Method Article

Метод эффективного складывая и очистки Хеморецепция лигандом привязки домена

DOI:

10.3791/57092

⸱

December 12th, 2017

 , 
1Infection and Immunity Program, Monash Biomedicine Discovery Institute, 2Department of Microbiology, Monash University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Процедура представлен складывая dCACHE периплазматическое лигандом привязки области Campylobacter jejuni Хеморецепция Tlp3 от включения органов и очистки приносить миллиграмм количества белка.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Идентификация природных лигандов хеморецепторы и структурных исследований, направленных на выяснение молекулярные основы лигандом специфики может быть значительно облегчено производства количествах миллиграмм чистой, сложить лигандом связывания доменов. Попытки участием Экспресс периплазматическое лигандом связывания доменов бактериальной хеморецепторов в Escherichia coli (E. coli) часто привести их ориентации в включение тела. Здесь для восстановления белка от включения органов, складывая и очистки, используя домен привязки лигандом периплазматическое dCACHE Campylobacter jejuni (C. jejuni) Хеморецепция Tlp3 качестве примера представлен метод. Этот подход включает в себя выражение протеина интереса с горные его6-тег, изоляции и мочевина опосредованной solubilisation включения органов, белка, складывая мочевины истощения, и очистки с помощью аффинной хроматографии, Затем тег удаления и размер исключения хроматографии. Спектроскопия круговой дихроизма используется для подтверждения сложенном состоянии чистого белка. Было продемонстрировано, что этот протокол является обычно полезно для производства количествах миллиграмм dCACHE периплазматическое лигандом связывания доменов других бактериальная хеморецепторов в виде растворимых и кристаллизирующихся.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Было показано, что хемотаксис и моторики играют важную роль в патогенезе Campylobacter jejuni , содействуя бактериальной колонизации и вторжения в узел1,2,3. Хемотаксис позволяет бактерии продвигаться к оптимальной среды для роста, как руководствоваться химические сигналы. Этот процесс предполагает признание внутриклеточные и экологических химические сигналы набор белков, называемых хеморецепторы, или датчика подобных белков (ПСТЛ). Большинство хеморецепторов являются белками мембраны встроенный с extracytoplasmic лигандом привязки домена (ОДД), трансмембранных доменов и цитоплазматических сигнализации домена, последний из которых взаимодействует с цитозольной сигнальных белков, которые передают сигнал flagellar моторы4,5,6,7.

Одиннадцать различных хеморецепторов были определены в геном C. jejuni ,4,,8. На сегодняшний день, только некоторые из этих хеморецепторов характеризовали и специфика лигандом Tlp19Tlp310,11, Tlp411, Tlp712и Tlp1113 известен. Идентификация природных лигандов оставшиеся хеморецепторов в этой породы, и многочисленные хеморецепторов в других бактерий, может быть существенно облегчено производство рекомбинантных Хеморецепция складывается и высоки чисто LBDs14, 15 , 16. Однако попытки участием Экспресс периплазматическое LBDs бактериальной хеморецепторов в Escherichia coli часто приводить их ориентации на включение органов17,18,19 . Тем не менее это явление может облегчить легко изоляции и восстановления белка в руке. Здесь для восстановления белка от включения органов, складывая и очистки, используя периплазматическое LBD C. jejuni Хеморецепция Tlp3 качестве примера представлен метод. Этот пример был выбран потому, что Tlp3-LBD принадлежит dCACHE семьи20 зондирования доменов, которые обильно нашли в двухкомпонентных гистидина киназы и хеморецепторов в прокариотах20,21, 22 , 23.

В этом подходе, конструкции выражения, основанные на pET151/D-TOPO вектор, был разработан для включения N-терминальный его6-тега, после чего табак etch вирус (TEV) протеазы расщепления сайта, для последующего тег удаления19. Протокол описывает гиперэкспрессия белка в E. coli, изоляции и мочевина опосредованной solubilisation включения органов, и белок, складывая мочевины истощения. После складывая, образец очищается хромотографией сродства с необязательный тег удаления и размер исключения хроматографии. Сложенном состоянии очищенный протеин подтверждается с помощью круговой дихроизма спектроскопии. Это измененная версия метода, который был ранее разработан чтобы восстановить и очистить LBD различных Хеморецепция, Helicobacter pylori TlpC19. Эта процедура, резюмируется в Рисунок 1, дает 10-20 мг чистого, без тегов Tlp3-LBD на 1 Л бактериальной культуры, с чистотой белка > 90% по оценкам SDS-PAGE.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. выражение его6-Tlp3-LBD в E. coli

