Методическая статья

Роман пассивной очистки методы для быстрого производства оптической прозрачности в целом тканях ЦНС

DOI:

10.3791/57123

⸱

8 мая 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, Gangnam Severance Hospital, Yonsei University College of Medicine, 2Brain Korea 21 PLUS Project for Medical Science, Yonsei University, 3The Spine and Spinal Cord Institute, Biomedical Center, Gangnam Severance Hospital, Yonsei University College of Medicine, 4Columbia University College of Physicians and Surgeons

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем два новых методологий, psPACT и ударным, для достижения максимальной оптической прозрачности и последующего анализа микроскопических сосудистую ткани в нетронутыми грызун весь ЦНС.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С момента разработки ЯСНОСТИ биоэлектрохимическим, очистка техника, что позволяет для трехмерных фенотип картирования в прозрачной ткани, множество Роман очистки методологий, включая КУБИЧЕСКИЙ (ясно, беспрепятственный мозга томография коктейли и Вычислительный анализ), выключатель (общесистемного управления взаимодействия времени) и кинетики химических веществ, карта (увеличенное анализ протеома) и Пакт (пассивный ясности техника), были созданы для дальнейшего расширения существующего инструментария для микроскопический анализ биологических тканей. В настоящем исследовании стремится улучшить и оптимизировать с первоначальной процедурой Пакт для массива нетронутыми грызунов тканей, в том числе всей центральной нервной системы (ЦНС), почки, селезенка и весь мыши эмбрионов. Назвать psPACT (процесс отделите пакт) и ударным (изменение пакт), эти новые методы обеспечивают весьма эффективным средством сопоставления схемы ячейки и визуализации внутриклеточных структур в нетронутыми нормальных и патологических тканей. В следующий протокол мы предоставляем подробный, шаг за шагом план о том, как добиться максимальной ткани Распродажа с минимальным вторжением в их структурной целостности через psPACT и ударным.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Основная цель научных и клинических исследования предполагает достижение полного понимания структуры органа и функции; Тем не менее чрезвычайно сложный характер млекопитающих органов часто служит барьером для полного достижения этой цели1. ЯСНОСТЬ (ясно липидный обмен гибридизированных акриламида жесткой изображений совместимых Tisssue Гидрогель)2,3,4, который включает в себя построение гибридных гидрогеля на основе акриламида с неповрежденными тканями, достигает оптическое оформление различных органов, в том числе мозга, печени и селезенки, при сохранении их структурной целостности5. Таким образом, ясность позволило не только визуализации, но и возможность тонко анализировать сложные сотовой сети и морфологии тканей без необходимости для разрезания.

Чтобы добиться Распродажа тканей, ЯСНОСТИ использует электрофоретические методы, чтобы удалить содержание липидов образца под рукой. Хотя ЯСНОСТИ было отмечено для производства физически стабильной ткани гидрогеля гибриды, исследования показали, что его использование методов очистки (ETC) электрофоретической ткани дает разные результаты с точки зрения качества ткани, в том числе Браунинг, epitope ущерб, и протеин потери5,6. Для решения этих вопросов, модифицированных протоколы, такие как Пакт (пассивный ясности техника), который заменяет и т.д. лечение с пассивным, ионных моющих средств на основе delipidation техникой, были развитых7,8,9. Однако, несмотря на достижение большей согласованности результатов, Пакт требует больше времени, чтобы получить максимальный зазор. Кроме того ни один из этих методов еще не были применены к всей форме ЦНС, или в больших грызунов модели, такие как крысы и морских свинок.

