Бульон Microdilution в пробирке скрининга: легкий и быстрый метод для обнаружения новых противогрибковых соединений

Краткое содержание

Метод microdilution легко и адаптируемая бульон для скрининга противогрибковые соединения и экстрактов.

Аннотация

Грибковые инфекции стали важной медицинской состояние в последние десятилетия, однако количество доступных противогрибковых препаратов ограничено. В этом случае необходим поиск новых противогрибковых препаратов. Протокол, сообщили здесь подробно метод для экрана пептиды для их противогрибковые свойства. Он основан на тест восприимчивости microdilution бульон из руководящих принципов клинической и лаборатории Института стандартов (CLSI) M27-A3 с изменениями с учетом исследование антимикробных пептидов как потенциальных новых противогрибковых препаратов. Этот протокол описывает функционального анализа оценить деятельность противогрибковые соединений и могут быть легко изменены в соответствии любого конкретного класса молекул под следствием. Так как анализы выполняются в 96-луночных пластины с помощью небольших объемов, крупномасштабные скрининга может быть завершена в короткий промежуток времени, особенно если осуществляется в обстановке автоматизации. Эта процедура показывает, как стандартизированный и регулируемые клинический протокол может помочь скамейке работа стремлении улучшить терапии грибковых заболеваний новых молекул.

Введение

Грибковые инфекции стали важной медицинской проблемой в последние десятилетия, значительно увеличив обусловлено главным образом увеличением числа лиц с ослабленным иммунитетом как тех, кто проходит лечение рака и людей, живущих с ВИЧ/СПИДом или пересадки органов^1,2. Однако весьма ограниченный спектр доступных противогрибковых препаратов и увеличение числа сообщений о грибковых сопротивление их вклад основных проблем относительно терапии системных микозов³.

Потенциальный источник новых соединений, противогрибковые, антимикробных пептидов (AMPs), малые катионных пептидов, производимые многих организмов как часть их врожденной иммунной реакции на инфекции⁴. Тем не менее метод скрининга, чтобы проверить эти соединения против грибковых патогенов не нормируется. Различные процедуры были использованы для оценки Противогрибковая активность AMPs, иногда для же модель микроорганизма^5,6,7. Эти различия и отсутствие подробной информации в некоторые протоколы осложнить сравнений между соединений и препятствует воспроизводимость.

Одним из способов для стандартизации тестирования новых наркотиков кандидатов является придерживаться руководящих принципов, используемый для определения противогрибковые восприимчивость в клинических условиях, таких как клиническая и лаборатории Института стандартов (CLSI) M27-A3 руководящих принципов. Однако эти испытания противогрибковые чувствительность носят слишком ограничительный характер и не принимать во внимание изменения в метаболизме различных видов, как они были установлены только для нескольких агентов. Например они не принимают во внимание метаболические потребности не брожения дрожжей.

Этот протокол позволяет оценки деятельности перспективных соединений, противогрибковые и реализуется здесь для поиска противогрибковые пептиды. Он основан на тест восприимчивости microdilution бульон из руководящих принципов CLSI M27-A3 с изменениями, которые оптимизируют скрининга новых соединений^8,9. Эти изменения позволяют использовать небольшое количество смеси, различия в температуре или первоначальный посевным материалом и различные средства массовой информации для оптимального роста перед тестированием, одновременно стандартизируя результаты с использованием справочных противогрибковые препараты, как элементы управления. Этот метод, с использованием нескольких хорошо культуры пластин, позволяет быстро и надежно экран большое количество соединений.

Из-за присущего гибкости этот протокол может использоваться с различными классами химических соединений и против других микроорганизмов, с несколько адаптаций.

Протокол

1. решения и средства массовой информации

1. Готовить 2 средних 1640 X Розуэлл парк Мемориальный институт (RPMI)-фосфатный буфер (PBS), бульон декстрозы Sabouraud и Sabouraud декстроза агар согласно таблице 1.

