Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Химические ампутации и регенерации глотки в Планарии Schmidtea mediterranea

10.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57168

⸱

26 марта 2018 г.

 ,  , 
1Department of Molecular Medicine, College of Veterinary Medicine, Cornell University

В этой статье

Краткое содержание

Планарии Schmidtea mediterranea является прекрасной моделью для изучения стволовых клеток и регенерации тканей. Эта публикация описывает метод выборочно удалить один орган, глотки, подвергая животных для азид химического натрия. Этот протокол также излагаются методы мониторинга глотки регенерации.

Аннотация

Planarians, трематодами, которые являются чрезвычайно эффективными в регенерации. Они задолжают эта способность большое количество стволовых клеток, которые могут быстро реагировать на любой тип травмы. Общие травмы модели в этих животных удалить большое количество ткани, которая наносит ущерб несколько органов. Чтобы преодолеть этот ущерб широких тканей, мы описываем здесь метод для выборочного удаления единым органом, глотки, в Планарии Schmidtea mediterranea. Мы добиться этого путем замачивания животных в растворе, содержащие азид натрия ингибитором цитохрома-оксидазы. Кратковременного воздействия азид натрия вызывает выдавливания глотки от животного, которое мы называем «химическая ампутации.» Химические ампутации удаляет весь глотки и создает небольшую рану, где глотки придает кишечника. После ополаскивания обширные, ампутировали животные регенерировать полностью функциональный глотки в течение примерно одной недели. Стволовые клетки в остальной части тела диск регенерации новых глотки. Здесь, мы предоставляем подробный протокол для химических ампутации и описать гистологические и поведенческие методы для оценки успешных ампутации и регенерации.

Введение

Регенерация представляет собой явление, которое происходит во всем животном, с регенеративной емкостью от регенерации тела в некоторых беспозвоночных более ограниченной способности в позвоночных1. Замена функциональных тканей — это сложный процесс и часто влечет за собой одновременное восстановление нескольких типов клеток. Например для регенерации конечностей саламандра, остеобласты, хрящевые клетки, нейронов, мышц и эпителиальные клетки должны быть заменены2. Эти типы созданный клеток также должны быть организованы должным образом содействовать новой функции конечности. Понимание этих сложных процессов требует методов, которые сосредоточены на регенерации типов конкретных клеток и их интеграции в органы.

Одна из стратегий, используемых для упрощения изучение восстановительных реакций является целевой абляции либо определенные типы клеток или больших коллекций тканей. Например в данио рерио, выражение nitroreductase в типах конкретных клеток приводит к их разрушению после применения метронидазол3,4. В личинки дрозофилы выражения про apoptotic гены под ткани конкретных промоутеров может выборочно удалять конкретные регионы имагинальных дисков5,6. Оба из этих стратегий быстрого, но контролируемые повредить и были использованы для того чтобы рассечь молекулярных и клеточных механизмов, отвечающих за регенерацию.

В этой рукописи мы опишем способ выборочно удалять весь орган, называемый глотки в Планарии Schmidtea mediterranea. Planarians являются классической модели регенерации, известный для их плодовитый регенерационной способности, где даже минута фрагменты можно вырастить весь животных 7,8. Они имеют большой, гетерогенных население стволовых клеток, состоящий из плюрипотентных клеток и восходящей линии ограничена9,10,11. Эти клетки размножаются и дифференцировать для замены всех отсутствующих тканей, в том числе глотки, нервной, пищеварительной и выделительной систем и мышцы и эпителиальных клеток9,10,12. Хотя мы знаем, что эти стволовые клетки инициировать регенерации, мы не полностью понимаем молекулярные механизмы, которые управляют их заменить всех этих различных типов клеток. Определенных ранив методы, которые вызывают точные стволовых клеток ответов могут помочь определить этот сложный процесс.

Глотки большой, цилиндрические трубки, необходимых для кормления и содержит нейронов, мышцы, эпителиальных и секреторные клетки13,29. Обычно скрыты в чехле на вентральной стороне животного, он простирается через единый орган животного, открытие после зондирования присутствие пищи. Чтобы выборочно ампутировать глотки, мы замочить planarians в азид химических называется натрия, широко используемых анестетика в C. elegans14,,1516. Его использование в planarians впервые сообщили Адлер и др., в 2014 году12. В течение нескольких минут воздействия азид натрия planarians выдавливать их фарингит, и с нежным агитации, глотки отсоединяется от животного. Мы ссылаемся на этот полный и выборочный потери глотки как «химическая ампутации конечностей». Через одну неделю после ампутации, полностью функциональный глотки находится восстановленный12. Потому что глотки требуется для кормления, функциональных регенерации может измеряться путем мониторинга питания поведение. Ниже мы описываем протокол для химического ампутации и для оценки регенерации глотки и восстановления кормления поведение.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка

