Здесь мы представляем два новых методологий, psPACT и ударным, для достижения максимальной оптической прозрачности и последующего анализа микроскопических сосудистую ткани в нетронутыми грызун весь ЦНС.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Роман пассивной очистки методы для быстрого производства оптической прозрачности в целом тканях ЦНС
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
С момента разработки ЯСНОСТИ биоэлектрохимическим, очистка техника, что позволяет для трехмерных фенотип картирования в прозрачной ткани, множество Роман очистки методологий, включая КУБИЧЕСКИЙ (ясно, беспрепятственный мозга томография коктейли и Вычислительный анализ), выключатель (общесистемного управления взаимодействия времени) и кинетики химических веществ, карта (увеличенное анализ протеома) и Пакт (пассивный ясности техника), были созданы для дальнейшего расширения существующего инструментария для микроскопический анализ биологических тканей. В настоящем исследовании стремится улучшить и оптимизировать с первоначальной процедурой Пакт для массива нетронутыми грызунов тканей, в том числе всей центральной нервной системы (ЦНС), почки, селезенка и весь мыши эмбрионов. Назвать psPACT (процесс отделите пакт) и ударным (изменение пакт), эти новые методы обеспечивают весьма эффективным средством сопоставления схемы ячейки и визуализации внутриклеточных структур в нетронутыми нормальных и патологических тканей. В следующий протокол мы предоставляем подробный, шаг за шагом план о том, как добиться максимальной ткани Распродажа с минимальным вторжением в их структурной целостности через psPACT и ударным.
Введение
Основная цель научных и клинических исследования предполагает достижение полного понимания структуры органа и функции; Тем не менее чрезвычайно сложный характер млекопитающих органов часто служит барьером для полного достижения этой цели1. ЯСНОСТЬ (ясно липидный обмен гибридизированных акриламида жесткой изображений совместимых Tisssue Гидрогель)2,3,4, который включает в себя построение гибридных гидрогеля на основе акриламида с неповрежденными тканями, достигает оптическое оформление различных органов, в том числе мозга, печени и селезенки, при сохран....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры были одобрены Комитет по этике соответствующих исследований в колледже медицины Университета Йонсей. В соответствии с руководящими принципами лабораторных животных ухода Комитета в колледж медицины Университета Йонсей приносятся в жертву всех подопытных животных.
1. Подготовка реагентов
Предупреждение: Параформальдегида (PFA), акриламида и натрия Додециловый сульфат (SDS) токсичных раздражителей и таким образом должны обрабатываться в Зонта с соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ; лаборатории пальто, перчатки, защитные очки).
- 4% раствор акриламида (а.а.) (A4P0): добавить 20 м....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Создание прозрачной модели всей центральной нервной системы с использованием методов оптимизации пассивной очистки
Оптическая Распродажа тканей крыс и мышей весь ЦНС быстро было достигнуто с помощью различных методов пассивной очистки (рис. 1). Схематическое изображение ткани, сняв с течением времени показан на рисунке 2A. В отличие от оригинального мет.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В то время как пассивной, не электрофоретической извлечения методов, используемых в Пакт значительно улучшить согласованность достигнута с предыдущим ткани, очистка методы, такие как ясность2,3,4,7 , 8, техника все еще имеет несколько недостатков, наиболее актуальных которых является продолжительность времени, необходимого для достижения максимального ткани яс.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Эта работа была поддержана мозга Корея 21 плюс проект сайта для медицинской науки, Университет Йонсей. Кроме того эта работа была поддержана грантом от Национальный исследовательский фонд Кореи (СР 2017R1D1A1B03030315).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Додецилсульфат натрия (SDS) | Affymetrix, Inc. | 75819 | Раствор для очистки |
| Nycodenz | Axia-Shield | 1002424 | раствор nRIMS |
| 40% раствор акриламида | Bio Rad Laboratories, Inc. | 161-0140 | Полимеризация (A4P0) |
| 2,2´-Азобис[2-(2-имидазолин-2-ил)пропан] Дигидрохлорид | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 017-19362 | Полимеризация (VA-044) |
| 1-Тиоглицерин | Sigma-Aldrich | M1753-100ML | Раствор для очистки (mPACT) |
| Tween-20 | Georgiachem | 9005-64-5 | раствор nRIMS |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | Иммуноокрашивающий |
| Бычья сыворотка альбумин (BSA) | Bovogen | BSA100 | Иммуноокрашивающий |
| гепарин | Merck Millipore | 375095 | Perfusion (PBS) |
| Азид | натрия Sigma-Aldrich | S2002-25G | nRIMS раствор |
| антитело PECAM-CD31 | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-28188 | Иммуноокрашивающий |
| козий анти-кролик-IgG Cy3 флуоресцентный конъюгат | Jackson ImmunoResearch Inc. | 111-165-003 | Иммуноокрашивание |
| 4% параформальдегида | Tech & Инновация | BPP-9004 | Перфузия, полимеризация |
| 20X Фосфатный буферный раствор (pH 7,4) | Технологии и Инновация | BPB-9121 | Перфузия, буфер |
| 10 мл стрипет | Coatar | 4488 | Перенос раствора |
| 50 мл пробирка | Falcon | 352070 | Пробирка для очищения |
| 35 мм Чашка для клеточных культур | SPL | 20035 | Визуализационная |
| конфокальная чашка | SPL | 211350 | Визуализация |
| 1 мл шприц | Корейская вакцина Co., Ltd | 26G 1/2 | Обезболивание |
| Шприц 50 мл | Корейская вакцина Co., Ltd | 21G1 1/4 | Перфузия |
| Акриламид | Sigma-Aldrich | A3553 | Полимеризация (A4P0) |
| Ватман 3ММ бумага | Sigma-Aldrich | Z270849 | Промокательная бумага для удаления геля |
| Конфокальный микроскоп | Zeiss | LSM780 | Imaging |
| ZEN lite программное обеспечение | Zeiss | ZEN 2012 | Imaging |
| Перистальтический насос | Longerpump | BT100-1F | Перфузия |
| EasyGel | Lifecanvas Technologies | EasyGel | Тканевая система гибридизации геля |
Ссылки
- Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience. Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (201....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
