Обнаружение моющих средств чувствительных взаимодействия между мембранные белки

Summary

Мы описываем протокол для обнаружения моющих средств чувствительных взаимодействия между мембранных белков с помощью связывания рецептора сортировки, sortilin, в первый цикл Люминал белка транспортера глюкозы, GLUT4, в качестве примера.

Abstract

Наша способность исследовать белок белковых взаимодействий является ключом к пониманию нормативных соединения в ячейке. Однако обнаружение белок белковых взаимодействий во многих случаях связано с значительным экспериментальных задач. В частности сортировки рецепторов взаимодействуют с их белков груз в просвете мембраны отсеков часто в моющих средств чувствительных Мода, делая co иммунопреципитация этих белков непригодным для использования. Связывание сортировки sortilin рецептор для транспортера глюкозы, что GLUT4 может служить примером слабых Люминал взаимодействий между мембранных белков. Здесь мы описываем быстрый, простой и недорогой пробирного для проверки взаимодействия между sortilin и GLUT4. Для этого мы разработали и химически синтезированных myc тегами пептид, соответствующие потенциальные sortilin привязки epitope Люминал частью GLUT4. Sortilin, отмеченных 6 гистидинов была выражена в mammalian клетках и изолированы от lysates клетки с использованием кобальта бусины. Sortilin, иммобилизованных на бисер был инкубировали с пептидной решения в различных рН, и eluted материал был проанализирован Западный blotting. Этот assay может быть легко адаптирована для изучения других моющих средств чувствительных белок белковых взаимодействий.

Introduction

GLUT4 — это белок транспортера глюкозы, которая выражается главным образом в жира и скелетных мышечных клеток, где он опосредует влияние инсулина на пост натощак крови глюкозы Распродажа¹. Будучи очень стабильного белка, GLUT4 регулируется на столб-поступательные уровне. В отсутствие инсулина, GLUT4 значительной степени исключены из плазматической мембраны (отсюда низкая базальная проницаемость для глюкозы) и локализуется преимущественно внутри клетки в небольших инсулин отзывчивым везикулы (IRVs) и транс Гольджи сети (TGN), которая может представлять IRV доноров отсек. После инсулина администрации IRVs предохранитель с плазматической мембраны и доставить GLUT4 на сайт своего функционирования. Это увеличивает проницаемость мембраны плазмы для глюкозы, так что поглощение глюкозы из крови в адипоциты и скелетные миоциты возрастает с 10 до 40. После ухода инсулина GLUT4 включены в начале/сортировка endosomes и затем извлечь TGN, где IRVs вновь сформированных. Оба сортировки шаги в GLUT4 путь, т.е. извлечение из периферийных раннего endosomes для perinuclear TGN и формирование IRVs на доноров TGN мембраны включены членов семьи Vps10p, sortilin, который представляет тип I трансмембранный белок и сортировки рецептора. По словам одной модели, sortilin работает как белка трансмембранного эшафот: он связывает GLUT4 в просвете endosomes и TGN и нанимает адаптеров retromer или Клатрин цитоплазматических сторону доноров мембраны через его C-конечная^{2, 3}. Это облегчает распространение GLUT4 в везикулярного перевозчиков, которые перемещают GLUT4 между внутриклеточным отсеков.

Взаимодействие цитоплазматических хвост sortilin с retromer и различных адаптер белков хорошо задокументировано. Однако связывание sortilin GLUT4 (и некоторые из его других лигандов белка) было сложно доказать. В частности попытки co-immunoprecipitate sortilin и GLUT4 не были успешно вероятно из-за моющих средств чувствительных характер взаимодействия между этими двумя белков. Кроме того, как типичный транспортер белок GLUT4 имеет 12 трансмембранных доменов и просветный 6 петель любое сочетание которых потенциально могут представлять sortilin привязки сайта. В то же время большой объем косвенных доказательств, например значительное совместное локализации в ячейке, сшивки с проницаемой мембраны DSP, а также взаимодействие в дрожжей два гибридной системы показывают, что sortilin можно привязать к GLUT4. Кроме того используя последний подход в сочетании с аланина, сканирование мутагенеза, мы ранее определили, что домен Vps10p sortilin связывается главным образом первый Люминал петля GLUT4. Однако доказательства такого взаимодействия в mammalian клетках был пропавших без вести. Здесь, мы выделили его меткой sortilin из transfected 3T3-L1 клеток с использованием кобальта смолы и продемонстрировал, что он может взаимодействовать с химически синтезированных пептидов, соответствующий первой Люминал цикла GLUT4 на pH 6 и рН 8, напоминающие кислой среды в от англ люмен и нейтральной среде в просвете TGN мембран. Привязка не пептид был обнаружен в управления экспериментов, где экстракт, приготовленный из не transfected клеток был загружен на же бисер.