  1. Подготовка воды planaria 17
    1. Сохранить planarians в 1 X Montjuïc солевой раствор. Подготовить Планарии воды, сделайте индивидуальные запасов решения CaCl 1 М2, 1М MgSO4, 1 М MgCl2, 1М KCl и 5 М NaCl в ультрачистая вода. Фильтр стерилизации с длительного хранения бутылки Топ filterfor 0,2 мкм.
      Примечание: Используйте только сверхчистого деионизированную воду (с удельным сопротивлением 18.2 MΩ при 25 ° C) для подготовки Монжуик соли.
    2. Для приготовления 1 Л запас соли раствора 5 X, объедините 5 мл 1 М CaCl2, 5 мл 1 М MgSO4, 0,5 мл MgCl2, 0,5 мл хлористого калия и 1,6 мл растворов NaCl 5 М в 900 мл ультрачистая вода. Это решение добавьте 0,504 г NaHCO3 и перемешать, чтобы смесь. Отрегулируйте пэ-аш до 7.0 с соляной кислотой.
    3. Разбавляют этот 5 X Стоковый раствор 1 X рабочей концентрации в ультрачистая вода в стерильный контейнер например оплетенная бутыль большой емкости (см. Таблицу материалов). Используйте этот 1 X решение для поддержания бесполое planarians.
      Примечание: Как альтернатива раствор соли Монжуик, использовать локально приобрели родниковой воды или ультрачистая вода, содержащая коммерчески доступных аквариум соли смешивают (см. Таблицу материалы) в г/Л концентрации в of0.518.
    4. Для предотвращения бактериальной инфекции в статической культуры19, поддерживать planarians в воде, содержащей антибиотик. Подготовка 50 мг/мл, раствор гентамицина сульфата в ультрачистая вода и фильтр стерилизации. Для контейнеров, где поддерживаются животных добавьте гентамицина сульфат в конечной концентрации 50 мкг/мл (разбавления 1: 1000).
  2. Подготовка печени пасты
    1. Как planarians процветают на диете из органических, травы кормили говядиной печени, приобрести свежие печени и процесс в течение 24 ч. Удалите мембранное капсула, инкапсуляции печени с отшелушивающим осторожно. Нарезать кубиками ~ 1 см печени и используйте лезвия соскрести и отбросить все печеночных вен и артерий.
    2. Размачиваем печени куски с помощью мясорубку или кухонном комбайне и затем передать его через сетчатый фильтр питания проволоки. Объединить в кондитерские мешки, а обойтись в шприцы или Петри 35-мм. До кормления, центрифуга осторожно удалить пузырьки воздуха.
    3. Хранить аликвоты печени на-80 ° C до года и оттепели перед использованием. После оттаивания, повторно заблокировать любые остатки печени один раз, или хранить при 4 ° C до 24 ч.
  3. Содержание животных
    1. Planarians будет расти и уменьшаться для различных размеров в зависимости от частоты кормления. Кормите planarians каждую неделю (один раз каждые 14 дней). Для долгосрочной массовой культуры используйте пластиковые контейнеры различных размеров (см. Таблицу материалы).
    2. Кормить животных, используйте металлический шпатель или пипетки пластиковые передачи поставить горошину капля печени в коробке. Разрешить животных, чтобы поесть за 1-2 ч. удалить оставшиеся питания перед очисткой поле.
    3. Очистить червей дважды в неделю, если ФРС (один раз сразу после кормления и один раз в два дня спустя), или один раз в неделю, если не кормили. Для очистки, слейте воду в пластиковый стакан, тщательно выливание воды при сохранении planarians в поле. Протрите поверхность коробка с бумажным полотенцем, затем повторять со всех сторон до тех пор, пока поле является чистым.
    4. Замените воду (к приблизительно на ¾ объема поле) и добавить гентамицина в конечной концентрации 50 мкг/мл. Магазин животных в темный шкаф или в инкубаторе 20 ° C.
  4. Выбор червей
    1. Выберите червей, которые кормили до 5-7 дней.
      Примечание: Это значительно сложнее ампутировать фарингит от червей, которые недавно были накормлены (1-2 дня до ампутации). Кормили животных более чувствительны к азид натрия.
    2. Выберите червей, которые примерно 6 мм в длину. Чтобы оценить размер червя, передача его в чашку Петри с помощью пипетки пластиковые передачи. Место квартира 6 - в линейке или 5 x 5 мм Диаграммная бумага под чашку Петри и измерить длину червь во время обхода.
      Примечание: Черви, меньше, чем 6 мм в длину, более трудно ампутировать.
  5. Подготовка азид натрия
    1. Приготовляют раствор 100 мм путем растворения порошка азид натрия в planaria воде.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Азид натрия является токсичным и следует осторожно. Не выбрасывайте азид натрия в канализацию. После использования Соберите его отдельно для удаления опасных отходов.