  1. Прививать 150 мл стерильного Бертани Лурия (LB) бульон, содержащий ампициллина-1 мл 50 мкг с BL21-Codon-плюс (DE3) - RIPL клеток превращается с pET151/D-TOPO вектор для выражения его6- Tlp3-LBD (аминокислотных остатков 42-291), и Проинкубируйте ее при 37 ° C в шейкере (Диаметр орбиты, 25 мм) с 200 rpm на ночь.
  2. Подготовьте шесть колбы Эрленмейер 2 Л, содержащий 800 мл стерильного LB отвара и ампициллин-1 мл 50 мкг. Прививать каждый флакон с 20 мл на ночь культуры, полученные из шага 1.1. Инкубируйте их при 37 ° C с непрерывной тряски на 200 об/мин до оптической плотности на 600 Нм достигает 0,6.
  3. Возьмите 1 мл аликвота от одного из фляги (uninduced управления образец), Пелле, используя настольная центрифуга (13000 x g, 4 ° C, 10 мин) и удалить супернатант. Храните бактериальных гранул при-20 ° C для последующего анализа SDS-PAGE.
  4. Побудить выражение протеина путем добавления 1 мм изопропиловый β-D-thiogalactoside (IPTG) каждый флакон с культурой. Далее, инкубации фляги при 37 ° C в шейкере на 200 об/мин для дополнительных 4 ч.
  5. Урожай клетки центрифугированием в 5000 g x 15 мин при температуре 4 ° C и удалить супернатант.
    Примечание: на данный момент, процедура может быть приостановлена, поместив Пелле клеток в морозильной камере-80 ° C для хранения.

2. изоляция и денатурации включения органов

  1. Передача всех клеток окатыши, полученные на шаге 1.5 стакан 250 мл и добавить 100 мл буфера A (10 мм трис-HCl, рН 8,0, 150 мм NaCl). Позволяют клеткам таять полностью (если замороженные) и Ресуспензируйте гранулы. Держите образец на льду, если не указано иное.
  2. Пройти ресуспензированы клетки через высокого давления homogeniser три раза Лизируйте клетки и обеспечить полный наклон геномной ДНК.
  3. Центрифуга lysate на 10000 x g 15 мин при 4 ° C. 1 мл пробы супернатант (растворимая фракция) и храните его при 20 ° C для последующего анализа SDS-PAGE. Отказаться от остальной части супернатант и место гранул на льду.
    Примечание: Это гранулы белого цвета (легко отличить от непрерывной клеток, которые являются оттенок коричневого цвета) и содержит включения органов.
  4. Ресуспензируйте тщательно в 20 мл ледяной буфера B включение органов Пелле (10 мм трис-HCl рН 8,0, 0,2 мм phenylmethanesulfonyl фторид (PMSF), 1% тритон X-100). Это облегчает solubilisation мембран и мембранных белков. Вортекс для 1-2 мин помощи ресуспендирования.
  5. Центрифугуйте образцы на 10000 x g 15 мин при температуре 4 ° C и удалить супернатант.
  6. Ресуспензируйте гранулы тщательно в 20 мл ледяной буфера B, vortexing трубки на 1-2 мин убедитесь, что гранулы разбивается на мелкие кусочки. Накапайте образец вверх и вниз, чтобы помочь Пелле ресуспендирования.
    Примечание: Важно Ресуспензируйте Пелле тщательно, чтобы получить включения органов свободной от примесей.
  7. Повторите шаг 2,5. Если супернатант облачно или крашеные, повторите шаги 2.6 и 2.5 (в этом порядке) до супернатант ясно и бесцветная.
  8. Ресуспензируйте Пелле в 20 мл ледяной буфера C (10 мм трис-HCl рН 8,0, 0,2 мм PMSF), vortexing трубки для 1-2 мин.
  9. Повторите шаг 2,5.
  10. Добавьте 25 мл ледяной денатурируя буфера D (10 мм трис-HCl рН 8,0, мочевина 8 М, 10 мм Дитиотреитол (DTT), 0,2 мм PMSF) для растворения гранул включение органов. Ресуспензируйте тщательно, vortexing для 1-2 мин, или до тех пор, пока шарик разбивается на мелкие кусочки.
  11. Mix приостановление осевое вращение со скоростью вращения 30 rpm для 30-120 мин при 4 ° C.
  12. Уточнить решения денатурированного протеина центрифугированием на 30000 x g, 4 ° C на 30 мин, место супернатант на льду и отбросить гранулы.
  13. Измерьте концентрацию протеина используя assay Брадфорд. 24 взять Алиготе для анализа SDS-гель и поместите его в-20 ° C.
    Примечание: на данный момент, процедура может быть приостановлена на aliquoted образец оснастки замораживание в жидком азоте и держать его при температуре-80 ° C для хранения.

