Методическая статья

Прижизненные изображения двух Фотон лейкоцитов во время иммунный ответ в мыши Липополисахарид лечение печени

10.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57191

⸱

6 февраля 2018 г.

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Yonsei University College of Medicine, 2Brain Korea 21 Plus Project for Medical Science, Yonsei University College of Medicine, 3Department of Surgery, Yonsei University College of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы создали Роман хирургический протокол для двух Фотон томография печени живых мышей с минимальным вторжением. С этой техникой мы определили подробную структуру печени во время Липополисахарид индуцированной эндотоксемии. Мы ожидаем, что этот метод может использоваться для определения эффективности различных реагентов лечения печёночной лейкоцитарной миграции.

Аннотация

Сепсис — это тип тяжелой инфекции, которая может вызвать отказ органов и тканей повреждения. Хотя показатели смертности и заболеваемости связанные с сепсисом являются чрезвычайно высоким, нет прямого обращения или связанных с органа механизма рассматривался подробно, в режиме реального времени. Печень является ключевым органом, который управляет токсинов и инфекций в организме человека. Здесь мы стремились выполнить прижизненные изображения мыши печени после индукции эндотоксемии, чтобы отслеживать сократительной способности иммунных клеток, таких как нейтрофилы и макрофаги печени капсульные (LCMs). Соответственно мы разработали новый хирургический метод для экспозиции печени с минимально инвазивной хирургии. Мышей внутрибрюшинно вводили с липополисахарида (LPS), общие эндотоксин. Используя наш Роман хирургический подход для экспозиции и прижизненные изображения мыши печени, мы обнаружили, что нейтрофилов вербовки в LPS-лечение LysM Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) мыши печени был увеличен по сравнению с этим в фосфат амортизированное солевой раствор лечение печени. После лечения LPS со временем значительно увеличилось количество нейтрофилов. Кроме того с помощью мыши CX3Cr1-GFP, мы успешно визуализирована печени-резидентов макрофаги, называется LCMs. Таким образом чтобы исследовать эффективность новых реагентов для управления иммунной мобильности в естественных условиях, определении подвижности и морфология нейтрофилов и LCMs в печени может позволить нам определить терапевтический эффект в орган тканей и неудачи ущерб, причиненный активации лейкоцитов в сепсиса.

Введение

Печень является основным метаболических органом в млекопитающих; Он действует как башня управления для энергии, гормоны и детоксикации1. Из-за ее важности исследователи провели много in vitro и in vivo экспериментов для выяснения изменений в печени при воспалении. Для захвата изображений в реальном времени из печени2 был использован прижизненной микроскопии. Действительно различные печени, что тепловизионные методы были введены2,3,4,5,6. Однако с тем чтобы разработать более упрощенный хирургический подход и добиться стабилизации органа-мишени и иммунных клеток, мы разработали простой протокол, который может руководствоваться исследователи для сведения к минимуму их усилий для прижизненной визуализации.

В этом исследовании мы ввели стабильной и Роман тепловизионные камеры и хирургической техники, которые могут быть использованы для сведения к минимуму кровотечения и возможных инфекций. Мы подтвердили, что печень остается неизменным для более чем 2 ч. С помощью этого метода мы успешно определили морфологии LCMs7 и нейтрофилов под септические состояния. Поскольку этот метод минимизирует физических и биологических отягощающих факторов, таких как дрожали и неожиданные воспаления при хирургической процедуры, мы ожидаем, что этот метод может быть использован для наблюдения острых реакций иммунных клеток в печени в ответ на Реагенты, как LPS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры были проведены в соответствии с руководящими принципами институциональный уход животных и использования Комитета Йонсейского университета колледж медицины, Корея. LysM Зеленый флуоресцентный белок (GFP; gfp / +) мышах8 и CX3Cr1-GFP (gfp / +)9 мышей в возрасте 8-12 недель были использованы для прижизненной визуализации. Все хирургические инструменты были газобетона и дезинфекции с 70% спирта.

1. специально мышь печени изображений камеры с поддержкой инструменты

  1. Печень мыши изображений дизайн камеры
    1. Сделать камеру следующих размеров для мыши печени изображений (рис. 1): внутренний котел (120 мм длина × ширина 160 мм × 30 мм высота), наружная камера (100 мм длина × ширина 100 мм × 24 мм высота), болты (Ф 3 × 30 мм высота), орехи (Ф 4 мм) и крыловидные орехи (Ф 4 мм).
    2. Измерьте отверждения агента и эластомера в соотношении 1:9 сделать в общей сложности 120 g силикона.
    3. Поместите смесь жидкого силикона в 250 мл колбу Эрленмейера и хорошо перемешайте. Затем поставьте колбу в эксикаторе и удалить пузырьки воздуха около 1 h под вакуумом через насос.
    4. Вылить смесь жидкого силикона в камере специально мыши достигает 10 мм в высоту и пусть это лекарство за пару дней (рис. 1A).
  2. Подготовка Обложка слайды и печени, фиксация кровати
    1. На металлической раме Прикрепите крышку стекла с помощью силиконового клея. Пусть ему высохнуть на 1 день (рис. 1B).
    2. Чтобы эффективно провести дистиллированной воды для объектива погружения воды, перманентным структура воды преграждать имеет важное значение. Сделайте 1 мм, округления силиконовый клей и упрочить ее на ночь.
    3. Смешать отверждения агента и эластомера базы и затем налить его в 6-ну пластины на высоте из около 8-10 мм. выполнять процесс закалки как описано в 1.1.2-1.1.4.