Настоящее исследование стремится решить эти ограничения, предлагая новые методологии, psPACT (процесс отделите пакт) и ударным (изменение пакт), для облегчения быстрого разминирования всей ЦНС и внутренних органов в мышь и крыса модели10. В частности, psPACT процессов тканей в 4% акриламида и 0,25% VA-044 в два отдельных этапа во время Гидрогель образования; ударным по существу включает в себя те же шаги, но добавки на основе SDS очистки решение с 0,5% α-thioglycerol как ключевых реагента. Обе методики освоения эндогенного системных цереброспинальный сердечно-сосудистой системы и значительно сократить время, необходимое для производства оптических распродажа. Как доказательство принципа мы продемонстрировать использование confocal микроскопии для анализа закономерностей кровеносный сосуд в очищенной тканей10.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры были одобрены Комитет по этике соответствующих исследований в колледже медицины Университета Йонсей. В соответствии с руководящими принципами лабораторных животных ухода Комитета в колледж медицины Университета Йонсей приносятся в жертву всех подопытных животных.

1. Подготовка реагентов

Предупреждение: Параформальдегида (PFA), акриламида и натрия Додециловый сульфат (SDS) токсичных раздражителей и таким образом должны обрабатываться в Зонта с соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ; лаборатории пальто, перчатки, защитные очки).

  1. 4% раствор акриламида (а.а.) (A4P0): добавить 20 мл 40% акриламида раствора 180 мл 0,1 М фосфат амортизированное saline (PBS).
  2. 0,25% раствор VA-044: добавить 0,5 г 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] порошок дигидрохлорид (VA-044) 200 мл 0,1 М фосфат амортизированное saline (PBS). В то время как VA-044 порошок может храниться при комнатной температуре, он должен храниться при температуре 4 ° C на солюбилизация в PBS. Для достижения наилучших результатов Подготовьте только количество раствора, необходимых для проведения эксперимента.
  3. Пакт коктейль решение: добавить 10 g акриламида в 225 мл 4% раствора параформальдегида (PFA) и отрегулируйте громкость до 200 мл с 4% PFA. Перед использованием добавьте 100 мг порошка VA-044 в 40 мл смеси в 50 мл Конические трубки.
  4. Пакт, очистка буфера решение: добавить 40 г додецилового сульфата натрия (SDS) до 350 мл 0,1 М PBS и отрегулировать громкость до 500 мл с PBS 0,1 М. Для ударным Очистить решение добавьте 0,5% α-thioglycerol Пакт, очистка буфера решения.
  5. Мышей, используемые в данном исследовании были 2-недельных самцов мышей BALB; 2 неделя старый SD-самцах крыс, используемые в данном исследовании.

2. анестезии и операции перфузии

Предупреждение: PFA акриламида токсичных раздражителей и таким образом должны обрабатываться в Зонта с соответствующим СИЗ.

  1. Анестезировать животное в комнате бесплатно возбудителя с 30 мг/кг zoletil с помощью 1 мл шприца с иглой 26-го калибра. Контролировать животное для 5-10 мин.
  2. Как только животное достиг хирургические плоскости анестезии, используйте метод мыс щепотка ответ для определения глубины анестезии. Подтвердите зависания.
    Примечание: Следующие шаги с участием мыши и крысы хирургии следовать подобный протокол, используемый в предыдущем исследовании11.
  3. Сделайте 5-6 см разрез под грудной клетки, через кожный покров и брюшной стенки.
  4. Используйте изогнутые, тупыми ножницами сделать разрез в диафрагмы, пальпируя грудной области, чтобы найти сайт разрез заранее.
  5. Расширить разрез по всей протяженности грудной клетки подвергать плевральной полости.
  6. Тщательно вытесняют легких. Сделайте надрез через грудной клетки до ключицы. С помощью ножниц Ирис, сделать небольшой надрез до конца заднего левого желудочка. Вставьте иглы 18-калибровочного накренилась тупой или оливкового перфузии в восходящей части аорты, проходя через вырежьте желудочка.
  7. Безопасности иглы и предотвращения утечки, сердце с кровоостанавливающий зажим. Кроме того с помощью модифицированных кровоостанавливающий зажим аорты вокруг кончик иглы.
  8. Сделайте большой разрез в правое предсердие, заботясь, чтобы обеспечить минимальное повреждение к нисходящей аорты. Крыса теперь готов для перфузии.

