Методическая статья

Проверка роли физических сил в начале Чик эмбриональных морфогенез

DOI:

10.3791/57150

⸱

5 июня 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Thayer School of Engineering, Dartmouth College, 2Department of Bioengineering, University of Pennsylvania

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол, представляя набор новых экс ovo экспериментов и физического моделирования подходов для изучения механики морфогенеза во время ранних Чик эмбриональных мозга кручения.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эмбриональное развитие традиционно рассматривается с точки зрения генетики биомолекулярных, но становится все более признается основополагающее значение механики в морфогенеза. В частности зародышевых куриных сердца и мозга трубка, которая пройти радикальные морфологические изменения, как они развиваются, являются среди основных кандидатов для изучения роли физических сил в морфогенеза. Прогрессивные вентральной изгиб и вправо кручения трубчатых зародышевых куриных мозга происходит на ранней стадии орган уровня слева направо асимметрией в Чик эмбрионального развития. Vitelline мембрана (VM) ограничивает спинной стороне зародыша и был вовлечен в предоставлении сил необходимо побудить кручения развивающегося мозга. Здесь мы представляем сочетание новых экс ovo экспериментов и физического моделирования для выявления механики мозга кручения. На этапе гамбургер-Гамильтон 11, собирают и культивировали эмбрионов ex ovo (в средствах массовой информации). VM впоследствии удаляется с помощью вытащил капиллярной трубки. Контроля уровня жидкости и подвергая эмбриона к интерфейсу жидкости воздуха, поверхностного натяжения жидкости средств массовой информации может использоваться для заменить механические роли виртуальной машины. Микрохирургия эксперименты были также изменить положение сердца, чтобы найти итоговое изменение в хиральности мозга кручения. Результаты от этого протокола иллюстрируют основные роли механики в автошколах морфогенеза.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Современная биология развития исследований в значительной степени сосредоточена на понимание развития с точки зрения молекулярной генетики1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. как известно, что физические явления играют центральную роль в морфогенеза, или поколение биологической форме14,,1516,17; Однако конкретные механические механизмы развития остаются значительной степени неизученными. Вентральной прогиба и вправо кручения примитивный мозг трубки после того, как гамбургер-Гамильтон этап 11 (HH 11)18 являются два основных процессов, которые способствуют эмбриональной формы изменения19,20. В частности физический механизм, лежащие в основе при кручении развитие эмбриональных мозга по-прежнему неполно понял.

Среди ранних морфогенетических событий слева направо (L-R) асимметрия в развитие эмбриональных кручения в куриных эмбрионов. Когда процесс L-R асимметрия возмущенных, врожденных дефектов, например, транспозиция, изомерияили heterotaxia будет происходить21.
Здесь мы представляем протокол, который сочетает в себе экс ovo эксперименты22,23 физического моделирования для характеристики механических сил во время раннего развития эмбриональной мозга. Цель метода заключается в идентификации механических сил, ответственных за мозг кручения и факторы, которые влияют на степень кручения во время раннего развития12. На основании экспериментальных наблюдений, что vitelline мембраны (VM) сдерживает спинной стороне зародыша, мы предположили, что VM обеспечивает силу необходимо побудить кручения развивающегося мозга. Таким образом в этом методе, мы удалили часть VM, который охватывает области мозга, чтобы выяснить влияние на мозг кручения. Кроме того для подтверждения механические роли ВМ и представить оценку сил, необходимых для кручения мозга, которое не было сделано ранее использовался метод нанесения поверхностного натяжения жидкости. Измерение силы во время эмбрионального морфогенеза является сложной задачей. Примечательно в первопроходца исследования, Campàs и коллегами24 разработал новый метод для количественного определения сотовой подчеркивает, используя введенный microdroplets. Тем не менее этот метод был ограничен для измерения силы на клеточном уровне, следовательно не применимо к датчик силы на уровне тканей или организма. Частично восполнить этот пробел был разработан протокол, представленных в настоящем документе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка тканевой культуры средств массовой информации