Protocol

1. обработка пептида

1. Дизайн и заказ пептида
   1. Выберите нужную последовательность пептида и добавить метку, например myc epitope (EQKLISEED) на ее либо N - или C-terminus.
   2. Проверьте предсказал растворимость пептида в воде, используя пептиды растворимость калькулятор http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php. В случае низкой растворимости, попробуйте добавить еще один водорастворимый тег, чтобы изменить баланс заряда.
      Примечание: Мы использовали пептид, соответствующий первого цикла Люминал (fll) из GLUT4, отмеченных myc epitope (жирный шрифт) в отеле terminus N (Myc-fll-GLUT4): EQKLISEEDLNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTTLWA, который имеет «хорошее» предсказал растворимость в воде .
   3. Заказать пользовательские пептид с по меньшей мере 75% чистоты, который является достаточным для assay и попросить поставщика для теста растворимости. Разделите по крайней мере два аликвоты в случае непредвиденных проблем с растворения пептида порядок.
      Примечание: В двух аликвоты было приказано Myc-fll-GLUT4. Его сообщения о растворимости в воде сверхчистого является крупностью до 10 мг/мл.
2. Растворяя пептида
   Примечание: Ультрачистая вода является лучшим растворителем. Если пептида не растворяется в воде, обратитесь к http://www.genscript.com/peptide_solubility_and_stablity.html для получения инструкций.
   1. Подготовка 100 x рабочего раствора пептида в ультрачистая вода или в буфере выбора, с концентрацией 100 мкг/мл.
   2. Отдельные решения в 50-100 мкл аликвоты и хранить их при-20 ° C.

2. обработка клеток

1. Культура клеток
   1. Использование дикого типа (WT) клетки как отрицательный контроль и клетки, выражая целевого белка, отмеченных 6 гистидинов (HisP).
      Примечание: Мы использовали 3T3 L1 до адипоцитов стабильно transfected с Sortilin-myc/его⁵.
   2. Рост клеток в Дульбекко изменение средних орла (DMEM) высокий сахар, дополнена 10% теленка бычьим сывороточным, глютамин (2 мм) и пенициллин/стрептомицина (5 мкг/мл) при 37 ° C в 10% CO₂.
   3. Сидят четыре блюда 10 см клеток, transfect два из них с HisP и transfect два других элемента управления плазмида (WT). 48 ч после transfection клетки должны достичь 80-90% confluency.
2. Подготовка Lysates клетки
   1. Подготовка буфера lysis (10 мм Hepes, 30 мм NaCl, 5% глицерина, 10 мм имидазола, 0,5% Тритон X-100 и протеазы ингибитор коктейль без ЭДТА для изоляции его меткой белков, рН 7,4) и держать его в 4 ° C:
   2. Вымыть клетки три раза с 10 мл 1 x фосфат амортизированное saline (PBS) при 4 ° C.
   3. Поставьте посуду на льду и 500 мкл буфера lysis к каждому блюду. Урожай lysates клетки с помощью скребка ячейки.
   4. Место lysate клетки от каждое блюдо в различных 1,5 мл трубку. Метки трубы как WT-pH6, WT-pH8, HisP pH6, HisP pH8.
   5. Передайте lysates клетки через шприц с иглой 26G пять раз вверх и вниз, полный лизис.
   6. Центрифуга lysates клетки на 16000 x g 10 мин при 4 ° C.
   7. Передать supernatants новые одинаково обозначенные трубы.
   8. Анализ концентрации протеина используя комплект Assay протеина BCA или других kit.
   9. Использование буфера lysis, уравнять концентрации белка всех четырех лизатов.
   10. Отдельные Алиготе малых (ОК. 20 мкл) о каждом lysate и держать его при-20 ° C для возможного контроля эксперименты и/или поиска и устранения неисправностей.