3. белка складывая

  1. Подготовка 250 мл буфера E (3 M мочевины, 100 мм трис-HCl рН 8,0, 0,4 М L-аргинин аммония, 20 мм снижение L-глутатион, 2 мм окисленных L-глутатион) в 500 мл стакан и прохладный буфера до 4 ° C.
  2. Добавьте 60 мг смеси денатурированные белки, содержащие его6-Tlp3-LBD полученный на шаге 2.13 до 250 мл буфера E, помешивая буфера на 500 об/мин. Инкубируйте refolding смеси при температуре 4 ° C с непрерывном помешивании в 500 об/мин за 24-48 ч. Окончательный белка концентрацию в этот шаг-0,2 мг мл-1.
  3. Подготовка 7 Л буфера A в 8-10 Л ведро и остудить до 4 ° C в рамках подготовки к следующий шаг (шаг 3.4), которая будет проходить в 24-48 ч (см. блок-схема на рис. 1).
  4. Погружать ~ 50 см кусок трубы диализа завышенные диаметром 28 мм, с молекулярной массой отсечение по 12-14 kDa в 200 мл 10 мм этилендиаминтетрауксусная динатриевая соль (ЭДТА-Na2) и тепло его над газового пламени до кипения. Промойте мембрану диализа с 200 мл ddH2O.
  5. Зажим один конец диализа мембраны с закрытием труб диализа и передачи 250 мл складывая смесь, полученного на шаге 3.2 трубу диализа. Закройте открытый конец с другой зажим. Проверьте целостность мембраны, чтобы убедиться, что есть нет утечки.
  6. Место диализа трубу в ведро диализа с предварительно охлажденным 7 L A буфер, подготовленную на этапе 3.3. Место сенсацию Магнитный Бар, обеспечение того, что он не будет касаться диализа труб помешивая.
  7. Dialyse образец на 4 ° C, продолжая перемешивание в 500 об/мин и изменить содержимое буфера по крайней мере четыре раза в течение 12 ч. После последнего изменения буфера оставьте образец dialyse на ночь.
    Примечание: Во время диализа, избыток мочевины (~ 3 M) постепенно удаляется из денатурированные белки решение, которое позволяет белка сворачивают. Тяжелые белка осадков можно наблюдать в конце диализа.
  8. Снять трубку диализа из ведра и передать его содержимое в 500 мл стакан. Держите раствор белка на льду, если не указано иное.
  9. Фильтр раствор белка через мембрану размер поры 0,43 мкм в стеклянная бутылка 500 мл для удаления осажденный белки.

4. Очистка его6-меткой протеина используя хромотографию сродства иона металла иммобилизованные

  1. Заряд и сбалансировать кусочки хелатирующий столбец 5 мл.
    1. Подключите колонки к Перистальтический насос, обеспечивая отсутствие воздуха, захваченных в соединительных труб.
    2. Промойте колонку, проходя через 25-50 мл ddH2O.
    3. Заряжайте столбце путем загрузки 3 мл 0,1 М NiCl2 и затем проходящей через 25 мл ddH2O.
    4. Сбалансировать столбец с 25 мл буфера F (загрузки буфера, 20 мм трис-HCl pH 8.0, 500 мм NaCl, 20 мм имидазола).
  2. Отрегулируйте сложил белка образца, полученное в шаге 3.9 состава буфера F, добавив 2,5 мл 1 М трис-HCl рН 8,0, 25 мл 5 М NaCl и 2,5 мл 2 M имидазола фондовых решений.
  3. Загрузите образец на столбец с скоростью 5 мл/мин или менее и отмены потока через (unbound протеины).
  4. Промойте колонку с 50-100 мл буфера F удалить-специфически связанных белков и отбросить потока через.
  5. Элюировать его6-Tlp3-LBD с 25 мл буфера G (Элюирующий буфер, 20 мм трис-HCl, 500 мм NaCl, 500 мм имидазола) и бассейн фракций потока через, содержащие белок (как определено с помощью Брэдфорд реагента).
  6. Измерьте концентрацию белка в пуле образца, используя assay Брадфорд. Возьмите небольшой аликвота SDS-PAGE анализа и место при-20 ° C.