2. глотки ампутации

  1. Место червей в 35-мм диаметр Петри. Тщательно удалите все Планарии воды из блюдо с помощью пипетки пластиковые передачи.
    Примечание: Максимум 20 6-мм червей могут быть удобно размещены в блюдо этого размера.
  2. Поместите блюдо под микроскопом и настроить масштаб так, что несколько червей можно просмотреть одновременно (например 10 крат). Замените Планарии воды раствором азид натрия 100 мм.
    Примечание: Для 35-мм Петри примерно 5 мл азид натрия является достаточным. Решение должно полностью погрузите planarians. Отрегулируйте громкость решение для больших блюд при необходимости.
  3. Мониторинг животных под микроскопом и воздерживаться от движущихся блюдо за первые 3-4 мин.
  4. Наблюдать за экструзии глотки через микроскоп; глотки торчат из глоточной сумке и полностью (около 1 мм в длину) как показано на рисунке 1B.
    Примечание: Важно, чтобы дождаться окончания глотки расширение полностью, прежде чем продолжить. После глотки возникает от животного, полное расширение занимает примерно 1 мин.
  5. Использование пипетки пластиковые передачи в шприц животных вокруг блюдо. Сосать животных в пипетки и принудительно выпустить их в блюдо пару раз. Если глотки полностью расширяется, этот энергичный закупорить приведет к его отсоединения.
  6. Кроме того понять глотки вертикально вдоль его длины, либо горизонтально вдоль его окружности, используя пару тонкой щипцов (см. Таблицу материалы), как показано на рисунке 1 c. С глотки ущипнул в щипцы Поднимите животное вверх к мениска. Как животное возникает, поверхностное натяжение приведет к глотки для отсоединения от животных.
    Примечание: Этот метод может использоваться для удаления фарингит мелких животных (1-3 мм в длину), где сильный закрученного не является адекватной. Избегайте тыкать или иным образом ранив тело животного.
  7. С помощью пипетки передачи, переместите ампутировали животных в новое блюдо, содержащий свежие planaria воды.
  8. После передачи, промойте ампутировали животных тщательно в planaria воде, полностью обмена воды три раза. Переезд в новое блюдо, содержащие planaria воду с 50µg/мл гентамицина.
    Примечание: Полный буфер обмена во время этих трех моет имеет важное значение для обеспечения удаления азид натрия.
  9. Следующий день, замените воду в блюдо свежей planaria водой, содержащей 50 мкг/мл гентамицина. Повторять каждый день после этого.

3. Оценка глотки удаления после ампутации

  1. Изучите животных под микроскопом (с 10-20 кратном) для определения, является ли тёмное пятно появилось после успешного удаления глотки, как показано на рисунке 2А.
  2. Кроме того, исправить и отбеливателя животных согласно протоколу, описываемого Пирсон и др. 20. животных замочить на ночь в 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) или дневно конъюгированных стрептавидина (1 мг/мл разбавленной 1: 500 в 1 X фосфатный Buffered, содержащие 0,3% Тритон-X). Смонтируйте животных на слайды в 80% glycerol/20% 1 X Buffered фосфатный и изображения под люминесцентные стереомикроскопом (рис. 2B).
    Примечание: Все изображения в этой рукописи были захвачены на флуоресцентные стереомикроскопом с 1.0 X цели.

