Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Микро рассечение эмаль органа от нижней челюсти резцы крыс воздействию экологических токсикантов

10.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57081

⸱

29 марта 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Institut National de la Santé et Recherche Médicale (INSERM) UMRS 1138, Paris-Diderot University, Pierre & Marie Curie University, Paris-Descartes University, Laboratory of Molecular Oral Pathophysiology, Cordeliers Research Centre, 2Unit of Formation and Research (UFR) of Odontology, Paris-Diderot University

В этой статье

Краткое содержание

Понимание формирования и возможных изменений эмали требует изучения ameloblast деятельности. Здесь мы описываем надежного и последовательного метода микро-вскрыть эмаль органов, содержащие ameloblasts стадии секреции и созревания, которые могут быть использованы для дальнейших количественных и качественных экспериментальных процедур.

Аннотация

Дефекты эмали, вытекающие из условий окружающей среды и образа жизни являются проблемы общественного здравоохранения из-за их высокой распространенности. Эти дефекты в результате измененный активность клеток, ответственных за эмаль синтеза, названный ameloblasts, который присутствует в эмаль органа. Во время Амелогенез ameloblasts следовать конкретные и точные последовательности событий распространения, дифференциация и смерти. Крыса, постоянно растущих резцов является подходящей Экспериментальная модель для изучения ameloblast активности и дифференциации этапов в физиологических и патологических условиях. Здесь мы описываем надежного и последовательного метода микро-вскрыть эмаль орган крыс воздействию экологических токсикантов. Микро расчлененный Стоматологическая эпителия содержат секрецию и созревания этап ameloblasts, который может использоваться для качественной экспериментов, например иммуногистохимия анализов и в situ гибридизация, а также для количественного анализа, такие как RT-ПЦР РНК seq и Западный blotting.

Введение

Многие дефекты развития эмали может быть результатом воздействия экологических токсикантов и/или ненадлежащее life-style1,2,3,4. Характеристика срыва мероприятий и молекулы Амелогенез используя настоящее время описанная процедура будет содействовать использованию результирующей дефектов эмали как ранних маркеров воздействия ряда токсикантов и может помочь восстановить историю здоровья Каждый пациент в перинатальный период, когда эмаль синтезированный1,2. Синтез эмаль можно разделить на четыре основных этапа в зависимости от ameloblast деятельности5. Первый шаг объединяет клеток и pre-ameloblast распространения прекурсоров. На втором шаге дифференцированных ameloblasts выделяют эмаль матрицы белки (ИПК), главным образом amelogenin, enamelin и ameloblastin, которые определяют толщину окончательного эмали. Таким образом любое нарушение синтеза EMP приводит к количественным дефекты эмали. После осаждения Толщина полной эмали начинается этап созревания. На этом этапе апатита роста кристаллитов в ширины и толщины позволяет эмали для достижения высокой минерализации соотношение в биологической ткани, до 96% по весу. Нарушая события, которые происходят во время созревания этап приведет к качественным эмаль дефектов. Наконец ameloblasts вступит в фазу после созревания, также называется пигментации на грызунов и проходят apoptosis во время извержения зуба, делая дефектов эмали (если таковые имеются), необратимого и непоправимого, таким образом дефекты обеспечивают потенциальным ретроспективный запись ameloblast подчеркивает. Грызунов Амелогенез следующим же последовательность событий с особенностью, что их резцов непрерывно растет, что делает их подходящую модель для изучения общего процесса Амелогенез. Таким образом любое нарушение Амелогенез приводит изменений эмали качество или количество, в зависимости от окна времени нарушения события. В этом смысле воздействием диоксинов, свинец и эндокринные нарушения химических веществ (ЭЭС) как бисфенол А (BPA), генистеин и винклозолин, было показано, чтобы генерировать эмаль hypomineralizations1,2,3 ,6,,78. Асимметричная белый непрозрачный пятна были определены на резцы у крыс, получавших дозу BPA низкой дозы во время периода плода и в первый месяц после рождения1. Эти дефекты эмали у крыс и те из человека Молярная резца hypomineralization (MIH), имеют аналогичные структурные, клинические и биохимические характеристики. MIH-патология недавно описан зубной эмали, для которой этиологии по-прежнему остается неясным9,10 несмотря на множество причинных факторов была гипотеза9,10,11 ,12.