2. Подготовка LPS

  1. Подготовьте стерильные 1 × фосфат амортизированное saline (PBS) для разбавления LPS порошок из Salmonella enterica серотип enteritidis. (1 × PBS: 137 мм NaCl, KCl 2,7 мм, 10 мм Na2HPO4, 1,8 мм х2PO4).
  2. Предварительно нагрейте PBS в водяной бане при 37 ° C и аккуратно откройте флакон порошок ПЛАСТИНОК (25 мг).
  3. С помощью пипетки помощи, налить стерильных PBS (5 мл) в бутылку порошок ПЛАСТИНОК и осторожно перемешать или приостановить решение подготовить раствор.
    Примечание: После того, как сжиженный LPS порошок, суровые vortexing может вызвать пузыри. Избегайте делать пузыри, чтобы свести к минимуму потери при принятии аликвоты в 1,5 мл пробирок.
  4. Хранить Стоковый раствор LPS −20 ° C и развести его в 1 мг/мл LPS раствор для инъекций.
  5. Inject LPS 1 мг/мл раствора (20 мг/кг) в брюшину не под наркозом мыши, используя шприц 1 мл. Для животных управления придать такой же объем PBS.
  6. Подождите 2 ч для достаточно воспалительной реакции.

3. Подготовка декстрана Техас-красное пятно кровеносных сосудов

  1. Подготовьте два конических труб 15 мл и 10 мл стерильной PBS.
  2. Разбавить декстрана Техас-красный порошок (25 мг) в 3 мл PBS и хорошо перемешайте. Передача смеси пустой 15-мл Конические трубки.
  3. Передать оставшихся PBS (7 мл) 15 мл Конические трубки, содержащие декстран смесь (3 мл).
  4. Подключите фильтр шприц 0,45 мкм до кончика шприц 10 мл. Шприц фильтр следует заменить иглу.
  5. Фильтр декстрана смесь (10 мл). Пресс шприц равномерно во избежание разлив.
  6. Отказаться от 500 мкл раствора 2,5 мг/мл декстрана в свет заблокирован 1,5-мл и хранить его на −20 ° C. После размораживания, храните при 4° C.

4. хирургического процесса

  1. Продезинфицируйте таблице хирургии и все инструменты, с помощью спирта 70% до операции. Затем установите инструменты для хирургии печени и отрегулировать нагревательная пластинка до 37 ° C (рис. 2A, B).
  2. Для анестезии внутрибрюшинно, придать мышей с 30 мг/кг tiletamine/zolazepam и 10 мг/кг Ксилазина. Эти решения могут быть смешанные и разводят в PBS для одновременного инъекций. Подтвердите анестезии, осторожно нажав мыс мыши.  Продолжить следующий шаг, когда есть не рефлекс.
  3. Применять небольшое количество глазную мазь для предотвращения сухости мыши сетчатки.
  4. Удаление волос тела вокруг области живота, используя крем для удаления волос (рис. 2 c).
  5. Придать 200 мкл раствора (концентрации 2,5 мг/мл) Техас-красный декстран через Вену хвост или ретро орбиталь впрыска с помощью шприца инсулина (Рисунок 2D).
  6. Марк правой онкогорошину области с маркером. Следует провести черту от мечевидного отростка до конца ребра. Вырежьте эпидермиса с щипцы и ножницы (Рисунок 2E, F).
  7. Откройте брюшной полости с помощью микро ножницы, щипцы и разоблачить печени тщательно. Левой боковой доли должны быть развернута с помощью ватных тампонов (Рисунок 2 g, H).
  8. Залейте 500 мкл стерильных PBS на брюшной полости для предотвращения сухости печени.
  9. Поместите курсор мыши на правой пролежни позиции в камере специально и применить небольшое количество клея ткани к постели кремния. Затем тщательно Прикрепите с помощью ватных тампонов (Рисунок 2I) печени.
    Примечание: Потому что очень рыхлая ткань печени, не вытащить механически печени. Аккуратно раскатайте с ватные тампоны.
  10. Несколько секунд спустя, влажные печени снова с 500 мкл стерильных PBS, чтобы избежать высыхания печени. Установите металлический каркас на печень и исправить это твердо с орехами (2J рисунок).

