Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Трехмерные воспалительных тканей человека эквиваленты десны

9.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57157

⸱

3 апреля 2018 г.

 ,  , 
1Department of Pharmacology, The Nippon Dental University, 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, The Nippon Dental University Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Цель Протокола заключается в создании модели воспалительных человеческой десны в пробирке. Эта модель ткани совместно культивируют три типа клеток человека, HaCaT кератиноцитов, десневые фибробластов и THP-1 макрофагов, трехмерные условиях. Эта модель может применяться для расследования периодонтальных заболеваний, таких как гингивит и пародонтит.

Аннотация

Болезни пародонта (таких как гингивит и пародонтит) являются ведущими причинами потери зубов у взрослых. Воспаление десен является основополагающим физиопатологические заболеваний пародонта. Текущие экспериментальные модели заболеваний пародонта были установлены в различных видов животных. Однако физиопатологические животных моделей отличается от людей, что делает его трудным для молекулярных и клеточных механизмов анализа и оценки новых лекарств для заболеваний пародонта. Здесь мы представляем подробный протокол для реконструкции воспалительных тканей человека эквиваленты десны (iGTE) в пробирке. Мы сначала построить эквиваленты человеческих тканей десны (ГТД), используя два типа клеток человека, включая десневой фибробластов (HGF) и эпидермальных кератиноцитов человеческой кожи (HaCaT), трехмерные условиях. Мы создаем модель раны с помощью ткани дырокол пробивать отверстие в GTE. Далее, человека THP-1 моноцитов, смешанного с коллагеном гель вводят в отверстие в GTE. По adimistration 10 нг/мл phorbol 12-миристат 13-ацетата (PMA) за 72 ч, THP-1 клетки дифференцированной в макрофагов в форме воспалительных очагов в GTE (iGTE) (IGTE также может быть stumilated с 2 мкг/мл липополисахаридов (LPS) для 48 h инициировать воспаление ). IGTE-первый в vitro модель воспалительных десны с использованием клеток человека с трехмерной архитектурой. IGTE отражает основные патологические изменения (immunocytes деятельность, внутриклеточных взаимодействий между fibryoblasts, эпителиальные клетки, моноциты и макрофаги) в заболеваний пародонта. GTE, раненых GTE и iGTE могут использоваться в качестве универсальных инструментов для изучения заживление ран, регенерации тканей, воспаление, ячейке взаимодействия и экран потенциальных лекарственных средств для заболеваний пародонта.

Введение

Болезни пародонта являются основной причиной потери зубов у взрослых. Гингивит и пародонтит являются наиболее распространенных заболеваний пародонта. Оба представляют биопленки опосредованной острые или хронические воспалительные изменения в десны. Гингивит характеризуется острого воспаления, тогда как периодонтит обычно представляет как хроническое воспаление. На уровне гистологические бактериальных компоненты запуска активации иммунных клеток, таких как макрофагов, лимфоцитов, плазматические клетки и тучные клетки1,2. Эти клетки иммунной системы, особенно макрофаги, взаимодействуют с местными клеток (включая десневой эпителиальных клеток, фибробластов, эндотелиальных клеток и остеобласты) результате воспалительных поражений тканей пародонта3,4. Были созданы экспериментальные модели заболеваний пародонта в различных видов животных, таких как крысы, хомячки, кролики, хорьки, клыки и приматов. Однако физиопатологические животных моделей отличается от людей, что делает его трудным для молекулярных и клеточных механизмов анализа и оценки новых лекарств заболеваний пародонта5. Совместное выращивание периодонтальной бактерий и монослоя человека устной эпителиальных клеток был использован для изучения механизма пародонта инфекции6. Тем не менее однослойная культур устные клеток не хватает трехмерной (3D) сотовой архитектуры неповрежденной ткани; Таким образом они не могут имитировать ситуации в пробирке .