Еще один важный эмаль hypomineralization патологии из-за экологических факторов является флюороз (DF), который является следствием чрезмерного фторид поглощения (> 0,1 мг/кг/день)13,14. Основным источником Фтор является питьевая вода, которая дополняет или естественно обогащенного фторидами. Фторид также часто прописывают для предотвращения кариеса, но профилактическая доза составляет лишь 50% ниже, чем токсичные один (≤0.05 мг/кг/день). МИ и DF, два частые патологий, в результате воздействия факторов окружающей среды, могут представлять общие черты, которые должны квалифицироваться в результате потенцирования эффектов hypomineralizing фтора в сочетании с другими токсикантов например ЭЭС2 или амоксициллин15.

Микро рассечение крыса эмаль органа, содержащие ameloblasts на дифференциации различных стадиях поможет понять механизм действия молекул может нарушить деятельность ameloblast и вызвать дефекты эмали для постановки диагноза после извержения зуба. Иными словами характеристика изменения состава эмали ген выражение и эмаль матрицы из-за экологических токсикантов позволяет воссоздание истории воздействием токсикантов и облегчает мониторинг экологической безопасности для общественности здоровья.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все животные, используемые в настоящем исследовании были сохранены в соответствии с руководящими принципами для ухода и использования лабораторных животных от французского министерства сельского хозяйства (A-75-06-12).

1. животных воздействием токсикантов

  1. Перед выполнением этого протокола, получить необходимые институциональные одобрение и обязательно соблюдать все правила ухода за животными.
  2. Применить дизайн исследовательский протокол, позволяющий Конституции различных экспериментальных групп для того, чтобы проверить влияние molecule(s) на ameloblast секреции стадии и стадии созревания ameloblast. Здесь в зависимости от их воздействия фторид (NaF) в сочетании или не с BPA (рис. 1A)2были созданы четыре группы самцов крыс Wistar. Все животные были наблюдается и расчленены на день 65 (рис. 1B).

2. рассечение Hemi мандибулы от взрослых крыс

  1. Усыпить крыс CO2 удушение, при необходимости сопровождаемое обезглавливание в отдельном голову от остальной части тела. Разоблачить крысы CO2 для 5 минут в Специальный ящик16.
  2. Удалите все кожу от нижней губы, с помощью скальпеля #11 для того, чтобы получить легкий доступ к нижних резцов.
  3. С же скальпель надрезают между двух нижних резцов с небольшим давлением и нижней челюсти будет разделен на две половинки.
  4. Височной нижнечелюстной совместное с помощью скальпеля для отсоединения челюсти, удержания и отрезания пленки hemi челюсти с помощью пинцета, штраф.
  5. Вырезать окружающих мягких тканей с помощью скальпеля и удалить все мышцы, сухожилия и связки, скребком, до тех пор, пока кости совершенно чистой.

3. изоляция резца17,18

  1. Тщательно сбрить кости, поместив лезвия параллельно основной продольной оси резца. Начало в костлявые хребта возле советы резца (проксимальный конец) до конца резца возле шейки матки цикла. Разрез движения исходит из проксимальных в дистальном направлении.
  2. Сделать первый разрез дистально в шейки матки цикл с скальпеля для удаления gonion hemi челюсти и разрешение на взлет резца легко без повреждения шейки матки цикла или стадии секреторного ameloblasts (красная линия на рис. 2).
  3. Сделать второй сократить ниже второй молярной и вставьте скальпель между костью и медиальной поверхности резцов. Когда поднимается базальная кость, поверните наружу резца и снять его тщательно избегать эмаль ткани органов ослабить с помощью тонкой пинцета.