2. грибковые посевным материалом условия роста

1. Храните все штаммов микромицетов как замороженные запасы в 35% глицерина при температуре-80 ° C, до тех пор, пока требуется.
2. Выполните следующие шаги перед каждой эксперимент.
   1. Для штаммов Candida albicans :
      1. Оттепель запасов флакон и передачи 200 мкл до 10 мл бульона декстрозы Sabouraud в стерильных 50 мл трубки из полипропилена с крышкой и культуры на ночь на 30 ° C с агитации (200 об/мин). Не забудьте наклонить трубки и оставьте крышку слегка открытой для улучшения аэрации культуры.
   2. Для Cryptococcus neoformans штаммы:
      1. Скрип замороженных поверхности штока флакона. Пластина клетки на Sabouraud декстроза агар пластин и инкубировать в течение 48 часов при температуре 30 ° C. После видимого роста отдельных колоний Держите пластины в холодильнике (4 ° C), запечатанный с парафином фильм на срок до 15 дней.
      2. Собирать среднего размера изолированной колонии от пластины с помощью стерильных зубочистку или стерильной пересевать цикла и прививать 10 мл бульона декстрозы Sabouraud в стерильных 50 мл Конические трубки. Инкубируйте около 24 ч при 30 ° C при агитации (200 об/мин).
      3. Не следует превышать 24 ч инкубации. Не забудьте наклонить трубки и оставьте крышку слегка открытой для улучшения аэрации. Это всегда хорошо, чтобы стандартизировать стадии роста клеток перед каждым тестом, поскольку это является одним из важных факторов, влияющих на устойчивость к противомикробным препаратам.
         Примечание: Оба грибы росли на 30 ° C для быстрого распространения в наших экспериментах, но температура может быть изменен для отражения целей исследования, например клинического лечения (37 ° C). Самое главное этот первоначальный инкубации время следует заранее создан для каждого грибковых изолировать и поддерживать на протяжении всех тестов, чтобы гарантировать воспроизводимость.
3. После микоз собирают клетки центрифугированием конические трубы на 1200 x g 5 мин при комнатной температуре. Отменить супернатант и добавляют 10 мл PBS.
4. Ресуспензируйте клетки и центрифуги снова на 1200 x g 5 мин при комнатной температуре.
5. Повторите PBS мыть и центрифугирования вдвое больше. После третьей стирки Ресуспензируйте клетки в 5 мл (в зависимости от размера гранул) 2 X RPMI 1640 среды.
6. Готовим 1 мл раствора 1: 100 или 1:1,000 разрежения в пробки microcentrifuge (в зависимости от мутности суспензию клеток).
7. Аликвота 10 мкл этой разрежения, поместите его в камере Горяева и подсчитать общее число клеток в четырех угловых квадрантах под микроскопом. Рассчитать концентрацию по формуле: (всего ячейки номер/4) x разрежения фактор x 10⁴ (камеры разрежения константа).
   1. Рассмотрим 100% жизнеспособность, если жизнеспособность графов и роста условия были систематически коррелирует для изолировать изучается.
      Примечание: Стандартизации и контроля качества графов жизнеспособность может быть сделано путем обратно покрытие в соответствии с Европейским комитетом по тестирования антимикробной чувствительности (EUCAST) противогрибковые минимум ингибирующее концентрации (MIC) метод для дрожжей¹⁰ .
   2. Если не было установлено корреляция роста/жизнеспособности для изоляции под исследования, измерения грибковых жизнеспособности путем подсчета живой клетки в Горяева с помощью красителей, которые выборочно цвета отмерших клеток, таких как phloxine B¹¹, Трипановый синий ¹², или Janus зеленый¹³. Используйте для этого протокола грибковых клеток, только если жизнеспособность населения на данный момент 90% или выше.
      Примечание: Dead/жив красители могут не работать хорошо с грибом выбора. Пожалуйста, проверьте их перед использованием. К примеру Трипановый синий краситель не хорошо работать с C. neoformans.
8. После этого, подготовить клеточных суспензий в 2 X RPMI 1640 средних (2 X настроен посевным материалом в среде RPMI 1640). Для 96-луночных планшетов рассмотреть объем 5 мл для каждой пластины.
   1. Для всех штаммов C. albicans готовят суспензию акций клеток 4 x 10³ клеток/мл. Эта концентрация составляет 2 X концентрации окончательного клеток в каждой скважины (2 x 10³ клеток/мл).
   2. Для штаммов C. neoformans Подготовьте запасов культуры клетки 2 x 10⁴ клеток/мл. Эта концентрация – дважды окончательный клетки концентрация в каждой скважине (1 х 10⁴ клеток/мл).
   3. Для других грибов тест с известным противогрибковые, какая концентрация будет идеально подходит для конкретного исследования по отношению к время инкубации. Учитывать время метаболизм и дублирования гриба.