4. Оценка глотки регенерации путем измерения кормление поведение

  1. Подготовка печени
    1. Перенос необходимое количество печени пасты в microcentrifuge или конической трубки. Спиновые кратко, чтобы удалить пузырьки воздуха. Рассчитайте объем печени, а затем добавьте воды planaria-1/5 его объема и 2% от общего объема в красный пищевой краситель. Например 1000 мкл печени пасты, добавить 200 мкл воды planaria и 24 мкл пищевого красителя.
    2. Использование пластиковых пестик, наконечник пипетки или металлической лопаткой, тщательно перемешивайте, до пищевой краситель распределяется равномерно в печени пасты. Спиновые снова кратко. Паштеты можно хранить при 4 ° C на 24 часа или замороженные в аликвоты на-80 ° C для длительного хранения.
    3. Если тестирование до 25 животных, готовить 25 мкл печени пасты на блюдо (примерно 1 мкл печени пасты на животное).
  2. Кормление животных
    1. Через семь дней после химического ампутации, передать новым Петри животных. Если тестирование 10-15 животных, используйте блюдо 35 мм; более чем 15 животных должны быть проверены в чашке Петри 60-мм. Держите животных в темноте, спокойно, около 1 часа до кормления.
    2. С помощью ножниц, увеличения ширины кончика пипетки Р200 путем обрезки примерно ½ см офф узкий конец. Накапайте 25 мкл красной пастой печени в блюдо.
      Примечание: Подрезка конца делает закупорить вязкой паштеты легче. Чтобы предотвратить плавает на поверхности печени, Сенсорный кончик в нижней части блюда во время отпуска.
    3. Разрешить животных кормить за 30 мин.
    4. Оценка количество животных, которые едят путем размещения животных на белом фоне или их изучения под микроскопом с 10-20 кратным увеличением.
    5. После кормления, удалите печени от блюдо и чистой.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Подверженности азид натрия нарушает нормальной моторики planarians, вызывая животных, чтобы растянуть и корчиться. Эти движения силы глотки выйти из вентральной стороне животного, и после примерно в 6 минут в раствор азид натрия, можно увидеть белый кончик глотки (рис. 1B-левая панель). Несколько минут спустя, животные активно контракт и полностью расширить глотки, насильственно толкает его из организма. (Рис. 1B<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол описывает метод выборочного уноса глотки с помощью азид натрия. Другие исследования целевых абляции в planarians использовали измененные хирургии для удаления фоторецепторов21 или медикаментозное лечение, чтобы удалять дофаминергические нейроны22. Одним важным преимуществом химического ампутации над существующими методами является, что она не требует хирургии. Жесткая структура глотки, по сравнению с остальной частью тела Планарии облегчает его полное удаление...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Алехандро Санчес Альварадо, который поддержал первоначальный оптимизации и развития этой техники. Работа в лаборатории Кэролин Adler поддерживается Корнельского университета начальных средств.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Дигидрат хлорида кальция (CaCl2)Fisher ChemicalC79-3Montjuï c раствор
соли Сульфат магния безводный (MgSO4)Fisher ChemicalM65-3Montjuï c раствор соли
Магния хлорид гексагидрат (MgCl2)Acros/VWR41341-5000Montjuï c раствор соли
хлорида калия (KCl)Acros Organics/VWR196770010Montjuï c раствор соли
Sodium Chloride (NaCl)Acros Organics/VWR207790050Montjuï c раствор соли
Бикарбонат натрия (NaHCO3)Acros Organics/VWR123360010Montjuï c раствор соли
Nalgene автоклавируемый сополимер полипропилена лоубой с патрубкомThermoFisher Scientific/VWR2324-0015Хранение воды планарии
Растворимый океан Морская сольСпектр БрендыАмазонкаПланария вода
Гентамицин сульфатДжемини Био-продукты400-100PПланария вода
Бритвенные лезвияЭлектронная микроскопия Науки71970Фарш из печени 
Одноразовые кондитерские мешки-16", 12 штWiltonAmazonLiver aliquots
5 мл шприцыBD/VWR309647Печень аликвоты
Петри-35мм/60ммGreiner Bio-One/VWR82050-536/82050-544
Пластиковые контейнеры (различные размеры)ZiplocAmazonHousing planarians in static culture
Sodium AzideSigmaS2002
Переносная пипеткаGlobe Scientific138030
Щипцы - Dumont Tweezer, Стиль 5Электронная микроскопия Наук 72700-D (0203-5-PO)
Triton X-100SigmaT8787
DAPI ThermoFisher62247
Стрептавидин, Alexa Fluor 488 конъюгатThermoFisherS11223
ГлицеринFisher БиореагентыBP229-1
.