5. его6-тег удаления с помощью ТэВ протеазы (опционально)

  1. Подготовить и охладить до 4 ° C, 4 L буфера H (TEV расщепления буфера, 10 мм трис-HCl pH 8.0, 150 мм NaCl, 1% (v/v) глицерина, 2 мм DTT).
  2. Вырезать примерно 5-7 см диализа труб (диаметр 2-3 см) и погрузите его в 200 мл ddH2O.
  3. Добавить его6-меткой протеазы ТэВ на его6-тег белка подготовлен в шаге от 4.5 до окончательного молярное соотношение 1 ТэВ: 8 белка.
  4. Зажим один конец трубки с закрытием труб диализа и заполнить его с смесь протеазы белка/TEV. Закройте другой конец и обеспечить есть нет утечки.
  5. Место диализа трубки в предварительно охлажденным 4 L буфера H (от шага 5.1) и Инкубируйте на 4 ° C с непрерывной перемешивании в течение 2 ч. изменения буфера и продолжить диализа одночасье разрешить реакции расщепления ТэВ опосредованной для завершения.
  6. В то же время готовить и прохладный (4 ° C) 4 Л буфера я (10 мм трис-HCl рН 8,0, 150 мм NaCl, 1% (v/v) глицерин) в рамках подготовки на следующий день.
  7. После Ночной диализ обмен буфера для буфера, который я подготовил на шаге 5.6 и dialyse для еще 1-2 ч при 4 ° C.
  8. Снять трубку из ведра диализа, отсоедините один конец трубки и передать 50 мл трубки сокола раствор белка. Фильтр решение через фильтр шприц размер поры 0,43 мкм и держать его на льду, если не указано иное.
  9. Измерить объем выборки и отрегулировать трис, NaCl и имидазола концентрацию состава буфера F (например для 25 мл раствора белка в буфере J добавить 0,25 мл 1 М трис-HCl рН 8,0, 1,75 мл 5 М NaCl и 0,25 мл 2 M имидазола).
  10. Подготовьте 5 мл HiTrap Хелатирующие HP столбец, как описано в шаге 4.1.
  11. Загрузить образец на столбец (скорость потока: 5 мл/мин) и собирать проточный, который содержит непомеченным Tlp3-LBD (остатки 42-291). Uncleaved протеин, рассеченного его6-тег и его6- TEV сохраняются в столбце.
  12. Промойте колонку с 5 мл буфера F (загрузки буфера) чтобы разрешить все непомеченным белка через и собирать элюата.
  13. Бассейн элюата полученное в 5.11 и 5.12 и измерить концентрацию белка. Возьмите небольшой аликвота и храните его при 20 ° C для анализа SDS-PAGE.

6. размер исключение хроматографии (гель фильтрации) Tlp3-LBD

  1. Подготовка 1 Л буфера A (10 мм трис-HCl рН 8,0, 150 мм NaCl) и фильтрации с помощью мембраны 0,43 мкм.
  2. Сбалансировать столбец Размер исключение 26/60 с буфером A со скоростью потока 4 мл/мин.
  3. Концентрат белка образца, полученное в шаге 5.13 объемом 3-4 мл с помощью центробежных концентратор 15 мл с 10 кДа отсчета (4 ° C, 4000 x g).
  4. Уточнить раствор белка центрифугированием на 13 000 x g, 4 ° C на 30 минут, чтобы удалить любые осажденный белки.
  5. Загрузите образец на предварительно уравновешенной 26/60 гель фильтрации столбца. Выполняют хроматографии в буфере A 4 мл/мин Monitor УФ трассировки со скоростью потока. Tlp3-Одд elutes на объем хранения, 210-220 мл. Бильярд пик фракций.
  6. Измерьте концентрацию белка. Возьмите небольшой аликвота для анализа SDS-PAGE.