  1. Используйте бутылка 0,5 Л Дульбекко изменение орла среднего (DMEM) с 4,5 г/Л глюкозы, натрия бикарбонат и L-глютамина в качестве базы для культуры средств массовой информации.
  2. В стерильные Ламинарный шкаф добавьте 0,5 Л DMEM 10 мл антибиотиков.
  3. С помощью стерильной пипеткой, 50 мл раствора антибиотики DMEM передать стерильные 50 мл Конические трубки.
  4. Добавьте 50 мл сыворотки куриных решение оставшихся антибиотики DMEM в бутылке 0,5 Л в стерильных Худ.
  5. Хранить окончательное решение (именуемый далее куриных культуры СМИ [CCM]) в 50 мл аликвоты Конические трубки при-20 ° C.

2. яйца инкубации

  1. Используйте тонкий салфетки с 70% этанола для очистки оплодотворенной конкретного возбудителя бесплатно белый леггорн куриные яйца. Организовать яйца в продольной ориентации на держатели.
  2. Включите Яйцо инкубатор для задания целевой температурой 37,5 ° C и поддерживать влажность в 48-55%. Влажность воздуха контролируется путем добавления соответствующее количество воды в инкубаторе.
  3. Инкубируйте яйца в HH11-13, примерно 40-44 ч.
  4. Пусть яйца остыть при комнатной температуре примерно 15-30 мин до распыления/очистки с 70% этиловом спирте.

3. Потяните стеклянные капилляры

  1. Смонтируйте 10 см длинные стеклянные капиллярные трубки с наружным диаметром 1,0 мм и внутренним диаметром 0,5 мм на микропипеткой съемник.
  2. Установите тепла и тянуть параметры 750 и 400, соответственно. Нажмите кнопку тянуть вывести капиллярную трубку в тонких игл.

4. Фильтровальная бумага перевозчик метод

  1. Вырежьте круги около 3 см в диаметре из фильтр-бумаги.
  2. Вырежьте прямоугольник примерно 1 см на 2 см от круга с помощью перфоратора. Убедитесь в том удалить все выступающие или острых углов.

5. эмбриона лесозаготовок и подготовка

  1. Трещины яйца от дна, тянуть за исключением корпуса мягко и тщательно хранение содержимого в чашке Петри 150 мм x 15 мм. Для обеспечения стороне эмбриона является вверх, держать яйца в ту же ориентацию, которую они были инкубировали при их растрескивание.
  2. Удаление тонкого альбумина, используя одноразовые пипетки Пастера.
  3. Отдельные толстые альбумина от желтка, используя тупой закончился щипцами. Убедитесь, что толстые альбумина была удалена, слегка соскоб в верхней части желток с тупым закончился щипцами.
  4. Используйте штраф наконечником щипцы для центра и поместите кольцо фильтровальная бумага эмбриона, соответствия длинной оси кольца с длинной оси эмбриона.
  5. Вырежьте желток, окружающих кольцо фильтр-бумаги с ножницами.
  6. Потяните кольцо и эмбрион от желтка в наклонный направлении сайт, где первый сократить желток.
  7. Промойте эмбрионы в двух последовательных 100-мм блюда с комнатной температуре 1 x-фосфатный буфер (PBS).
  8. Поместите кольцо фильтровальной бумаги в чашку Петри 35-мм сначала. Затем поместите спинной стороне зародыша вверх на фильтровальной бумаге уже в 35-мм Петри.
  9. Поместите кольцо из нержавеющей стали на вершине сэндвич фильтровальной бумаги. Убедитесь в том, чтобы не повредить эмбриона.
  10. Добавьте 3 мл ранее подготовленных СКК в каждой чашке Петри.
  11. Удалите VM каждого эмбриона, слегка скимминга вытащил капиллярного иглы в верхней части эмбриона и пилинг от VM, начиная с переднего конца (прямо над переднего мозга) и приступить к Хорда (Рисунок 1A).
  12. Место восемь 35-мм Петри в одно блюдо 150 мм, который был выстроен с водой насыщенных деликатную задачу салфетки (для поддержания влажности).
  13. Место 150-мм Петри в закрывающемся полиэтиленовом пакете затем заполнить мешок с газовой смеси состоит из 95% O2 и 5% CO2.
  14. Уплотнения мешок и поместите его в инкубаторе 37,5 ° C.
  15. Инкубируйте эмбрионов для дополнительных 27 h до HH15-HH16 (рис. 1B).