3. привязка его меткой белков к бисеру HisPur кобальта

1. Использование коммерчески доступных мыть буфер или подготовить один (50 мм Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 300 мм NaCl, 20 мм имидазола, рН 8) и держать его на 4 ° C.
2. Подготовить мыть буфер с рН 6 tittering мыть буфер рН 8 с HCl. Держите его при 4 ° C.
3. Аккуратно водоворот бутылка кобальта бисера сделать однородная суспензия.
4. Лунки 40 мкл бусины подвеска кобальта в четыре 1,5 мл трубки помечены как указано выше (шаг 2.2.4).
5. Добавить 1 мл буфера lysis к каждой трубе и центрифуги трубы на 1000 x g для 5 s. аспирата супернатанта и добавление поселились бусины 40 мкл буфера lysis.
6. Добавьте соответствующие трубы lysates клетки.
7. Инкубируйте трубы 90 мин при температуре 4 ° C на вращателе трубки на 20 об/мин.
8. Центрифуга трубы на 1000 x g 5 s и собирать супернатант. Держите супернатант при 4 ° C.
9. Добавьте 500 мкл буфера рН 6 мыть или рН 8 соответствующие трубы и вновь приостановить бисер осторожно.
10. Центрифуга для трубы на 1000 x g 5 s и отменить supernatants.
11. Повторите шаги 3.9 и 3.10 четыре раза.

4. Связывание пептида его меткой белка, иммобилизованных на бисер

1. С помощью рабочего раствора 100 x пептида (шаг 1.2.1), подготовить 1 x рабочих растворов в рН 6 или мыть буфер рН 8 (два 100 мкл аликвоты каждого, 1 мкг/мл).
2. Добавьте 100 мкл раствора 1 x пептид промывают бусы с соответствующими pH.
3. Инкубируйте Бусины для 30 мин при температуре 4 ° C на вращателе трубки на 20 об/мин.
4. Центрифуга для трубы на 1000 g x 5 s, собирать супернатант и держать его при температуре-20 ° C.
5. Повторите шаги 3.9 и 3.10 четыре раза.
   Примечание: С целью уменьшения возможных фон, следующие шаги может заменить шаги 4.4 и 4.5.
6. Возьмите четыре микро столбцы с 30 мкм поры, обозначить их как шаг 2.2.4 и место столбцов в коллекции трубок.
7. После завершения шага 4.3, передача смеси инкубации в столбцы, позволяют решение пройти под действием силы тяжести. Держите поток через при-20 ° C.
8. Мимо 500 мкл буфера мытья с рН 6 или рН 8 через соответствующие столбцы гравитации. Слейте через поток.
9. Повторите шаг 4.8 четыре раза.
10. После последнего мыть, центрифуга столбцы на 1000 x g 15 s.

5. элюции из бисера кобальта

1. Использование коммерческих буфер образца Трицин (200 мм трис-HCl, 40% глицерина, 2% SDS, 0,04% Кумасси синий, pH 6.8) и добавить β-меркаптоэтанол в конечной концентрации 2%.
2. Добавьте 40 мкл пример буфера Трицин (с β-меркаптоэтанол) промывают бусы и вихревой образца.
3. Тепло образцы для 10 минут при 100 ° C, вихрь снова, образцы и центрифуги трубы на 1000 g x 5 s.
   Примечание: С целью уменьшения возможных неспецифического связывания в элюции, следующие шаги может заменить шаги 5.1-5.3.
4. Добавить промытый 40 мкл буфера имидазола (50 мм Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 300 мм NaCl, 0,25 М имидазола) бисер, вихрь и инкубировать трубы при комнатной температуре в течение 20 мин.
5. Центрифуга для трубы на 3000 x g для 30 s, собирать супернатант (eluted образцы) и передать его на новые помечены трубы.
6. Добавить 40 мкл пример буфера Трицин каждой трубы, тепло образцы для 10 минут при 100 ° C, вихрь и центрифуги трубы на 1000 x g 5 s.
   Примечание: Если используются микро столбцы, добавьте Элюирующий буфер промывают бусы, Проинкубируйте втечение 20 мин и собирать элюции центрифугированием в 8000 x g на 2 мин.
   Примечание: Образцы могут храниться при температуре-20 ° C до проводится электрофорез.