7. SDS-PAGE анализ проб, собранных на различных стадиях очищение протеина

  1. Подготовка 1 Л SDS-PAGE работает буферу (J), содержащих 25 мм трис, 250 мм глицин, pH 8.3 и 0,1% (w/v) натрия Додециловый сульфат (SDS).
  2. Подготовка 10 мл 5 x SDS-PAGE загрузки (буферу K), содержащий 0,25 М трис-HCl рН 6,8, 10% (w/v) SDS, 50% (v/v) глицерина, 1 мм DTT и 0,05% бромфеноловый синий.
  3. Разрешить аликвоты, собранные на различных этапах очистки (шаги 1.3, 2.3, 2.13, 4.6, 5.13, 6.6) к оттепели.
  4. Для каждого образца смесь том, соответствующий 15 мкг общего белка с 2 мкл 5 x SDS-PAGE загрузки буфера и отрегулируйте громкость до 10 мкл с ddH2O.
  5. Тепло образцы на 95 ° C за 5-10 мин, спина их на 10000 x g 30 s и передачи образцов в чистую пробирку.
  6. Подготовка геля SDS-PAGE, используя 15% полиакриламида, отделяя гель (для 5 мл: 2,5 мл 30% (w/v) бис акриламида, 1,2 мл 1,5 М трис-HCl pH 8.8, 1,2 мл ddH2O, 50 мкл 10% (w/v) SDS, 50 мкл 20% (w/v) Аммония пероксодисульфат (APS), 3 мкл tetramethylethylenediamine (TEMED) и 5% полиакриламида, укладка гель (по 2 мл: 340 мкл 30% (w/v) бис акриламида, 250 мкл 1 М трис pH 6.8, 1.37 мл ddH2O, 20 мкл 10% (w/v) SDS, 20% 20 мкл (w/v) APS, 2 мкл TEMED).
  7. Соберите аппарат электрофореза и заполнить его с 1 x страницы SDS работает буфер в соответствии с рекомендациями производителя.
  8. Загрузите маркер низкомолекулярных белков и образцы, подготовленную на этапе 7.5. Провести электрофорез на постоянный ток 25 мА.
  9. Перевести гель в контейнер и промойте его с ddH2O. добавить 150 мл Кумасси синий окрашивание раствора содержит 25% (v/v) изопропиловый спирт, уксусная кислота 10% (v/v) и 0,03% (w/v) блестящий синий R-250. Поместите контейнер на Горизонтальное вращение платформы для 30 мин при комнатной температуре.
  10. Промойте гель с ddH2O и поместите в destaining раствор, содержащий 5% (v/v) метанола и 7% (v/v) уксусной кислоты. Отмойте во время смешивания с использованием горизонтального вращения платформы для 1 h.
  11. Изображение гель и анализировать.

8. циркулярного дихроизма (CD) спектроскопия анализ вторичных структура сложил чистого белка