3. весь перфузии и рассечение крыса

Предупреждение: PFA акриламида токсичных раздражителей и таким образом должны обрабатываться в Зонта с соответствующим СИЗ.

Примечание: Следующие шаги весь перфузии похожи на протокол, используемый в предыдущем исследовании, Ву и др. (2016) 10 , 11.

  1. Прикрепите правого предсердия сердца к 18-иглы, заботясь, чтобы не вводить каких-либо воздушных пузырьков.
  2. С помощью 50 мл шприца, быстро и равномерно насос 50 мл холодного раствора 0,1 М PBS, содержащих гепарин (10 единиц/мл).
  3. 18-иглы соединить трубки перистальтического насоса.
  4. Вымойте с 200 мл холодного раствора 0,1 М PBS, содержащих гепарин (10 единиц/мл) со скоростью обращения 10 мл/мин.
  5. Fix с 250 мл холодного PFA 4% раствора со скоростью обращения 10 мл/мин. На данном этапе должно быть жесткой крыса.
  6. Собирать и хранить остальные PFA решение для удаления.
  7. Для Пакта perfuse ткани с охлажденной Пакт коктейль раствор 4% PFA, 4% акриламида и 0,25% VA-044 порошок с 18-калибровочного иглой, а затем удалить головы и позвоночника. Разоблачить черепа, сделав срединной линии разреза от шеи к носу. Этот шаг дополнительные перфузии является ненужным для методов psPACT и mPACT; После фиксации немедленно изолировать головы и позвоночника и разоблачить черепа.
  8. Разоблачить основания черепа, удалив любые остаточные шеи и мышцы позвоночника.
  9. Использование rongeurs и ножницы, чтобы очистить от черепа. Удаление головного и спинного мозга.
  10. Магазин ткани в 4% PFA при температуре 4 ° C; тканей может храниться до 1 недели.

4. гидрогеля мономера инфузии и полимеризации крысы и мыши ЦНС

Предупреждение: Акриламида, SDS, α-thioglycerol и ПФА являются раздражителями и таким образом должны обрабатываться в вытяжного шкафа и с соответствующим Пи.

