Цель Протокола заключается в создании модели воспалительных человеческой десны в пробирке. Эта модель ткани совместно культивируют три типа клеток человека, HaCaT кератиноцитов, десневые фибробластов и THP-1 макрофагов, трехмерные условиях. Эта модель может применяться для расследования периодонтальных заболеваний, таких как гингивит и пародонтит.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Трехмерные воспалительных тканей человека эквиваленты десны
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Болезни пародонта (таких как гингивит и пародонтит) являются ведущими причинами потери зубов у взрослых. Воспаление десен является основополагающим физиопатологические заболеваний пародонта. Текущие экспериментальные модели заболеваний пародонта были установлены в различных видов животных. Однако физиопатологические животных моделей отличается от людей, что делает его трудным для молекулярных и клеточных механизмов анализа и оценки новых лекарств для заболеваний пародонта. Здесь мы представляем подробный протокол для реконструкции воспалительных тканей человека эквиваленты десны (iGTE) в пробирке. Мы сначала построить эквиваленты человеческих тканей десны (ГТД), используя два типа клеток человека, включая десневой фибробластов (HGF) и эпидермальных кератиноцитов человеческой кожи (HaCaT), трехмерные условиях. Мы создаем модель раны с помощью ткани дырокол пробивать отверстие в GTE. Далее, человека THP-1 моноцитов, смешанного с коллагеном гель вводят в отверстие в GTE. По adimistration 10 нг/мл phorbol 12-миристат 13-ацетата (PMA) за 72 ч, THP-1 клетки дифференцированной в макрофагов в форме воспалительных очагов в GTE (iGTE) (IGTE также может быть stumilated с 2 мкг/мл липополисахаридов (LPS) для 48 h инициировать воспаление ). IGTE-первый в vitro модель воспалительных десны с использованием клеток человека с трехмерной архитектурой. IGTE отражает основные патологические изменения (immunocytes деятельность, внутриклеточных взаимодействий между fibryoblasts, эпителиальные клетки, моноциты и макрофаги) в заболеваний пародонта. GTE, раненых GTE и iGTE могут использоваться в качестве универсальных инструментов для изучения заживление ран, регенерации тканей, воспаление, ячейке взаимодействия и экран потенциальных лекарственных средств для заболеваний пародонта.
Введение
Болезни пародонта являются основной причиной потери зубов у взрослых. Гингивит и пародонтит являются наиболее распространенных заболеваний пародонта. Оба представляют биопленки опосредованной острые или хронические воспалительные изменения в десны. Гингивит характеризуется острого воспаления, тогда как периодонтит обычно представляет как хроническое воспаление. На уровне гистологические бактериальных компоненты запуска активации иммунных клеток, таких как макрофагов, лимфоцитов, плазматические клетки и тучные клетки1,2. Эти клетки иммунной системы, особенно макрофаги, взаимодействуют с местными клеток (включая....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этот протокол предназначен для создания человека десневой ткани эквиваленты, гингивального заживления и гингивит моделей. Кожа человека эпидермальных кератиноцитов (HaCaT) были любезно предоставил от профессор Норберт Fusenig E. Deutsches Krebsforschungszentrum (Хайдельберг, Германия)7. Десневой фибробластов (HGFs) были изолированы от десневой ткани согласно ранее опубликованные протоколы8. Информированное согласие было получено заранее, и исследования был утвержден в соответствии с руководящими принципами, установленными Комитетом по вопросам этики, Nippon стоматологический университет Школа жизни стоматологии в Токио (....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
HaCaT ячеек типичные кератиноцитов морфология при фазово контрастной микроскопические наблюдения (рис. 2A). Сканер электрона микроскопических изображений (SEM) показал, что HaCaT клеток поверхности были охвачены многие микроворсинки. Межклеточные соединения между HaCaT клетки были опосредовано мембранных процессов (рис. 2B). HaCaT клетки выразил десневой эпителия маркер K8/1814, указав, что клетки HaCaT по.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол основан на методы создания эквиваленты десневой ткани и подкожно-жировой эквиваленты, описанные в предыдущих докладах8,21,22. Хотя это простой и легкий метод, некоторые шаги требуют особого внимания. К примеру коллаген смесь должны храниться на льду до использования, чтобы избежать образования геля в решении. При добавлении коллаген смесь в культуре вставляют, убедитесь, что решение было впрыснуто в центре вставки,.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют никакого конфликта интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана в части японского общества для поощрения науки (JSP) субсидий для научных исследований (26861689 и 17 K 11813). Авторы хотели бы поблагодарить г-н Натаниел Грин для корректуры.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Коллаген типа I-A | Nitta Gelatin Inc | Для изготовления дермы GTE | |
| MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 11900073 | Cell Culture medium |
| Cell Culture Insert (для 24-луночного планшета), размер пор 3,0 μ м | Корнинг, Инк. | 353096 | Для культуры тканей |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Реактив для клеточных культур |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31600034 | Среда для клеточных культур |
| Замена сыворотки KnockOut Thermo | Fisher Scientific | 10828028 | Реактив для клеточных культур |
| Тканевый перфоратор | Shibata system service co., LTD | SP-703 | Для пробивка отверстий в GTE |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 31800022 | Среда для культивирования клеток |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | Для иммуноокрашивания |
| Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain) | Thermo Fisher Scientific | R37605 | Для мечения ядер |
| Флуоресцентная среда для монтажа Dako | Для монтажа образцов после иммуноокрашивания | ||
| Антитело к цитокератину 8+18 [5D3] | abcam | ab17139 | Для идентификации эпителия |
| Сканирующий электронный микроскоп | Hitachi, Ltd. | HITACHI S-4000 | Для наблюдения за рельефом и составом поверхности образцов |
| Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия | LSM 700; Карл Цейсс Микроскопия Ко., Лтд. | LSM 700 | Для наблюдения за иммунофлуоресцентным окрашиванием образцов |
| Антитело Антицитокератин 19 | abcam | ab52625 | Для идентификации эпителия |
| Антитело к виментину | abcam | ab92547 | Для идентификации фибробластов и активированных макрофагов |
| Антитело Anti-TE-7 | Millipore | CBL271 | Для идентификации фибробластов в дерме |
| Anti-CD68 антитело | Sigma-Aldrich | SAB2700244 | Для идентификации макрофагов |
| Антитела к CD14 человека | R& D Systems | MAB3832-SP | Для идентификации макрофагов |
| Alexa Fluor 594-конъюгированное вторичное антитело козы против кролика | Thermo Fisher Scientific | A11012 | Для иммунофлуоресцентного окрашивания |
| Alexa Fluor 488-конъюгированное вторичное антитело козы против мыши | Thermo Fisher Scientific | A11001 | Для иммунофлуоресцентного окрашивания |
| EVOS FL Система визуализации клеток | Thermo Fisher Scientific | Для наблюдения за иммунофлуоресцентным окрашиванием | |
| образца клеток THP-1 | Riken BRC | cell bank RCB1189 | Для получения iGTE |
| PMA (Phorbol 12-myristate 13-ацетат) | Sigma-Aldrich | P8139 | Для дифференцировки клеток THP-1 |
Ссылки
- Cekici, A., Kantarci, A., Hasturk, H., Van Dyke, T. E. Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease. Periodontology 2000. 64 (1), 57-80 (2014).
- Hasturk, H., Kantarci, A., Van Dyke, T. E. Oral Inflammatory Diseases a....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