  1. Передача 0,5 - 1 мг сложил белка, полученного на шаге 6.6 в трубку диализа и поместите его в ведро диализа, содержащих 5 Л буфера Л (50 мм натрия фосфат рН 7,4), охладить до 4 ° C. Dialyse образец на 4 ° C при непрерывном помешивании и выполнить по крайней мере 3-4 буфера изменения 2-4 ч. перед отъездом из образца до dialyse на ночь.
  2. Концентрат решение при белка-0,06 мг мл-1 с помощью центробежных концентратор отсечения 10 кДа.
  3. Уточнить решения центрифугированием на 13 000 x g, 4 ° C на 30 мин.
  4. Запись CD далеко УФ-спектре образца при 25 ° C в диапазоне длин волн 200-260 Нм, используя спектрополяриметра с частотой сканирования 20 Нм мин-1. Используйте буфер диализа как пустой элемент управления. Повторите запись в трех экземплярах и генерировать усредненной спектр.
  5. Рассчитайте содержание вторичной структуры, deconvoluting CD спектров, используя программу CDSSTR из DichroWeb Север25 (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рекомбинатные выражение его6-Tlp3-LBD в E. coli в результате осаждения белков в включения органов. Выражение доходность от 1 Л бактериальной культуры, рассчитанные на шаге 2.13 был приблизительно 100 мг его6-Tlp3-LBD, депонируется в включения органов. Процедура изоляции белка, здесь описаны и проиллюстрированы на рис. 1, состоит из solubilisation включения органов, складывая белка и очистки, посредством Хромотография сродства, у...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Простая процедура для выражения и складывая от включения органов периплазматическое LBD бактериальных Хеморецепция Tlp3 представлен. Подготовка чистого белка подразумевает гиперэкспрессия кодировке ПЭТ плазмид ген в E. coli, очистки и solubilisation включения органов, складывая денатурированного протеина и его очистки, подряд сходства и Размер-гель-проникающей хроматографии шаги. Мочевина способствует денатурации и разбавления/диализа опосредованной складывая являются важнейшие шаги в протоколе, оптимизация кото...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Yu C. Лю за его ранние работы на Tlp3-LBD производство. Майра A. Мачука долгу Departamento Admistrativo де науки, Tecnología e Innovación материалом для докторской стипендии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Трис основаниеAMRESCO497
Хлорид натрия (NaCl)MERK MILLIPORE1064041000
АмпициллинG-BIOSCIENCESA051-B
Фенилметансульфонилфторид (PMSF)MERCK52332
Triton x-100AMRESCO694
Изопропил &бета;-D-тиогалактозид (IPTG)ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD
МочевинаАМРЕСКОVWRC0568
ДитиотреитолASTRAL SCIENTIFIC PTY LTDC-1029
L-аргинин моногидрохлоридSIGMA-ALDRICHA5131
Восстановленный L-глутатионSIGMA-ALDRICHG4251
Окисленный L-глутатионSIGMA-ALDRICHG4376
Натрия фосфат двухосновной (Na2HPO4)SIGMA-ALDRICH7558-79-4
Одноосновной фосфат натрия (2PO4)SIGMA-ALDRICH10049-21-5
Этилендиаминтетрауксусная кислота динатриевая соль дегидрат (ЭДТА)AMRESCOVWRC20302.260
ИмидазолSIGMA-ALDRICHI2399
ГлицеринASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD
Хлорид никеля (NiCl2)SIGMA-ALDRICH339350
ГлицинAMRESCOVWRC0167
Додецилсульфат натрия (SDS)SIGMA-ALDRICHL4509
Неокрашенный белковый лестница, широкий Диапазон (10-250 кДа)NEW ENGLAND BIOLABSP7703
Центробежный концентратор Amicon Ultracel (Millipore)MERCKUFC901096
50 мл Трубка FalconBDAA352070
Трубка для диализаLIVINGSTONE INTERNATIONAL PTYДиализная
трубка для диализа из змеиной кожиTHERMO SCIENTIFIC™68100
Предварительно упакованный HiTrap хелатирующая колонкаGE HEALTHCARE LIFE SCIENCES17-0408-01
EmulsiFlex-C5 гомогенизатор высокого давленияAVESTINEmulsiFlex™ - C5
Перистальтический насос P-1GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES18-1110-91
Superdex 200 HiLoad 26/60 колонна исключения размера GE HEALTHCARE LIFE
СПЕКТРОПОЛЯРИМЕТР JASCO J-815JASCOJ-815
AST0487 BIOGB0232 SCIENCES 28989336