Здесь 3D воспалительных тканей человека эквиваленты десны (iGTE) созданы для представления заболеваний пародонта в пробирке. Эта 3D модель заболеваний пародонта занимает промежуточное положение между монослоя клеточных культур и животных моделей. Три типа клеток человека, включая HaCaT кератиноцитов, десневые фибробластов и THP-1 макрофаги, совместно культивируемых на гель коллагена и стимулируется воспалительных инициаторов построить iGTE. IGTE тесно имитирует условия в vivo дифференцировки клеток, клеток взаимодействия и активация макрофагов в десны. Эта модель имеет множество возможных применений для наркотиков скрининг и тестирование новых фармакологических подходов в заболеваниях пародонта, а также для анализа молекулярных и клеточных механизмов в заживление ран, воспаления и регенерации тканей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол предназначен для создания человека десневой ткани эквиваленты, гингивального заживления и гингивит моделей. Кожа человека эпидермальных кератиноцитов (HaCaT) были любезно предоставил от профессор Норберт Fusenig E. Deutsches Krebsforschungszentrum (Хайдельберг, Германия)7. Десневой фибробластов (HGFs) были изолированы от десневой ткани согласно ранее опубликованные протоколы8. Информированное согласие было получено заранее, и исследования был утвержден в соответствии с руководящими принципами, установленными Комитетом по вопросам этики, Nippon стоматологический университет Школа жизни стоматологии в Токио (номер авторизации: НДУ-T2012-35). Протокол шаги 1-3 должны выполняться в капот культуры клеток.

1. Подготовка эквиваленты 3D человеческих тканей десны (ГТЭ) (рис. 1A)

  1. Mix коллаген типа-А гель с 10% сосредоточены MEM-альфа и 10% восстановления буфера (2,2 g NaHCO3 и 4.47 g HEPES в 100 мл 0,05 N NaOH) в 15 мл стерильной пробирке, закупорить. Держите смешанных коллагена раствор на льду до тех пор, пока используется.
  2. Место вставки 24-ну культуры (поры размер 3,0 мкм) в 24-ну плиту.
  3. Удаление HGFs из культуры поверхности с помощью 0,25% раствор трипсина ЭДТА. Приостановить клетки в 10 мл питательной среды A (MEM-Альфа + 20% FBS + 1% GlutaMAX). Подсчет ячеек с счетчик клеток Bürker-Тюрк.
    1. Извлечь желаемое количество клеток (1-5 x105 клеток/мл), а затем центрифуги для 4 мин на 190 x g.
    2. Приостановите клетки в смешанной коллагена раствор. Оставьте смесь на льду до следующего шага.
  4. Добавьте 0,5 мл смеси клетки коллаген (0,5 – 2,5 x 105 клеток/а) в культуре вставляют без каких-либо пузырей. Инкубируйте смесь для 10 – 30 мин в атмосфере увлажненный с 5% CO2 при 37 ° C для коагуляции смесь в гель.
    Примечание: Добавьте смесь коллагена в центр культуры Вставка, чтобы избежать неравные формирования коллагена геля.
  5. Добавьте 1 мл питательной среды в колодец и 0,5 мл в insert. Инкубировать культуры пластина для 24 час или ночь в атмосфере увлажненный с 5% CO2 при 37 ° C.
  6. Удалите HaCaT клетки с поверхности культуры, 0,25% раствором трипсина ЭДТА. Приостановить клетки в 10 мл среды B (DMEM + 10% FBS + 1% GlutaMAX) и подсчитать количество ячеек. Экстракт необходимое количество клеток (1 – 5 x 105 клеток/мл) с пипеткой, центрифуги для 4 мин на 190 x g. приостановить клетки в средних б.
  7. Удалите носитель из культуры вставок, которые содержат HGF-коллаген смесь, стремлением. Добавьте 0,5 мл суспензии клеток HaCaT (0,5 – 2,5 x 105 клеток/хорошо) на вершине HGF-коллаген смесь. Инкубируйте культур для 24 h или на ночь.
    Примечание: В этот момент времени, среднего в культуре также должно быть среднего A, в то время как среднего в культуре вставки должен быть средний б.
  8. Замените KSR среднего (сопредседатель культуры среднего) питательной среды (MEM-альфа + 15% нокаутом сыворотки замена + 1% GlutaMAX) + 5% FBS. Добавьте 1 мл питательной среды в культуру, хорошо и 0,5 мл в культуре вставки. Инкубируйте культур за 24-48 ч.
  9. Заменить питательной среды KSR средний + 1% FBS. Добавьте 1 мл в культуру хорошо и 0,5 мл в культуре вставки. Инкубируйте культур для 24 h или на ночь.
  10. Заменить питательной среды в культуре с 0,7-1 мл KSR среднего. Полностью удалите носитель из вставки культура (культура поверхности должны подвергаться воздействию воздуха). Инкубируйте культур для 1 – 2 недели. Изменение среднего в культуре также два раза в неделю.
    Примечание: Не позволяйте среднего уровня подняться выше поверхности культуры (верхний слой состоит из кератиноцитов). Всегда держите культуры поверхность сухой.