6. склонение поверхностное натяжение

  1. Удаление эмбрионов из инкубатора и использовать систему оптическая когерентная томография (Окт) для их изображения. Использование OCT для определения угла при кручении нервной трубки (NT) (Рисунок 2).
  2. Трансфер эмбрионов в световой микроскоп и визуализировать при 10-кратном. Использование пипетки 200 мкл постепенно удалить 0,2 мл СМИ из Петри.
  3. Принять brightfield изображения на каждом интервале наблюдать эффекты интерфейса медиа воздух на эмбрион.
  4. Удалите средства массовой информации, до тех пор, пока поверхностное натяжение через эмбриона индуцирует кручения (рис. 1 c).
  5. Изображения эмбрионов, с помощью OCT системы еще раз установить окончательный крутильных угол для сравнения для управления эмбрионов.  Примечание: Ярко поле изображения были приобретены с использованием рассечения микроскопа. Оптическая когерентная томография системы с помощью прилагаемой микроскопа была использована для приобретения стеки изображений поперечного сечения живой эмбрионов. Изображения были получены в домене сканирования3 3 x 10 x 3 мм, затем обработки изображений программное обеспечение. И наконец физическая модель изображения были взяты с цифровой зеркальный фотоаппарат.

7. физическое моделирование сил поверхностного натяжения/VM

  1. Разработать упрощенный 3D геометрии, которая напоминает эмбрион между HH14-17 в коммерческих моделирования программного обеспечения (рис. 3A).
  2. Дизайн негативные формы 3D геометрии в коммерческих 3D компьютерная графика программное обеспечение.
  3. Использование 3D-принтер загружен с 1,75 мм акрилонитрил бутадиен стирола накаливания для 3D печати разработан плесень, в формате stereolithographic (.stl).
  4. Для приведения плесень, силиконовые резины эластомерные компоненты A и B в равных частях смешать и залить смесь в форму оперативно; Установите литья плесень вылечить при комнатной температуре в течение 12 ч (рис. 3B).
  5. Марк физической модели эмбриона вдоль NT на спинной стороне визуализировать кручения.
  6. Используйте coverslip для репликации усилие в 3D физическая модель, которая имитирует VM или поверхностного натяжения (рис. 3D).
  7. Вставьте целый ряд жестких провода одинаковой длины в сторону физической модели. После coverslip оказывает внешней силы на модель мозга, провода стать наклонена под углом, который зависит от местоположения. Определите угол поворота, arctan проектная длина над первоначальной длины каждого провода (Рисунок 3E).

8. изменяя направление цикла сердца

  1. Следуйте инструкциям в 3.1 и 3.2 для получения запрашиваемой капиллярную трубку.
  2. Следуйте инструкциям в разделе 5.1 через 5.10 подготовить эмбриона.
  3. Используйте пару щипцов для флип фильтровальная бумага, так что эмбрион становится вентральной стороне вверх.
  4. Используйте вытащил капиллярная трубка для разрезать щели в splanchnopleure (SPL) мембраны.
  5. Используйте капиллярную трубку приложить механической силы, чтобы подтолкнуть сердце с правой стороны на левую сторону.
  6. Следуйте инструкциям в 5.12 через 5.15 наблюдать изменение торсионного.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании VM эмбриона на HH11 был удален из переднего конца к грудной прогиба. Эмбрионы были образы с помощью OCT системы. На данном этапе кручения мозга трубки не запущен (рис. 1A). После того, инкубировали HH15-16, эмбрионы с их VM удалены выставлены сокращение мозга трубки кручения, около 35 градусов (рис. 1B), по сравнению с контролировать эмбрионов, которые exhibit кручения около 90 градусов. Когда на уровне средст...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В то время как физические явления играют неотъемлемую роль в морфогенеза26,27,28,29,30, конкретные механические механизмы, наряду с координации механических и молекулярные механизмы, остаются в значительной степени неизученными. Известно, что брюшной прогиба и вправо кручения примитивных мозга являются два центральных процессов, влияющих на ранних эмбриональны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют отсутствие конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