Ссылки

  1. Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).
  2. Tanaka, E. M. The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration. Cell. 165, 1598-1608 (2016).
  3. Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat. Protoc. 3, 948-954 (2008).
  4. White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62, 232-240 (2013).
  5. Smith-Bolton, R. K., Worley, M. I., Kanda, H., Hariharan, I. K. Regenerative growth in Drosophila imaginal discs is regulated by Wingless and Myc. Dev. Cell. 16, 797-809 (2009).
  6. Smith-Bolton, R. Drosophila Imaginal Discs as a Model of Epithelial Wound Repair and Regeneration. Adv. Wound Care. 5, 251-261 (2016).
  7. Newmark, P. A., Sánchez Alvarado, A. Not your father's planarian: a classic model enters the era of functional genomics. Nat. Rev. Genet. 3, 210-219 (2002).
  8. Reddien, P. W., Sánchez Alvarado, A. Fundamentals of planarian regeneration. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 725-757 (2004).
  9. Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration. Science. 332, 811-816 (2011).
  10. Scimone, M. L., Kravarik, K. M., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Neoblast specialization in regeneration of the planarian Schmidtea mediterranea. Stem Cell Reports. 3, 339-352 (2014).
  11. van Wolfswinkel, J. C., Wagner, D. E., Reddien, P. W. Single-cell analysis reveals functionally distinct classes within the planarian stem cell compartment. Cell Stem Cell. 15, 326-339 (2014).
  12. Adler, C. E., Seidel, C. W., McKinney, S. A., Sánchez Alvarado, A. Selective amputation of the pharynx identifies a FoxA-dependent regeneration program in planaria. Elife. 3, e02238(2014).
  13. Adler, C. E., Sánchez Alvarado, A. PHRED-1 is a divergent neurexin-1 homolog that organizes muscle fibers and patterns organs during regeneration. Dev. Biol. 427, 165-175 (2017).
  14. Wong, M. C., Martynovsky, M., Schwarzbauer, J. E. Analysis of cell migration using Caenorhabditis elegans as a model system. Methods Mol. Biol. 769, 233-247 (2011).
  15. Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C elegans chemotaxis assay. J. Vis. Exp. , e50069(2013).
  16. Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 177(2012).
  17. Tasaki, J., Uchiyama-Tasaki, C., Rouhana, L. Analysis of Stem Cell Motility In Vivo Based on Immunodetection of Planarian Neoblasts and Tracing of BrdU-Labeled Cells After Partial Irradiation. Methods Mol. Biol. 1365, 323-338 (2016).
  18. Roberts-Galbraith, R. H., Brubacher, J. L., Newmark, P. A. A functional genomics screen in planarians reveals regulators of whole-brain regeneration. Elife. 5, (2016).
  19. Arnold, C. P., et al. Pathogenic shifts in endogenous microbiota impede tissue regeneration via distinct activation of TAK1/MKK/p38. Elife. 5, (2016).
  20. Pearson, B. J., et al. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).
  21. LoCascio, S. A., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Eye Absence Does Not Regulate Planarian Stem Cells during Eye Regeneration. Dev. Cell. 40, 381-391 (2017).
  22. Nishimura, K., et al. Regeneration of dopaminergic neurons after 6-hydroxydopamine-induced lesion in planarian brain. J. Neurochem. 119, 1217-1231 (2011).
  23. Wilson, D. F., Chance, B. Azide inhibition of mitochondrial electron transport. I. The aerobic steady state of succinate oxidation. Biochim. Biophys. Acta. 131, 421-430 (1967).
  24. Duncan, H. M., Mackler, B. Electron Transport Systems of Yeast: III. Preparation and properties of cytochrome oxidase. J. Biol. Chem. 241, 1694-1697 (1966).
  25. Buchan, J. R., Yoon, J. H., Parker, R. Stress-specific composition, assembly and kinetics of stress granules in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 228-239 (2011).
  26. Cebrià, F. Organization of the nervous system in the model planarian Schmidtea mediterranea: An immunocytochemical study. Neurosci. Res. 61, 375-384 (2008).
  27. Shimoyama, S., Inoue, T., Kashima, M., Agata, K. Multiple Neuropeptide-Coding Genes Involved in Planarian Pharynx Extension. Zoolog. Sci. 33, 311-319 (2016).
  28. Ito, H., Saito, Y., Watanabe, K., Orii, H. Epimorphic regeneration of the distal part of the planarian pharynx. Dev. Genes Evol. 211, 2-9 (2001).
  29. Bueno, D., Espinosa, L., Baguñà, J., Romero, R. Planarian pharynx regeneration in tail fragments monitored with cell-specific monoclonal antibodies. Dev. Genes Evol. 206, 425-434 (1997).
  30. Hyman, L. The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria. , McGraw-Hill. (1951).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Химические ампутации и регенерации глотки в Планарии Schmidtea mediterranea
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.