопотно, как мног.......

Discussion

Микроглии имеют способность быть про - и противовоспалительными, изменено на стимулы окружающей среды. Предыдущие исследования показали, что модуляции микроглии активации может придать нейропротекции. Их способность обеспечивать защиту нейронов и ремонт повреждений требует дополнительных исследований для дальнейшего нынешнего понимания этих сложных клеток. Таким образом изоляция высокой чистоты первичного микроглии является важным и полезным техника. Это сравнительно быстрый метод для получения чистой первичной микроглии.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM, низкий уровень глюкозы, пируват	Gibco	11885084
антибиотик-антимикотик (100X)	Gibco	15240062
DNaseI степени II степени из поджелудочной железы крупного рогатого скота	Sigma-Aldrich	10104159001
папаин из латекса папайи, буферный водный раствор	Sigma-Aldrich	P3125-100mg
Фетальная бычья сыворотка, квалифицированная, инактивированная при нагревании	Gibco	16140071
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Сбалансированный солевой раствор Хэнка (1X)	Gibco	14175-103
Сбалансированный солевой раствор Хэнка (10X)	Gibco	14185052
EasySep Mouse CD11b Набор для положительного отбора	StemCell Technologies	18770	Вариант магнита
EasySepEasySep магнит	StemCell Technologies	18000
EasySep Buffer	StemCell Technologies	20144
Фосфат Dulbecco буферизованный физиологический раствор	Gibco	14040182
трипсином (2,5%) (10X)	Gibco	15090-046
Очищенный крысиный анти-мышь CD16/CD32 (мышь BD Fc Block™)	BD Biosciences	553141
Falcon 5 мл Пробирка из полипропилена с круглым дном и высокой прозрачностью, с защелкивающейся крышкой, стерильная	Corning	175
см и 2; Колба для культивирования клеток с угловым горлышком и вентиляционной крышкой	Corning	431080
Липополисахариды из Escherichia coli O127:B8	Sigma-Aldrich	L5024
96 лунок TC-обработанные микропланшеты размер 96 лунок, прозрачные, полистирол, круглое дно	Corning	CLS3799
параформальдегид (порошок, 95%)	Sigma-Aldrich	158127
Triton-X	Sigma-Aldrich	X100
Rabbit Anti-Iba1	Wako	01919741
Козий антикролик IgG H& L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077
FACS Антитела<	strong>Company	Каталожный номер
V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO	BD Biosciences	560501
PerCP-Cy5.5 CD11b	eBiosciences	45-0112-82
ZombieNIR	Biolegend	423105
pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate	Thermo Fisher Scientific	P35361
Annexin.V_FITC	Miltenyi Biotech	130-093-060
Propodium Iodide solution	Miltenyi Biotech	130-093-233