4. микро рассечение эмаль органа под объектив бинокля

  1. Падение 200 мкл физиологическим фосфатного буфера (PBS 1 X) на резец, с помощью пипетки. Возьмите резца с тонкой пинцет с лабиальной поверхности, обращенной вверх. Сделайте скальпель Марк между бесцветные и оранжевый частями ткани. Этот знак соответствует базовой белое пятно, который наблюдается после (рис. 2).
  2. Царапина, экскаватор или эквивалентные средства, клеточной поверхности от Марк скальпель в верхушечный конец соответствующий секрецию ameloblasts этап (бесцветный) и от Марк скальпель на кончик резца для созревания этап (оранжевый) ameloblasts.
  3. Удаление ткани 2-мм соответствует переходной стадии, как ранее описанных19. Не открывайте резца во время эмаль орган рассечение избежать загрязнения, мезенхимы.
  4. Вырежьте шейки матки цикла, расположенный сразу в апикальной части резца (рис. 2) как описано выше20.
  5. Соберите его в 10% растворе формалина или лизиса для дальнейшего расследования (см. Таблицу материалы).

5. коллекция тканей органа разлученных эмаль для дальнейшего расследования

  1. Капля 200 мкл буфера PBS 1 X на резца.
  2. С лезвием скальпеля #11 Аккуратно отсоедините Стоматологическая эпителиальные клетки постепенно в буфере, отдельно, для каждого этапа с помощью скальпеля марки, сделанные ранее.
  3. Для ячейки РНК и белков извлечений Положите ткани в лизис решение, которое позволяет извлечения белков и РНК (см. Таблицу материалы).
    Примечание: Подготовьте высокого качества РНК, повернув ткани экскаватор в трубе и затем измельчения клетки до получения однородной смеси. Смесь готова к РНК и белков извлечений согласно процедуре производителя, который был ранее описанных2,8,17. Обычно, около 5-10 мкг всего 150 мкг всего белков и РНК были получены для каждого приготовления.
  4. Для гистологического анализа иммуногистохимия (IHC) и в situ гибридизация (ISH), наносят слой клеток в формалина 10% за 2 ч, затем хранить при 4 ° C в PBS 1 X. Ткани затем можно внедрить в воск/парафин или ткани OCT для замороженных секций.
  5. Для извлечения EMP принимайте резца с тонкой пинцетом. После короткого воздействия воздуха (небольшое обезвоживание) белое пятно будет отображаться вокруг средней части лабиальной поверхности резцов, который представляет начало минерализации эмали. Это белое пятно соответствует переход- / раннего созревания этап ameloblasts, так что используйте его как индикатор для извлечения EMPs21.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Многие эмаль дефекты, такие как флюороз12,13, могут в результате экологических условий вследствие чрезмерного фторид поглощения или эмали похож на MIH вследствие воздействия на некоторые ЭЭС1, hypomineralization 7,22. Эти дефекты развития эмали может быть экспериментально воспроизведена на крысах (рис. 1)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Изменены ameloblast деятельности и/или нарушается ameloblast распространения, дифференцировки и созревания процессы привести к необратимым эмаль дефекты и, в свою очередь, характеристика дефектов эмали может помочь развить понимание изменены ameloblast деятельность во время Амелогенез. Таким образом исследования на изолированные эмалью органа являются определяющим для выяснения патологические события, приведшие к эмали дефекты независимо от их происхождения, экологические или генетические.

Эта...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.

Благодарности

Эта работа финансировалась университета Париж-Diderot, французский Национальный институт здравоохранения и медицинских исследований (INSERM) и французский институт одонтологического характера исследований (ИФРО).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Бисфенол АСигма Олдрич, Сент-Луис Миссури239658
формалин 10%Сигма-Олдрич, Сент-Луис, МиссуриHT5012
Три-реагентEuromedex, ФранцияTR118
RLT буферQiagen, Les Ulis, Франция74126RNeasy Protect Mini Kit
Антитело к андрогенному рецепторуSanta Cruz Biotechnology, Санта Круз, Калифорния)sc-816кроличье поликлональное антитело
PBS 10xEUOMEDEXET330. Фторид
натрия (NaF)Sigma-Aldrich, Сент-Луис, MOS-1504
парапласт обычныйLeica microsystems, Nanterre cedex,  Франция39601006называется was/parafin in text
tissue OCTVWR, Fontenay-sous-Bois, France411243
Extra Fine Bonn Scissors - Straight/8.5 cmPHYMEP , Париж, Франция14084-08
Ручка для скальпелевых лезвий - 12.5 смPHYMEP, Париж, Франция10035-12
Изогнутое лезвие скальпеляPHYMEP , Париж, Франция10035-20
Нож для препарирования - с тонким/прямым наконечникомPHYMEP, Париж, Франция10055-12
круглый ножPHYMEP, Париж, Франция10059-15
лезвия скальпеля n° 11 Swann-MortonVWR, Фонтене-су-Буа, Франция233-0024
бинокулярный объективLeica biosystems, Нантер cedex,  ФранцияMZFLIII