5. прижизненной визуализации печени с двух Фотон микроскопия

  1. Запуск ZEN программное обеспечение (Carl Zeiss) Включите лазер, установите волны 880 Нм, и набор зеленый и красный каналы. Отрегулируйте мощность лазера по интенсивности флуоресценции (рис. 3A). Информация фильтра выбросов является следующим: зеленый/Alexa488, 500-550 Нм и красный/Alexa 555, 575-610 Нм.
  2. Разместите камеру на стадии обработки изображений и место 20 X погружения в воду объектива рядом с покровным стеклом.
  3. Исправьте силиконовая резина нагреватель под мышь тела для поддержания ее температуры тела (рис. 3B).
  4. Оставьте 500 мкл дистиллированной воды на металлической раме и затем вытяните объектив недалеко от печени (рис. 3 c).
  5. Отрегулируйте фокус и определить глубину и время области изображения.
  6. Поведение визуализации.
  7. Для долгосрочное изображений, придать половину дозы смеси tiletamine/zolazepam и ксилазина каждый час во время визуализации. Поддержание температуры тела мышей при 37 ° C имеет важное значение на этом этапе. Всегда держите на глазу на мыши, поскольку время анестезии отличается от каждой мыши.
    Примечание: Этот метод не подходит для восстановления после операции и изображений. Мы этически жертву мыши сразу после операции.
  8. Проверьте педаль рефлексов для каждые 30 мин для стабильной анестезии.

6. анализ данных

  1. Откройте программное обеспечение для анализа данных Volocity и затем импортировать исходные данные в библиотеке в программное обеспечение.
  2. Удаление шума от изображения с учетом ситуации и сделать снимок.
    Примечание: Для получения гладкой изображений, используйте фильтр «Штраф» или «Медиана». Кроме того используйте функцию «Повышение контрастности» сделать темные или размытые изображения яснее.
  3. Поместиться 100% и экспорт измененные элементы как JPEG или TIFF файлы изображений — снимков и AVI-файлов для просмотра фильмов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Простой и очень стабильная тепловизионные камеры была разработана. В нижней части камеры была покрыта силикона, который предотвратить соскальзывание мыши тела и органов. Кроме того потому что кремний имеет правильное количество упругости, он может препятствовать ожидаемых повреждений, вызванных давлением слайд крышка (рис. 1A, C). Во-вторых, ткани Сейф клей (Vet Бонд) был применен для того, чтобы исправить извлеченные печени на кровати кольце...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Печени активно изучается многими группами3,10, ввиду важности его функции. К примеру Хейманн et al. предложил деликатный метода, с помощью агарозы. Хотя этот метод оказался весьма точные, параметр агарозы занимает время. Однако с нашей методологии, все процедуры могут осуществляться в течение 30 мин, сведения к минимуму других смешанных факторов. Во-вторых стабилизации печени является чрезвычайно важным, потому что сердцебиение может нарушить видео. Для устранени...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано грант от национального исследования Фонда из Кореи (NRF) финансируется правительством Кореи (MSIP; 2016R1A2B4008199 Грант № Y-м. H.), Министерство здравоохранения и социального обеспечения, Республика Корея (номер гранта: HI14C1324).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Изготовленная по индивидуальному заказу камераLive Cell InstrumentsИндивидуальный размер
Металлическая крышка предметного стеклаLive Cell InstrumentsИндивидуальный размер
Защитное стеклоЭлектронная микроскопия Sciences#72204-03
Sylgard 184 Комплект силиконовых эластомеровDow Corning
Erlenmeyer колбаDURAN21 216 36
Планшет для клеточных культур (плоский тип)HYUNDAI Micro Co.H31006
ЭксикаторADARSH55204
High Q BOND SE 5 млBJM LabДля изготовления полупостоянной плотины
Гибкие нагреватели из силиконовой резиныOmegaSRFR/SRFG SERIES, M1250/0800
Источник питания постоянного токаToyotechDP30-03A
Фосфатно-солевойДомашний
Липополисахариды (ЛПС) из Salmonella enteria серотипа enteritidisSigma-AldrichL6011
Texas Red DextranThermo Fisher ScientificD1830
15 мл Высокопрозрачный полипропилен<бр/> коническая трубкаFALCON14-959-49B
0,45 мкм; m фильтр (Minisart Шприц-фильтр)Sartorius16555k
1,5 мл микропробирка, янтарьAxygenMCT-150-XДля светоблокирующего
шприца 1 млКорейская вакцинаKV-S01
3 мл шприцКорея ВакцинаKV-S03
10 мл шприцКорея ВакцинаKV-S10
0,3 мл инсулиновый шприцBecton Dickinson324900
Крем для эпиляции 100 млBody natur
Ватный тампонABDI
Zoletil 50 5 млVirbac
Rompun 10 млBayer
Нагревательная пластинаLive Cell InstrumentsPH-S-10Индивидуальный размер
контроллера постоянного токаLive Cell InstrumentsCU-301
Ножницы для микродесекцииHarvard Apparatus72-5418
НожницыRobozRS-5882
ЩипцыRobozRS-5137
Vet bond3M1469SB
ZEN программное обеспечение (Черная версия)Carl ZeissПрограмма для LSM 7 МП
LSM 7 МПCarl Zeiss
Программа анализа VolocityPerkinElmer
буфер

Ссылки

  1. Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
  2. Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
  3. Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. J Vis Exp. (101), e52303(2015).
  4. Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).
  5. Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PLoS One. 6 (9), e25109(2011).
  6. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145(2012).
  7. Sierro, F., et al. A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment. Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).
  8. Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
  9. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  10. Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

intravital

Похожие статьи