2. Подготовка раненых GTE (рис. 1B)

  1. Подготовьте панчер ткани диаметром 1-3 мм. Стерилизуйте его с автоклаве при температуре 121 ° C 20 мин.
  2. Вставьте ткани панчер перпендикулярно в GTE о 300 мкм глубокой и пробить дыру в ткани, чтобы имитировать рану.
  3. На этом шаге используйте раненых GTE для расследования рану заживления и регенерации тканей. Кроме того исправьте ГТД с использованием 10% формалине нейтрального буферного раствора для выполнения гистологический анализ.

3. Подготовка воспалительных GTE (iGTE) (рис. 1B)

  1. Культивируйте клетки THP-1 по данным предыдущего доклада9.
  2. Mix коллаген типа-А гель с 10% сосредоточены RPMI 1640, 10% восстановления буфера (2,2 g NaHCO3 и 4.47 g HEPES в 100 мл 0,05 N NaOH) и 10 нг/мл PMA. Держите смешанных коллагена раствор на льду до использования.
  3. Фото 1 – 2 х 106 THP-1 клетки и центрифуги для 4 мин на 190 x g. приостановить клеток в 1 мл раствора смешанного коллагена. Оставьте смесь на льду до следующего шага.
  4. Добавьте 10 – 30 мкл THP-1-коллаген смесь в область раненых ГТД. Заменить питательной среды на 0,7-1 мл KSR носитель, содержащий 10 нг/мл PMA.
  5. Инкубируйте смесь в атмосфере увлажненный с 5% CO2 при 37 ° C за 72 ч.
  6. Использовать модель для изучения гингивита и периодонтита (например, добавить потенциальных противовоспалительные медицины в iGTE, чтобы увидеть его влияние на cytokine выпуске10). Можно также опустить 72 h PMA-лечение, добавить 2 мкг/мл LPS в культуру и инкубировать ткани в атмосфере увлажненный с 5% CO2 при 37 ° C для 48 h11,12.

4. Фиксация и весь Маунт иммуноокрашивания GTE и iGTE культур

  1. Фиксация культур.
    1. Удалите средство культуры с 24-ну пластины. Вымойте тканей 2 раза с-фосфатный буфер (PBS).
    2. Хорошо добавьте 1 мл нейтрального буферного раствора формалина 10% для вставки и 1 мл в культуре. Оставьте 24-ну пластины в холодильнике при температуре 4 ° C на ночь.
    3. Удалите следующий день нейтрального буферного раствора формалина 10%.
    4. Для всей горе иммуноокрашивания мыть ткани 3 - 4 раза с PBS после фиксации.
    5. Гематоксилином и эозином (H & E) и регулярные иммуноокрашивания приступайте к дегидратации, внедрение парафин и секционирование.
      Примечание: Для вся гора иммуноокрашивания, этот шаг может быть опущен.
  2. Вся гора иммуноокрашивания
    Примечание: Этот протокол был изменен от того, в справочнике 13.
    1. Вымойте тканей 3 x в PBS 0,5 – 1% Тритон, 10 – 30 минут каждый раз.
    2. Инкубировать тканей дважды на 30 мин в блокирующем буфере (PBS 1% тритон + 10% BSA), при комнатной температуре.
    3. Вымойте тканей 2 × в блокирующем буфере, 5-10 минут каждый раз.
    4. Добавьте 50 мкл раствора первичного антитела в требуемой концентрации разбавления/вставки. Используйте тонкий пластиковый цепляться пленки обернуть вставки, чтобы избежать высыхания ткани.
    5. Инкубировать ткани для 1-2 дней при 4 ° C.
    6. Вымойте тканей 3 раза, за 30 мин в PBS 1% тритон + 10% BSA. Мойте снова 3 раза, за 5 мин в PBS 1% тритон.
    7. Добавьте 50 мкл вторичного антитела в блокирующем буфере (PBS 1% тритон + 10% BSA) и 5 мкл раствора Hoechst 33342 (клетки живут NucBlue пятно) для каждой вставки. Используйте тонкий пластиковый цепляться пленки обернуть вставки, чтобы избежать высыхания ткани.
    8. Инкубировать в течение 1-2 дней при 4 ° C. Оберните 24-ну пластины влажной салфеткой, а затем положить его в пластиковый пакет, чтобы использоваться на протяжении всего инкубационного.
    9. Вымойте тканей 3 раза, для 10 минут в PBS 1% тритон
    10. Используйте острые иглы вырезать мембраны культуры вставка для получения ткани. Место мембраны на слайд.
      Примечание: Ткани должна быть на мембране.
    11. Добавьте 2-3 капли флуоресценции горе среды. Покрытие ткани с покровным стеклом и хранить при 4 ° C в темноте до анализа.
    12. Просмотр тканей с Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (МИС).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