3. пептидов (неизвестный агент)

1. Хранить лиофилизированный пептидов при-20 ° C и распустить их в деионизированной воде перед каждой эксперимент. Максимальный срок хранения раз растворяемый в воде будет зависеть от характера каждого пептида.
2. Подготовьте аликвоты дважды высокая концентрация окончательные испытания в assay (2 X). В идеале Подготовьте небольшое количество аликвоты с достаточно пептидные для одного использования времени избежать циклов замораживания оттаивания.
   Примечание: Выбор концентрации должны основываться на свойства пептида и литературе. Рекомендуется начать с около 100 мкм пептида, серийных разведений и затем уменьшить или увеличить этот диапазон концентраций в зависимости от полученных результатов.

4. Справка противогрибковые препараты (позитивные элементы управления)

1. Для тех, кто разводят в воде: подготовить 2 X решение высокой концентрации анализа (см. раздел 5: противогрибковая пробирного для разрежения шагов).
   1. Для штаммов C. albicans приготовляют раствор 128 мкг/мл флуконазола или 128 мкг/мл caspofungin. Концентрация пластины для обоих будет 64 мкг/мл.
   2. Для штаммов C. neoformans приготовляют раствор 32 мкг/мл амфотерицин B (водорастворимые раствор). Концентрация плита будет 16 мкг/мл.
      Примечание: Обычно амфотерицин B разбавляется в диметилсульфоксида (ДМСО), поскольку это противогрибковое, плохо растворим в воде. Однако есть водорастворимый амфотерицин B препараты коммерчески доступных.
2. Для противогрибковые препараты, растворяется в органических растворителях: подготовить 100 X Стоковый раствор в ДМСО, а затем разбавляют до 10 X в воде для использования.
   Примечание: Таким образом, в колодец, конечная концентрация ДМСО не будет превышать 1%. Ну, где гриб будет расти в средствах массовой информации, содержащей 1% ДМСО, как элемент управления необходим, учитывая, что некоторые грибки не переносят хорошо эта концентрация растворителя. Помните, что ДМСО фоточувствительных, так крышка с фольгой или поместить его в темной камере в течение инкубационного периода.

5. противогрибковые Assay

Примечание: В пробирке противогрибковые анализы выполняются основе теста восприимчивости microdilution бульон из руководящих принципов клинической и лаборатории Института стандартов (CLSI) M27-A3 с некоторыми изменениями.

1. Подготовить два раза серийный разбавления каждого пептида и контроля противогрибковые в полистирола 96-луночных планшетов в окончательный объем 50 мкл.
   1. С помощью пипетки добавить 100 мкл противогрибковые/пептида в 2 X концентрации высоких желаемого конечная концентрация в столбцы в строки 1-3, а.
   2. С помощью многоканальных дозаторов, 50 мкл стерильной воды в других скважин, в строках B х.
   3. Удаление 50 мкл скважин с самой высокой концентрацией (ряд А), передать следующей и следующей концентрации (строка B) и гомогенизации.
   4. Повторите указанные выше шаги до колодца с низкой концентрацией и отменить 50 мкл этой скважины (строка H). Оставьте столбцы 11 и 12 (строки A, B, C) с только воду для пустой элемент управления или отрицательный/роста управления.
   5. 50 мкл 2 X скорректированного посевным материалом в RPMI 1640 среднего для каждой скважины (колонки 1-3 плюс колонка 11 (отрицательный/роста управления)); конечная концентрация для C. albicans будет 2 x 10³ клеток/мл и конечная концентрация для штаммов C. neoformans будет 10⁴ клеток/мл.
   6. Подготовить пустые элементы (50 мкл воды + 50 мкл 2 X RPMI 1640 среднего без клетки) и отрицательным/роста управления (50 мкл воды + 50 мкл скорректированы посевным материалом 2 X RPMI 1640 среднего без противогрибковый) и нагрузки на знаке хорошо как описано выше.
2. Повторите процедуру для каждого соединения для проверки и элемент выбранной противогрибковые (колонки 4-10).
   Примечание: Серийных разведений может осуществляться вертикально как эксперимент ниже, или горизонтально на пластине (т.е., если количество разведений данного соединения/экстракт, который нуждается в проверке восемь или более).
   1. Если соединений, ссылка Фоточувствительные наркотиков, или любой из его компонентов, выполнить пробу в снижение света, накладки с фольгой или место в темной камере во время инкубаций.
3. Рассмотрим следующие дополнительные рекомендации.
   1. Печать пластины с четкой накладка, которая позволяет обмен газа, как это помогает уменьшить испарение.
   2. Поместите пластины в камере влажного; Это также поможет уменьшить испарение.
4. Инкубируйте пластины при 37 ° C для 24 h или 48 h для всех штаммов C. albicans и 48 ч с 200 rpm, пожимая для C. neoformans. Нижней Окончательный объем (100 мкл) гарантирует, что не побочное происходит.
   Примечание: Было отмечено никакого существенного различия между MIC чтений на 24 ч и 48 h для штаммов C. albicans . Тем не менее чтений на 48 ч легче визуализировать.
5. Соблюдайте все скважины, при содействии инвертированным оптическим микроскопом, инкубационный период до и после проверки изменений в морфологии, а также проверить наличие признаков загрязнения.
   Примечание: Чтений можно сделать визуально и сфотографировали в конце эксперимента. Перед каждой чтении, гомогенизировать слегка пластину. Читает также может выполняться путем измерения своих ОД на 600 Нм, если ячейка сгустки или филаментацию не наблюдалось.
6. Выполните эксперименты по крайней мере три раза на отдельные даты.