6. электрофорез и Западный blotting

Примечание: Образцы готовы для разъединения SDS-PAGE и последующих Западный blotting. Следуйте протокола электрофореза геля (https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot) со следующими изменениями.

1. Использование коммерчески доступных 10-20% Трицин градиента гели.
2. На геле Загрузите eluted образцов 20 мкл и 20 мкл лизатов (шаг 2.2.10). Для устранения неполадок, рекомендуется загрузить 20 мкл несвязанного материала (шаг 3,8) и 10 нг пептида; перед загрузкой, добавьте равное количество Трицин буфер образца для этих образцов.
3. Провести электрофорез в коммерческих трис/Трицин/SDS работает буфер (100 мм трис, 100 мм Трицин и 0.1% SDS, рН 8.3).
4. Передача материалов из геля на нитроцеллюлозную мембрану 0,45 мкм с использованием буфера передачи (25 мм Tris база, 192 мм глицин, pH 8.4) дополнены 20% метанола.
5. Блокировать мембраны с 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA) за 1 ч при комнатной температуре. Используя маркеры предварительно окрашенные молекулярный вес как направляющие, горизонтально разрезать мембраны, пятно верхней части с антитело против HisP и пятно в нижней части с антитело против myc epitope для идентификации пептид myc тегами.
   Примечание: В нашем конкретном случае резки мембраны не требуется поскольку HisP и Myc-fll-GLUT4 могут быть обнаружены с анти myc антитела.

7. Анализ результатов

1. Количественную оценку интенсивности всех иммуноблоттинга сигналов с помощью изображения станции или ImageJ программы.
2. Нормализовать сигнал от myc тегами пептид против сигнал от HisP в обоих значениях рН.

Results

Лизатов были подготовлены 3T3 L1 клетки стабильно transfected, с Sortilin-myc/его⁵ и от WT 3T3 L1 клеток, используется в качестве отрицательного контроля. Обе лизатов были инкубировали с бисером кобальта в рН 6 или рН 8 и тщательно промывают. Бусины с иммобилизованными белки затем инкубировали в решении Myc-fll-Glut4. После тщательного моет белки, обязан бусины были этого eluted с 0,25 М имидазола. Образцы были подвергнуты, наряду с оригинальной лизатов, чтобы SDS-...

Discussion

Sortilin-это эволюционный сохранение нескольких лигандов белка рецептора, что участвует в обоих сигналов на плазматической мембраны и внутриклеточных сортировки событий^6,7. Однако поиск подлинных sortilin лигандами (некоторые из которых являются Люминал или составной мембранных белков) является сложным, как взаимодействие sortilin с некоторыми из своих партнеров привязки, как представляется, быть чувствительным к моющим средствам. Таким образом легко и широко под...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Коктейль ингибиторов протеазы	Sigma	P8849	для использования в очистке гистидиновой метки белка
фосфатно-солевого буфера	Corning	21-040-CV	PBS
1 мл инсулиновый шприц U-100	BD	329652	26G x 1/2
BCA Protein Analyzer Kit	Pierce	23228
Промывочный буфер	Boston BioProducts	BP-234	Для очистки белка His-tag HisPur
Cobalt Resin	Thermo Scientific	89964
Трицин образец Buffer	Bio-Rad	161-0739	с SDS, bMercaptaethanol следует добавить
Elution  Буфер	Boston BioProducts	BP-236	Для очистки белка His-tag с 250mM Imidazole
Mini-Protean Tris-Tricine precast гелями 10-20%	Bio-Rad	456-3115	Для разделения пептида и небольшого белка
Трис/Трицин/SDS беговой буфер	Bio-Rad	161-0744
Буфер для переноса	Boston BioProducts	BP-190	Добавить 20% метанола
Нитроцеллюлозная мембрана  0,45 мм	Bio-Rad	1620115
Бычья сыворотка Альбумин	Sigma	A9647	BSA
Anti Myc антитела	Cell Signaling	2272	Пептид кролика
	Genscipt		настроить заказ
Precision Plus Protein Dual color Standarts	BioRad	161-0374