Ссылки

  1. Jedeon, K., et al. Enamel defects reflect perinatal exposure to bisphenol A. Am J Pathol. 183, 108-118 (2013).
  2. Jedeon, K., et al. Chronic Exposure to Bisphenol a Exacerbates Dental Fluorosis in Growing Rats. J Bone Miner Res. 31, 1955-1966 (2016).
  3. Alaluusua, S., et al. Developmental dental aberrations after the dioxin accident in Seveso. Environ Health Perspect. 112, 1313-1318 (2004).
  4. Chapple, I. L., et al. Interaction of lifestyle, behaviour or systemic diseases with dental caries and periodontal diseases: consensus report of group 2 of the joint EFP/ORCA workshop on the boundaries between caries and periodontal diseases. J Clin Periodontol. 44, S39-S51 (2017).
  5. Nanci, A. Enamel: Composition, Formation, and Structure. Ten Cate's Oral Histology Development, Structure, and Function. , 8th ed, Elsevier mosby. 122-164 (2012).
  6. Leite, G. A., Sawan, R. M., Teofilo, J. M., Porto, I. M., Sousa, F. B., Gerlach, R. F. Exposure to lead exacerbates dental fluorosis. Arch Oral Biol. 56, 695-702 (2011).
  7. Jedeon, K., et al. Enamel hypomineralization due to endocrine disruptors. Connect Tiss Res. 55, 1-5 (2014).
  8. Jedeon, K., et al. Androgen receptor involvement in rat amelogenesis: an additional way for endocrine disrupting chemicals to affect enamel synthesis. Endocrinology. 157, 4287-4296 (2016).
  9. Weerheijm, K. L., Jalevik, B., Alaluusua, S. Molar-incisor hypomineralisation. Caries Res. 35, 390-391 (2001).
  10. Jälevik, B. Prevalence and Diagnosis of Molar-Incisor- Hypomineralisation (MIH): A systematic review. Eur Arch Paediatr Dent. 11, 59-64 (2010).
  11. Alaluusua, S. Aetiology of Molar-Incisor Hypomineralisation: A systematic review. Eur Arch Paediatr Dent. 11, 53-58 (2010).
  12. Jedeon, K., Berdal, A., Babajko, S. The tooth, target organ of Bisphenol A, could be used as a biomarker of exposure to this agent. Bisphenol A: Sources, Risks of Environmental Exposure and Human Health Effects. Gibert, Y. , Nova Science Publishers. 205-225 (2015).
  13. Fejerskov, O., Larsen, M. J., Richards, A., Baelum, V. Dental tissue effects of fluoride. Adv Dent Res. 8, 15-31 (1994).
  14. Robinson, C., Connell, S., Kirkham, J., Brookes, S. J., Shore, R. C., Smith, A. M. The effect of fluoride on the developing tooth. Caries Res. 38, 268-276 (2004).
  15. Sahlberg, C., Pavlic, A., Ess, A., Lukinmaa, P. L., Salmela, E., Alaluusua, S. Combined effect of amoxicillin and sodium fluoride on the structure of developing mouse enamel in vitro. Arch Oral Biol. 58, 1155-1164 (2013).
  16. Pritchett-Corning, K. R. Euthanasia of neonatal rats with carbon dioxide. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48, 23-27 (2009).
  17. Hiller, C. R., Robinson, C., Weatherell, J. A. Variations in the composition of developing rat incisor enamel. Calcif Tissue Res. 18, 1-12 (1975).
  18. Robinson, C., Kirkham, J., Nutman, C. A. Relationship between enamel formation and eruption rate in rat mandibular incisors. Cell Tissue Res. 254, 655-658 (1988).
  19. Smith, C. E., Nanci, A. A method for sampling the stages of amelogenesis on mandibular rat incisors using the molars as a reference for dissection. Anat Rec. 225, 257-266 (1989).
  20. Chavez, M. G., et al. Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor. J Vis Exp. (87), (2014).
  21. Brookes, S. J., Kingswell, N. J., Barron, M. J., Dixon, M. J., Kirkham, J. Is the 32-kDa fragment the functional enamelin unit in all species? Eur J Oral Sci. 119, 345-350 (2011).