З отмечает поддержку от Фонда Дартмаут запуска и Бранко Вайс - общество для науки стипендий, ведении ETH Zurich. Авторы благодарят Drs. Ларри A. Taber, Бенжамин A. Филы, го Qiaohang и Yunfei Ши полезные обсуждения, а также анонимных рецензентам для комментариев. Этот материал основан на работе, поддержке национальной науки фонд исследовательских стипендий под Грант № DGE-1313911. Любые мнения, выводы и выводы или рекомендации, выраженные в этом материале являются те из авторов (s) и не обязательно отражают взгляды национального научного фонда.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Оплодотворенные специфические безпатогенные яйца белых леггорнов курицыCharles River
Оптический когерентный томограф МикроскопThorlabsGAN220C1
силиконовым эластомеромSmooth-On, Inc.EcoFlex 00-50
Препарирующий микроскопLeicaMZ8
Dulbecco' s Модифицированный Eagle' s Medium (DMEM)Lonza12-604F
АнтибиотикиSigmaP4083
Сыворотка для цыплятSigmaC5405
Съемник микропипетокSutter InstrumentModel P-30
Фильтровальная бумагаWhatman5202-110
Фосфатный буферный раствор (PBS)Corning21-040-CV
Comsol MultiPhysicsПрограммное обеспечение для
3DRhino 5
Микроскоп с OCTNikon FN1
Цифровой однообъективный зеркальный фотоаппаратEOS Бунтарь T3i
компьютерной графики Comsol