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms. Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).
  2. Josenhans, C., Suerbaum, S. The role of motility as a virulence factor in bacteria. Int J Med Microbiol. 291 (8), 605-614 (2002).
  3. Morooka, T., Umeda, A., Amako, K. Motility as an intestinal colonization factor for Campylobacter jejuni. J Gen Microbiol. 131 (8), 1973-1980 (1985).
  4. Zautner, A. E., Tareen, A. M., Gross, U., Lugert, R. Chemotaxis in Campylobacter jejuni. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (1), 24-31 (2012).
  5. Zhulin, I. B. The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back. Adv Microb Physiol. 45, 157-198 (2001).
  6. Fernando, U., Biswas, D., Allan, B., Willson, P., Potter, A. A. Influence of Campylobacter jejuni fliA, rpoN and flgK genes on colonization of the chicken gut. Int J Food Microbiol. 118 (2), 194-200 (2007).
  7. Salah Ud-Din, A. I., Roujeinikova, A. Methyl-accepting chemotaxis proteins: a core sensing element in prokaryotes and archaea. Cell Mol Life Sci. , (2017).
  8. Parkhill, J., et al. The genome sequence of the food-borne pathogen Campylobacter jejuni reveals hypervariable sequences. Nature. 403 (6770), 665-668 (2000).
  9. Hartley-Tassell, L. E., et al. Identification and characterization of the aspartate chemosensory receptor of Campylobacter jejuni. Mol Microbiol. 75 (3), 710-730 (2010).
  10. Rahman, H., et al. Characterisation of a multi-ligand binding chemoreceptor CcmL (Tlp3) of Campylobacter jejuni. PLoS Pathog. 10 (1), e1003822(2014).
  11. Li, Z., et al. Methyl-accepting chemotaxis proteins 3 and 4 are responsible for Campylobacter jejuni chemotaxis and jejuna colonization in mice in response to sodium deoxycholate. J Med Microbiol. 63 (Pt 3), 343-354 (2014).
  12. Tareen, A. M., Dasti, J. I., Zautner, A. E., Gross, U., Lugert, R. Campylobacter jejuni proteins Cj0952c and Cj0951c affect chemotactic behaviour towards formic acid and are important for invasion of host cells. Microbiology. 156 (Pt 10), 3123-3135 (2010).
  13. Day, C. J., et al. A direct-sensing galactose chemoreceptor recently evolved in invasive strains of Campylobacter jejuni. Nat Commun. 7, 13206(2016).
  14. McKellar, J. L., Minnell, J. J., Gerth, M. L. A high-throughput screen for ligand binding reveals the specificities of three amino acid chemoreceptors from Pseudomonas syringae pv. actinidiae. Mol. Microbiol. 96 (4), 694-707 (2015).
  15. Fernandez, M., Morel, B., Corral-Lugo, A., Krell, T. Identification of a chemoreceptor that specifically mediates chemotaxis toward metabolizable purine derivatives. Mol. Microbiol. 99 (1), 34-42 (2016).
  16. Corral-Lugo, A., et al. Assessment of the contribution of chemoreceptor-based signaling to biofilm formation. Environ. Microbiol. , (2015).
  17. Machuca, M. A., Liu, Y. C., Roujeinikova, A. Cloning, expression, refolding, purification and preliminary crystallographic analysis of the sensory domain of the Campylobacter chemoreceptor for aspartate A (CcaA). Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 71 (Pt 1), 110-113 (2015).
  18. Machuca, M. A., Liu, Y. C., Beckham, S. A., Roujeinikova, A. Cloning, refolding, purification and preliminary crystallographic analysis of the sensory domain of the Campylobacter chemoreceptor for multiple ligands (CcmL). Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 71 (Pt 2), 211-216 (2015).
  19. Liu, Y. C., Roujeinikova, A. Expression, refolding, purification and crystallization of the sensory domain of the TlpC chemoreceptor from Helicobacter pylori for structural studies. Protein Expr. Purif. 107, 29-34 (2015).
  20. Upadhyay, A. A., Fleetwood, A. D., Adebali, O., Finn, R. D., Zhulin, I. B. Cache Domains That are Homologous to, but Different from PAS Domains Comprise the Largest Superfamily of Extracellular Sensors in Prokaryotes. PLoS Comput. Biol. 12 (4), e1004862(2016).
  21. Bardy, S. L., Briegel, A., Rainville, S., Krell, T. Recent advances and future prospects in bacterial and archaeal locomotion and signal transduction. J. Bacteriol. , (2017).
  22. Glekas, G. D., et al. The Bacillus subtilis chemoreceptor McpC senses multiple ligands using two discrete mechanisms. J. Biol. Chem. 287 (47), 39412-39418 (2012).
  23. Liu, Y. C., Machuca, M. A., Beckham, S. A., Gunzburg, M. J., Roujeinikova, A. Structural basis for amino-acid recognition and transmembrane signalling by tandem Per-Arnt-Sim (tandem PAS) chemoreceptor sensory domains. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 71 (Pt 10), 2127-2136 (2015).