  1. Пакт (пассивный очистка техника)
    1. Изолировать и культуры всей центральной нервной системы (головного и спинного мозга) от фиксированной мышей и крыс в Тюбик 50 мл, содержащие охлажденные Пакт коктейль раствор 4% PFA, 4% акриламида и 0,25% VA-044 порошок и хранить при 4 ° C в течение 24 ч. Убедитесь, что ткань полностью погружен в s резолюции.
    2. Вставлять образец в газ азот, за 10 мин, с использованием ткани гель гибридизации системы подключен к резервуару азота: установить систему до 37 ° C. Передача тканей на тюбик 50 мл, содержащие свежей холодной (4 ° C) Пакт коктейль решения и соединиться с трубы колпачок, затем включите пылесос.
    3. Для полимеризации гидрогеля, место трубка, содержащая образец в тряску инкубатора (150 об/мин, 37 ° C) 3 часа, или до завершения полимеризации.
    4. С помощью промокательную бумагу (см. Таблицу материалы), удалить оставшиеся полимеризованной гидрогеля, окружающие ткани.
    5. Передать ткани Тюбик 50 мл, содержащие очистки раствора (8% SDS в 0,1 М PBS, рН 8,0).
    6. Поместите образец в тряску инкубатора, равным 37 ° C и 150 об/мин, до тех пор, пока ткань была очищена. В среднем она занимает около 20 дней для мыши ЦНС добиться полной ясности.
  2. psPACT (обрабатывать отдельные пассивной очистки техника)
    1. Изолируйте всей центральной нервной системы (головного и спинного мозга) с ножницы из PFA-Исправлена мышей и крыс на лавочке чистой и кости резец.
    2. Передача тканей чтобы Тюбик 50 мл, содержащих 4% PFA и хранить при 4 ° C в течение 24 ч. Убедитесь, что ткань полностью погружен в фиксатор.
    3. Вымойте фиксированной ткани на 1 ч в 0,1 М PBS и затем передать A4P0 решение (4% акриламида в PBS 0,1 М). Хранить при 37 ° C в течение 24 ч.
    4. Стирать ткани на 5 мин в 0,1 М PBS.
    5. Погружать ткани в 0,25% VA-044 в 0,1 М PBS. Хранить при 37 ° C в течение 6-24 часа и затем перенести на свежий раствор 0,25% VA-044/PBS.
    6. Вставлять образец в газ азот, за 10 мин, с использованием ткани гель гибридизации системы (см. Таблицу материалы) связано с баком азота: передачи тканей Тюбик 50 мл, содержащие свежей холодной (4 ° C) 0,25% раствор VA-044/PBS и соединиться с трубки Кап. Включите пылесос.
    7. Передача ткань для очистки раствора (8% SDS в 0,1 М PBS, рН 8,0).
    8. Инкубируйте образца в тряску инкубатора, равным 37 ° C и 150 об/мин, до тех пор, пока ткань была очищена. В среднем это занимает около 17 дней для мыши ЦНС добиться полной ясности.
  3. ударным (изменение пассивный очистка техника)
    1. Изолируйте всей центральной нервной системы (головного и спинного мозга) с ножницы из PFA-Исправлена мышей и крыс на лавочке чистой и кости резец.
    2. Выполните шаги 4.2.2 - 4.2.8 psPACT протокола.
    3. Передача ткань для очистки решения. Обратите внимание, что в отличие от протоколов Пакта и psPACT, ударным требует очистки раствор, состоящий из 0,5% α-thioglycerol в дополнение к 8% SDS в 0,1 М PBS, рН 8.0. Α-thioglycerol — это ООН подрумянивания агент, который помогает очистить ткани более быстро и эффективно. Убедитесь, что ткань полностью погружен в раствор.
    4. Поместите образец в тряску инкубатора, равным 37 ° C и 150 об/мин, до тех пор, пока ткань была очищена. В среднем это занимает около 2 недель для мыши ЦНС добиться полной ясности.

5. показатель преломления соответствия и иммуноокрашивания очищается ЦНС

Примечание: nколеса (Nycodenz-решение на основе преломления соответствия) состоит из 0,8 г/мл Nycodenz порошок растворяют в 30 мл базового буфера (0.01% азид натрия и Tween-20 в 0,1 М PBS, рН 8,0). Рекомендуется, что решение помещается в 37 ° C, пожимая инкубатор для надлежащего сольватации порошка.

  1. Инкубировать тканей в 0,1% тритон X-100 в 0,1 М PBS за 2 ч, затем блок с 2% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в 0,1 М PBS на 6 ч.
  2. Вымойте секции три раза в PBST (0.1% Tween-20 в PBS 0,1 М) за 2 ч. пятно секции с первичных антител (в данном случае, PECAM-CD31 антитела анти кролика, который пятна кровеносных сосудов) за 2 дня.
  3. Пятно секции с вторичные антитела в 2% BSA (в данном случае, коза анти кролик IgG Cy3 флуоресцентные конъюгат) за 2 дня.
  4. Мыть помечены тканей три раза в PBST 2 h и магазин в 15 мл колеса n2-10 дней.
  5. До изображения, переместите Приклеенные этикетку ткани небольшое количество nколеса на 35 - мм и 60-мм культуры ткани блюда. Прикрепите с помощью силикона вокруг нижнего края блюдо.
  6. Добавьте 1,5-2 мл свежего nколеса.