HaCaT ячеек типичные кератиноцитов морфология при фазово контрастной микроскопические наблюдения (рис. 2A). Сканер электрона микроскопических изображений (SEM) показал, что HaCaT клеток поверхности были охвачены многие микроворсинки. Межклеточные соединения между HaCaT клетки были опосредовано мембранных процессов (рис. 2B). HaCaT клетки выразил десневой эпителия маркер K8/1814, указав, что клетки HaCaT по...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол основан на методы создания эквиваленты десневой ткани и подкожно-жировой эквиваленты, описанные в предыдущих докладах8,21,22. Хотя это простой и легкий метод, некоторые шаги требуют особого внимания. К примеру коллаген смесь должны храниться на льду до использования, чтобы избежать образования геля в решении. При добавлении коллаген смесь в культуре вставляют, убедитесь, что решение было впрыснуто в центре вставки,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют никакого конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана в части японского общества для поощрения науки (JSP) субсидий для научных исследований (26861689 и 17 K 11813). Авторы хотели бы поблагодарить г-н Натаниел Грин для корректуры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Коллаген типа I-ANitta Gelatin IncДля изготовления дермы GTE
MEM-alphaThermo Fisher Scientific11900073Cell Culture medium
Cell Culture Insert (для 24-луночного планшета), размер пор 3,0 μ мКорнинг, Инк.353096Для культуры тканей
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061Реактив для клеточных культур
DMEMThermo Fisher Scientific31600034Среда для клеточных культур
Замена сыворотки KnockOut ThermoFisher Scientific10828028Реактив для клеточных культур
Тканевый перфораторShibata system service co., LTDSP-703Для пробивка отверстий в GTE
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific31800022Среда для культивирования клеток
BSASigma-AldrichA3294Для иммуноокрашивания
Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain)Thermo Fisher ScientificR37605Для мечения ядер
Флуоресцентная среда для монтажа DakoДля монтажа образцов после иммуноокрашивания
Антитело к цитокератину 8+18 [5D3]abcamab17139Для идентификации эпителия
Сканирующий электронный микроскопHitachi, Ltd.HITACHI S-4000Для наблюдения за рельефом и составом поверхности образцов
Конфокальная лазерная сканирующая микроскопияLSM 700; Карл Цейсс Микроскопия Ко., Лтд.LSM 700Для наблюдения за иммунофлуоресцентным окрашиванием образцов
Антитело Антицитокератин 19abcamab52625Для идентификации эпителия
Антитело к виментинуabcamab92547Для идентификации фибробластов и активированных макрофагов
Антитело Anti-TE-7MilliporeCBL271Для идентификации фибробластов в дерме
Anti-CD68 антителоSigma-AldrichSAB2700244Для идентификации макрофагов
Антитела к CD14 человекаR& D SystemsMAB3832-SPДля идентификации макрофагов
Alexa Fluor 594-конъюгированное вторичное антитело козы против кроликаThermo Fisher ScientificA11012Для иммунофлуоресцентного окрашивания
Alexa Fluor 488-конъюгированное вторичное антитело козы против мышиThermo Fisher ScientificA11001Для иммунофлуоресцентного окрашивания
EVOS FL Система визуализации клетокThermo Fisher ScientificДля наблюдения за иммунофлуоресцентным окрашиванием
образца клеток THP-1Riken BRCcell bank RCB1189Для получения iGTE
PMA (Phorbol 12-myristate 13-ацетат)Sigma-AldrichP8139Для дифференцировки клеток THP-1