Результаты

MIC определяется как низкая концентрация антимикробной составные, который полностью подавляет видимый рост плесени в конце инкубационного периода. Поскольку цель настоящего Протокола заключается в том, иметь быстрый метод для экрана потенциальных противогрибковые препараты, любой колодец с ясно СМИ похож на пустой скважины считается положительный результат, тогда как любой колодец с мутность аналог отрицательный/роста управления скважин считается отрицательным. Однако если есть интерес к ...

Обсуждение

Microdilution тесты могут анализировать потенциальные Противогрибковая активность целевого объекта соединения, с помощью небольших количествах соединения и в то же время протестировать его в диапазоне концентраций. Соответственно этот протокол рекомендуется в качестве первого шага в скрининга для потенциальных новых противогрибковых соединений. Здесь представлены протокол основан на протоколе M27-A3, первоначально предназначенных для помощи в выборе противогрибковой терапии в клиниках и может быть адаптирована к различны...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
<сильно>среды и реагенты
RPMI 1640 среда с L-глутамином, без бикарбоната натрия	Thermo Fisher	31800-022
3-(N-morpholino) пропансульфоновая кислота (MOPS) (o que a gente США tem um só dio, completa o nome dele please)	Sigma-Aldrich		Используйте для буферизации 2X RPMI medium
Sodium chloride (NaCl)	Dinâ слюда	1528-1	137 мМ для фосфатно-солевого буферного раствора (PBS)
Хлорид калия (KCl)	J.T.Baker	3040-01	2,7 мМ для фосфатно-солевого буфера (PBS)
Двухосновной фосфат натрия (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	V000129	10 мМ для фосфатного буферного раствора (PBS)
Дигидрофосфат калия (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	60230	2 мМ для фосфатного буферного раствора (PBS)
BD Difco Sabouraud отвар декстрозы	BD	238230
BD Difco Sabouraud декстроза агар	BD	210950
Глицерин	Sigma-Aldrich	V000123	35% для (soluç ã o de estoque? Криопреконсерв; ã о?)
Стерильная вода			Para diluiç ã o das drogas na diluiç ã o серияда
<стронг>противогрибковые препараты
амфотерицин B	сигма-олдрич	A2942
флуконазол	сигма-олдрич	f8929
каспофунгин	сигма-олдрич	PHR1160
<стронг>пластики
50 мл коническая трубка	Sarstedt	62.547.254
Тарелка петри	J.Prolab	0304-5
96 луночная пластина	Corning	3595
Резервуар для стерильного раствора	KASVI	K30-208	Использование для пипетирования растворов с помощью многоканального пиппет
<прочного>Оборудование и другие материалы
Оптический микроскоп	Nikon	E200MV
Центрифуга	Thermo Fisher	MegaFuge 16R
Инкубатор	Ethik Technology	403-3D	установлен на 37° C
шейкер	New Brunswick Scientific	Excella E25	установлен на 37° C, 200 об/мин
Камера для подсчета клеток, Neubauer	BOECO Германия	BOE 13
Многоканальный пипетка	HTL	5123