  24. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  25. Whitmore, L., Wallace, B. A. Protein secondary structure analyses from circular dichroism spectroscopy: methods and reference databases. Biopolymers. 89 (5), 392-400 (2008).
  26. Singh, S. M., Panda, A. K. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. J Biosci Bioeng. 99 (4), 303-310 (2005).
  27. Lippincott, J., Apostol, I. Carbamylation of cysteine: a potential artifact in peptide mapping of hemoglobins in the presence of urea. Anal Biochem. 267 (1), 57-64 (1999).
  28. Cejka, J., Vodrazka, Z., Salak, J. Carbamylation of globin in electrophoresis and chromatography in the presence of urea. Biochim Biophys Acta. 154 (3), 589-591 (1968).
  29. Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
  30. Hagel, P., Gerding, J. J., Fieggen, W., Bloemendal, H. Cyanate formation in solutions of urea. I. Calculation of cyanate concentrations at different temperature and pH. Biochim Biophys Acta. 243 (3), 366-373 (1971).
  31. Volkin, D. B., Mach, H., Middaugh, C. R. Degradative covalent reactions important to protein stability. Mol Biotechnol. 8 (2), 105-122 (1997).
  32. Stark, G. R. Reactions of cyanate with functional groups of proteins. 3. Reactions with amino and carboxyl groups. Biochemistry. 4 (6), 1030-1036 (1965).
  33. Lin, M. F., Williams, C., Murray, M. V., Conn, G., Ropp, P. A. Ion chromatographic quantification of cyanate in urea solutions: estimation of the efficiency of cyanate scavengers for use in recombinant protein manufacturing. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 803 (2), 353-362 (2004).
  34. Fischer, B., Sumner, I., Goodenough, P. Isolation, renaturation, and formation of disulfide bonds of eukaryotic proteins expressed in Escherichia coli as inclusion bodies. Biotechnol Bioeng. 41 (1), 3-13 (1993).
  35. Vallejo, L. F., Rinas, U. Strategies for the recovery of active proteins through refolding of bacterial inclusion body proteins. Microb Cell Fact. 3 (1), 11(2004).
  36. Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expr Purif. 3 (4), 263-281 (1992).
  37. Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods Enzymol. 326, 245-254 (2000).
  38. Stulik, K., Pacakova, V., Ticha, M. Some potentialities and drawbacks of contemporary size-exclusion chromatography. J Biochem Biophys Methods. 56 (1-3), 1-13 (2003).
  39. Kunji, E. R., Harding, M., Butler, P. J., Akamine, P. Determination of the molecular mass and dimensions of membrane proteins by size exclusion chromatography. Methods. 46 (2), 62-72 (2008).
  40. Folta-Stogniew, E. Oligomeric states of proteins determined by size-exclusion chromatography coupled with light scattering, absorbance, and refractive index detectors. Methods Mol Biol. 328, 97-112 (2006).
  41. Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review. Protein Sci. 11 (9), 2067-2079 (2002).
  42. Machuca, M. A., Liu, Y. C., Beckham, S. A., Gunzburg, M. J., Roujeinikova, A. The Crystal Structure of the Tandem-PAS Sensing Domain of Campylobacter jejuni Chemoreceptor Tlp1 Suggests Indirect Mechanism of Ligand Recognition. J. Struct. Biol. 194 (2), 205-213 (2016).
  43. Rico-Jimenez, M., et al. Paralogous chemoreceptors mediate chemotaxis towards protein amino acids and the non-protein amino acid gamma-aminobutyrate. Mol. Microbiol. 88 (6), 1230-1243 (2013).
  44. Salah Ud-Din, A. I. M., Roujeinikova, A. The periplasmic sensing domain of Pseudomonas fluorescens chemotactic transducer of amino acids type B (CtaB): Cloning, refolding, purification, crystallization, and X-ray crystallographic analysis. Biosci. Trends. 11 (2), 229-234 (2017).
  45. Stockel, J., Doring, K., Malotka, J., Jahnig, F., Dornmair, K. Pathway of detergent-mediated and peptide ligand-mediated refolding of heterodimeric class II major histocompatibility complex (MHC) molecules. Eur J Biochem. 248 (3), 684-691 (1997).
  46. Cardamone, M., Puri, N. K., Brandon, M. R. Comparing the refolding and reoxidation of recombinant porcine growth hormone from a urea denatured state and from Escherichia coli inclusion bodies. Biochemistry. 34 (17), 5773-5794 (1995).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Chemoreceptor Ligand Binding DomainProtein RefoldingInclusion Body SolubilizationUrea Mediated SolubilizationAffinity ChromatographySize Exclusion ChromatographyCircular Dichroism SpectroscopyHis6 Tag CleavageTEV Protease TreatmentDialysis Buffer Exchange

Related Articles