Ссылки

  1. Cekici, A., Kantarci, A., Hasturk, H., Van Dyke, T. E. Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease. Periodontology 2000. 64 (1), 57-80 (2014).
  2. Hasturk, H., Kantarci, A., Van Dyke, T. E. Oral Inflammatory Diseases and Systemic Inflammation: Role of the Macrophage. Frontiers in Immunology. 3, 118(2012).
  3. Koh, T. J., DiPietro, L. A. Inflammation and wound healing: The role of the macrophage. Expert reviews in molecular medicine. 13, e23(2011).
  4. Mescher, A. L. Macrophages and fibroblasts during inflammation and tissue repair in models of organ regeneration. Regeneration. 4 (2), 39-53 (2017).
  5. Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental Animal Models in Periodontology: A Review. The Open Dentistry Journal. 4, 37-47 (2010).
  6. Han, Y. W., et al. Interactions between Periodontal Bacteria and Human Oral Epithelial Cells: Fusobacterium nucleatum Adheres to and Invades Epithelial Cells. Infection and Immunity. 68 (6), 3140-3146 (2000).
  7. Boukamp, P., Petrussevska, R. T., Breitkreutz, D., Hornung, J., Markham, A., Fusenig, N. E. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
  8. Xiao, L., Miwa, N. Hydrogen-rich water achieves cytoprotection from oxidative stress injury in human gingival fibroblasts in culture or 3D-tissue equivalents, and wound-healing promotion, together with ROS-scavenging and relief from glutathione diminishment. Hum Cell. 30 (2), 72-87 (2017).
  9. Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
  10. Ara, T., Kurata, K., Hirai, K., Uchihashi, T., Uematsu, T., Imamura, Y., Furusawa, K., Kurihara, S., Wang, P. L. Human gingival fibroblasts are critical in sustaining inflammation in periodontal disease. J Periodontal Res. 44 (1), 21-27 (2009).
  11. Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli. Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).
  12. Sharif, O., Bolshakov, V. N., Raines, S., Newham, P., Perkins, N. D. Transcriptional profiling of the LPS induced NF-kappaB response in macrophages. BMC Immunol. 8, 1(2007).
  13. Abcam. Whole mount fluorescent immunohistochemistry. , Available from: http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/whole_mount_fluorescent_ihc.pdf (2017).
  14. Shetty, S., Gokul, S. Keratinization and its disorders. Oman Med J. 27 (5), 348-357 (2012).
  15. Klinge, B., Matsson, L., Attström, R. Histopathology of initial gingivitis in humans. A pilot study. J Clin Periodontol. 10 (4), 364-369 (1983).
  16. Nagarakanti, S., Ramya, S., Babu, P., Arun, K. V., Sudarsan, S. Differential expression of E-cadherin and cytokeratin 19 and net proliferative rate of gingival keratinocytes in oral epithelium in periodontal health and disease. J Periodontol. 78 (11), 2197-2202 (2007).
  17. Goodpaster, T., Legesse-Miller, A., Hameed, M. R., Aisner, S. C., Randolph-Habecker, J., Coller, H. A. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J Histochem Cytochem. 56 (4), 347-358 (2008).
  18. Langeland, K., Rodrigues, H., Dowden, W. Periodontal disease, bacteria, and pulpal histopathology. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 37 (2), 257-270 (1974).
  19. Holness, C. L., Simmons, D. L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).
  20. Mor-Vaknin, N., Punturieri, A., Sitwala, K., Markovitz, D. M. Vimentin is secreted by activated macrophages. Nat Cell Biol. 5 (1), 59-63 (2003).
  21. Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. The effect of squalane-dissolved on adipogenesis-accompanied oxidative stress and macrophage in a preadipocyte-monocyte co-culture system. Biomaterials. 31 (23), 5976-5985 (2010).
  22. Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. Highly hydroxylated fullerene localizes at the cytoskeleton and inhibits oxidative stress in adipocytes and a subcutaneous adipose-tissue equivalent. Free Radic Biol Med. 51 (7), 1376-1389 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

HaCaTTHP 1PMALPS
Трехмерные воспалительных тканей человека эквиваленты десны
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.