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Taber, L. A. Biomechanics of Growth, Remodeling, and Morphogenesis. Appl. Mech. Rev. 48, 487-545 (1995).
  2. Wyczalkowski, M. A., Chen, Z., Filas, B. A., Varner, V. D., Taber, L. A. Computational models for mechanics of morphogenesis. Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 96, 132-152 (2012).
  3. Savin, T., et al. On the growth and form of the gut. Nature. 476, 57-62 (2011).
  4. Gjorevski, N., Nelson, C. M. The mechanics of development: Models and methods for tissue morphogenesis. Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 90, 193-202 (2010).
  5. Shyer, A. E., et al. Villification: how the gut gets its villi. Science. 342, 212-218 (2013).
  6. Ambrosi, D., et al. Perspectives on biological growth and remodeling. Journal of the Mechanics and Physics of Solids. 59, 863-883 (2011).
  7. Chen, Z., Majidi, C., Srolovitz, D. J., Haataja, M. Tunable helical ribbons. Appl. Phys. Lett. 98, (2011).
  8. Gerbode, S. J., Puzey, J. R., McCormick, A. G., Mahadevan, L. How the cucumber tendril coils and overwinds. Science. 337, 1087-1091 (2012).
  9. Armon, S., Efrati, E., Kupferman, R., Sharon, E. Geometry and mechanics in the opening of chiral seed pods. Science. 333, 1726-1730 (2011).
  10. Filas, B. A., et al. A potential role for differential contractility in early brain development and evolution. Biomech. Model. Mechanobiol. 11, 1251-1262 (2012).
  11. Xu, G., et al. Axons pull on the brain, but tension does not drive cortical folding. J. Biomech. Eng. 132, 71013(2010).
  12. Chen, Z., Guo, Q., Dai, E., Forsch, N., Taber, L. A. How the embryonic chick brain twists. J. R. Soc. Interface. 13, (2016).
  13. Manca, A., et al. Nerve growth factor regulates axial rotation during early stages of chick embryo development. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2009-2014 (2012).
  14. Shi, Y., Yao, J., Xu, G., Taber, L. a Bending of the looping heart: differential growth revisited. J. Biomech. Eng. 136, 1-15 (2014).
  15. Shi, Y., et al. Bending and twisting the embryonic heart: A computational model for c-looping based on realistic geometry. Front. Physiol. 5, (2014).
  16. Taber, L. A. Morphomechanics: Transforming tubes into organs. Current Opinion in Genetics and Development. 27, 7-13 (2014).
  17. Hosseini, H. S., Beebe, D. C., Taber, L. A. Mechanical effects of the surface ectoderm on optic vesicle morphogenesis in the chick embryo. J. Biomech. 47, 3837-3846 (2014).
  18. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev. Dyn. 88, 49-92 (1951).
  19. Shi, Y., Varner, V. D., Taber, L. a Why is cytoskeletal contraction required for cardiac fusion before but not after looping begins? Phys. Biol. 12, 16012(2015).
  20. Garcia, K. E., Okamoto, R. J., Bayly, P. V., Taber, L. A. Contraction and stress-dependent growth shape the forebrain of the early chicken embryo. J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 65, 383-397 (2017).
  21. Faisst, A. M., Alvarez-Bolado, G., Treichel, D., Gruss, P. Rotatin is a novel gene required for axial rotation and left-right specification in mouse embryos. Mech. Dev. 113, 15-28 (2002).
  22. Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. a, Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. J. Vis. Exp. (44), (2010).
  23. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Dev. Dyn. 220, 284-289 (2001).
  24. Campàs, O., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nat. Methods. 11, 183-189 (2014).
  25. Schierenberg, E., Junkersdorf, B. The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo. Roux's Arch. Dev. Biol. 202, 10-16 (1992).
  26. Chuai, M., Weijer, C. J. The Mechanisms Underlying Primitive Streak Formation in the Chick Embryo. Current Topics in Developmental Biology. 81, 135-156 (2008).
  27. Voronov, D. A., Alford, P. W., Xu, G., Taber, L. A. The role of mechanical forces in dextral rotation during cardiac looping in the chick embryo. Dev. Biol. 272, 339-350 (2004).
  28. Raya, A., Izpisua Belmonte, J. C. Unveiling the establishment of left-right asymmetry in the chick embryo. Mechanisms of Development. 121, 1043-1054 (2004).
  29. Voronov, D. A., Taber, L. A. Cardiac looping in experimental conditions: Effects of extraembryonic forces. Dev. Dyn. 224, 413-421 (2002).
  30. Chen, Z., Huang, G., Trase, I., Han, X., Mei, Y. Mechanical Self-Assembly of a Strain-Engineered Flexible Layer: Wrinkling, Rolling, and Twisting. Phys. Rev. Appl. 5, (2016).
  31. Manner, J., Seidl, W., Steding, G. Formation of the cervical flexure: an experimental study on chick embryos. Acta Anat. (Basel). 152, 1-10 (1995).
  32. Ware, M., Schubert, F. R. Development of the early axon scaffold in the rostral brain of the chick embryo. J. Anat. 219, 203-216 (2011).
  33. Ramasubramanian, A., et al. On the role of intrinsic and extrinsic forces in early cardiac S-looping. Dev. Dyn. 242, 801-816 (2013).
  34. Hoyle, C., Brown, N. a, Wolpert, L. Development of left/right handedness in the chick heart. Development. 115, 1071-1078 (1992).
  35. Nerurkar, N. L., Ramasubramanian, A., Taber, L. A. Morphogenetic adaptation of the looping embryonic heart to altered mechanical loads. Dev. Dyn. 235, 1822-1829 (2006).
  36. Levin, M. Left-right asymmetry and the chick embryo. Semin. Cell Dev. Biol. 9, 67-76 (1998).
  37. Roebroek, A. J., et al. Failure of ventral closure and axial rotation in embryos lacking the proprotein convertase Furin. Development. 125, 4863-4876 (1998).
  38. Peebles, D. M., et al. Magnetic resonance proton spectroscopy and diffusion weighted imaging of chick embryo brain in ovo. Dev. Brain Res. 141, 101-107 (2003).
  39. Zhu, L., et al. Cerberus regulates left-right asymmetry of the embryonic head and heart. Curr. Biol. 9, 931-938 (1999).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ex ovo

Похожие статьи