6. обработка изображений

  1. Получение изображений очищается тканей с плитки сканирование с помощью конфокальное лазерное сканирование microscopewith 10-кратном (см. Таблицу материалы). Для Cy3-меченых ткани, используйте волны 550-600 Нм.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Создание прозрачной модели всей центральной нервной системы с использованием методов оптимизации пассивной очистки

Оптическая Распродажа тканей крыс и мышей весь ЦНС быстро было достигнуто с помощью различных методов пассивной очистки (рис. 1). Схематическое изображение ткани, сняв с течением времени показан на рисунке 2A. В отличие от оригинального мет...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В то время как пассивной, не электрофоретической извлечения методов, используемых в Пакт значительно улучшить согласованность достигнута с предыдущим ткани, очистка методы, такие как ясность2,3,4,7 , 8, техника все еще имеет несколько недостатков, наиболее актуальных которых является продолжительность времени, необходимого для достижения максимального ткани яс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана мозга Корея 21 плюс проект сайта для медицинской науки, Университет Йонсей. Кроме того эта работа была поддержана грантом от Национальный исследовательский фонд Кореи (СР 2017R1D1A1B03030315).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Додецилсульфат натрия (SDS)Affymetrix, Inc.75819Раствор для очистки
NycodenzAxia-Shield1002424раствор nRIMS
40% раствор акриламидаBio Rad Laboratories, Inc.161-0140Полимеризация (A4P0)
2,2´-Азобис[2-(2-имидазолин-2-ил)пропан] ДигидрохлоридWako Pure Chemical Industries, Ltd.017-19362Полимеризация (VA-044)
1-ТиоглицеринSigma-AldrichM1753-100MLРаствор для очистки (mPACT)
Tween-20Georgiachem9005-64-5раствор nRIMS
Triton X-100Sigma-AldrichT8787-50MLИммуноокрашивающий
Бычья сыворотка альбумин (BSA)BovogenBSA100Иммуноокрашивающий
гепаринMerck Millipore375095Perfusion (PBS)
Азиднатрия Sigma-AldrichS2002-25GnRIMS раствор
антитело PECAM-CD31Santa Cruz Biotechnology Inc.sc-28188Иммуноокрашивающий
козий анти-кролик-IgG Cy3 флуоресцентный конъюгатJackson ImmunoResearch Inc.111-165-003Иммуноокрашивание
4% параформальдегидаTech & ИнновацияBPP-9004Перфузия, полимеризация
20X Фосфатный буферный раствор (pH 7,4)Технологии и ИнновацияBPB-9121Перфузия, буфер
10 мл стрипетCoatar4488Перенос раствора
50 мл пробиркаFalcon352070Пробирка для очищения
35 мм Чашка для клеточных культурSPL20035Визуализационная
конфокальная чашкаSPL211350Визуализация
1 мл шприцКорейская вакцина Co., Ltd26G 1/2Обезболивание 
Шприц 50 млКорейская вакцина Co., Ltd21G1 1/4Перфузия
АкриламидSigma-AldrichA3553Полимеризация (A4P0)
Ватман 3ММ бумагаSigma-AldrichZ270849Промокательная бумага для удаления геля
Конфокальный микроскопZeissLSM780Imaging
ZEN lite программное обеспечениеZeissZEN 2012Imaging
Перистальтический насосLongerpumpBT100-1FПерфузия
EasyGelLifecanvas TechnologiesEasyGelТканевая система гибридизации геля

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience. Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).
  2. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  3. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  4. Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810(2017).
  5. Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 48(2014).
  6. Jensen, K. H. R., Berg, R. W. Advances and perspectives in tissue clearing using CLARITY. J Chem Neuroanat. 86, 19-34 (2017).
  7. Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).
  8. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  9. Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Sci Rep. 6, 34331(2016).
  10. Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), 274(2016).
  11. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  12. Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
  13. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  14. Choi, B. R., et al. Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Exp Mol Med. 46, 75(2014).
  15. Chang, D. J., et al. Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats. Exp Mol Med. 45, 53(2013).
  16. Kim, T. K., et al. Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease. Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).
  17. Kinameri, E., et al. Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis. PLoS One. 3 (12), e3859(2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

psPACTmPACT

Похожие статьи