  22. Babajko, S., Jedeon, K., Houari, S., Loiodice, S., Berdal, A. Disruption of Steroid Axis, a New Paradigm for Molar Incisor Hypomineralization (MIH). Front Physiol. 8, 343(2017).
  23. Houari, S., et al. Asporin and the mineralization process in fluoride-treated rats. J Bone Min Res. 29, 1446-1455 (2014).
  24. Denbesten, P., Li, W. Chronic fluoride toxicity: dental fluorosis. Monographs in oral science. 22, 81-96 (2011).
  25. Kirkham, J., Robinson, C., Phull, J. K., Shore, R. C., Moxham, B. J., Berkovitz, B. K. The effect of rate of eruption on periodontal ligament glycosylaminoglycan content and enamel formation in the rat incisor. Cell Tissue Res. 274, 413-419 (1993).
  26. Lacruz, R. S., et al. Identification of novel candidate genes involved in mineralization of dental enamel by genome-wide transcript profiling. J Cell Physiol. 227, 2264-2275 (2012).
  27. Wen, X., Paine, M. L. Iron deposition and ferritin heavy chain (Fth) localization in rodent teeth. BMC research notes. 6, 1(2013).
  28. Houari, S., Loiodice, S., Jedeon, K., Berdal, A., Babajko, S. Expression of Steroid Receptors in Ameloblasts during Amelogenesis in Rat Incisors. Front Physiol. 7, 503(2016).
  29. Kawano, S., et al. Establishment of dental epithelial cell line (HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling pathway. Connect Tissue Res. 43, 409-412 (2002).
  30. Zhou, Y. L., Snead, M. L. Identification of CCAAT/enhancer-binding protein alpha as a transactivator of the mouse amelogenin gene. J Biol Chem. 275, 12273-12280 (2000).
  31. Nakata, A., et al. Establishment and characterization of a spontaneously immortalized mouse ameloblast-lineage cell line. Biochem Biophys Res Commun. 308, 834-839 (2003).
  32. Harada, H., et al. Establishment of ameloblastoma cell line, AM-1. Journal of oral pathology & medicine: official publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 27, 207-212 (1998).
  33. Jussila, M., Thesleff, I. Signaling networks regulating tooth organogenesis and regeneration, and the specification of dental mesenchymal and epithelial cell lineages. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, a008425(2012).
  34. Tucker, A., Sharpe, P. The cutting-edge of mammalian development; how the embryo makes teeth. Nat Rev Genet. 5, 499-508 (2004).
  35. Vos, T., et al. Years lived with disability (YLDs) for 1160 sequelae of 289 diseases and injuries 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2163-2196 (2012).
  36. Marcenes, W., et al. Global burden of oral conditions in 1990-2010: a systematic analysis. J Dent Res. 92, 592-597 (2013).
  37. National Institute of Dental and Craniofacial Research. Dental Caries (Tooth Decay) in Adults (Age 20 to 64). , Available from: https://www.nidcr.nih.gov/DataStatistics/FindDataByTopic/DentalCaries/DentalCariesAdults20to64.htm (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Микродиссекция эмалевого органаизоляция резца крысыразделение стадий развития амелобластовамелобласты стадии секрецииамелобласты стадии созреванияиммуногистохимический анализпротокол экстракции РНКанализ методом вестерн-блоттингавоздействие Бисфенола А с фторомокрашивание по Массону (трихромное окрашивание)
Микро рассечение эмаль органа от нижней челюсти резцы крыс воздействию экологических токсикантов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.