Методическая статья

С помощью человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток получены гепатоцито как клетки для обнаружения наркотиков

DOI:

10.3791/57194

⸱

19 мая 2018 г.

 ,  , 
1Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленные здесь протокол описывает платформу для выявления мелких молекул для лечения заболеваний печени. Пошаговое описание представлены подробно как различать iPSCs в клетки с характеристиками гепатоцитов в 96-луночных пластин и использовать клетки для экрана для малых молекул с потенциальной терапевтической активностью.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Способности различать человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) в гепатоцито как клетки (кг) обеспечивает новые возможности для изучения врожденных печеночный метаболизм. Однако чтобы обеспечить платформу, которая поддерживает определение малых молекул, которые потенциально могут быть использованы для лечения заболеваний печени, процедура требует культуры формат, который совместим с экранирующей тысячи соединений. Здесь мы описываем протокол, с помощью полностью определенной культуры условий, которые позволяют воспроизводимые дифференциация человеческого iPSCs гепатоцито как клетки в культуре ткани 96-луночных пластины. Мы также предоставляем пример использования платформы для экрана соединений для их способности снижать аполипопротеина B (АПОВ) производится из iPSC производные гепатоцитов, созданный из семейной гиперхолестеринемией пациента. Наличие платформы, который совместим с лекарственных препаратов должно позволить исследователи для выявления роман терапии для лечения заболеваний, которые влияют на печень.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Успех в выявлении наркотиков, которые могут использоваться для целевой редкое заболевание опирается на развитие анализов, которые могут использоваться для проверки. Гипотеза или целевое экраны (обратный фармакологии) полезны, но требуют детального понимания молекулярные основы этой болезни. Фенотипические экраны (классической фармакологии) избежать необходимости детального понимания биохимические пути, но вместо этого полагаться на разработку моделей, которые точно отражают Патофизиология болезни. Несмотря на энтузиазм для целевых подходов анализ утвержденных FDA первого в класс наркотиков показывают, что Фенотипическая экраны были гораздо более успешным1. Общая цель этого метода заключается, чтобы создать платформу для высокой пропускной способности, скрининг, может использоваться для идентификации малых молекул для лечения метаболических заболеваний печени. Включая первичной гепатоцитов и клетки гепатомы печени прогениторных клеток2были описаны несколько моделей в пробирке . Однако большинство из этих моделей имеют ограничения, и существует потребность в новых моделей, которые можно точно охарактеризовать патофизиологии метаболизма печени недостатков в культуре. Недавно, человеческих плюрипотентных стволовых клеток в сочетании с Джин редактирования предложили возможность моделировать даже самые редкие из редких заболеваний в культуре без необходимости доступа пациентов непосредственно3. Хотя использование конкретного пациента iPSCs как инструмент для обнаружения малых молекул для лечения редких заболеваний печени является концептуально обоснованными, есть лишь несколько докладов, демонстрирующих возможности этот подход4. Однако мы недавно создали платформу, которая позволяет успешно идентифицировать наркотиков, которые можно многократно использовать для лечения недостатков в печени метаболизм5iPSC производные гепатоцитов.

Этот протокол объясняет процесс дифференциации человека iPSCs гепатоцито подобных клеток в 96-луночных пластин и их использование для экран Библиотека малых молекул. Он также описывает анализа конечной точки с помощью гиперхолестеринемии в качестве примера метаболических заболеваний печени. Этот подход должен быть полезным для изучения роли и применения малых молекул в контексте инфекционных заболеваний печени, метаболические заболевания печени, лекарственной токсичности и других расстройств печени.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Культура человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

  1. Покрытие рекомбинантного человеческого E-Кадгерины ФК синтез белка (E-cad ФК) или других матриц для hPSC культуры 6
    1. Разбавляют E-cad ФК 15 мкг/мл физиологическим Phosphate-Buffered Дульбекко содержащие кальция и магния (DPBS (+)).
    2. Слой 100-мм подвеска культуры ткани блюда с 5 мл разбавленной E-cad-ФК и Инкубируйте на 37 градусов для по крайней мере 1 h. удалить субстрат и заменить с 5 мл средства (например, mTeSR1, отныне называется M-средний)7.
      Примечание: Опубликованные протоколы7готовится питательной среды, используемые в настоящем Протоколе. Однако несколько других препаратов СМИ были описаны, доступны или коммерчески, вероятно, совместимы с процедурой.
    3. Получить флакон криоконсервированных iPSCs из жидкого азота. Оттепель в 37 градусов до тех пор, пока остается небольшой ледяной кристалл. Аккуратно Пипетка клетки в стерильных 15 мл конические трубка, содержащая 4 мл М-среды.
    4. Центрифуга на 300 x g 5 минут удалить супернатант и нежно вновь приостановить клетки с 5 мл среды, дополнена 10 мкм Y-27632, селективный ингибитор Ро связанных, биспиральных содержащих протеин киназы (рок).
    5. Удалите средство М из шага 1.1.2 и передачи 5 мл клеток из шага 1.1.4 E-cad-Fc покрытием 100-мм подвеска культуры ткани блюда.
  2. Сохранение человеческой iPSCs в культуре
    1. После iPSCs достигает около 80% confluency, удалите питательной среды раз промойте кальция и магния DPBS (-). Аспирационная DPBS (-) и добавьте достаточное количество 0,02% раствора ЭДТА накладки, то инкубации до 3 мин при комнатной температуре.
      Примечание: При впадении в 80% плита должна содержать около 2 x 107 клеток. Важно не зарастают клетки и гарантировать, что клетки сохраняют недифференцированные морфологии. Плюрипотентности клетки можно определить путем пятнать с стволовых клеток маркер Tra-1-60 или эквивалентный8.
    2. Как только клетки начинают выпуск, удалить раствор 0,02% ЭДТА и наводнений блюдо с 10 мл М-среды выпустить клетки. Помощь отряд iPSCs, нежно закупорить.
      Примечание: Средняя инкубации время для клеток для отсоединения около 3 минут, но это необходимо определить эмпирически для каждой линии iPSC. Клетки должны быть освобождены как небольших кластеров, содержащих около 5-10 iPSCs на кластер.
    3. Передача 1/10 подвесных клеток за свежие культуры ткани блюдо подвеска E-cad ФК покрытием 100 мм, содержащие 5 мл М-средний. Инкубировать культур при 37 ° c под 4% O2/5% CO2 и изменения среды ежедневно.
      Примечание: Хотя iPSCs регулярно культивировали в условиях физиологического кислорода для содействия плюрипотентности, iPSCs можно также выращивать с помощью атмосферного кислорода.

2. дифференциация человеческого iPSCs гепатоцито подобных клеток на 96-луночных пластины

Примечание: Этот раздел описывает дифференциация iPSCs в формате, который совместим с скрининга. Используя этот подход, можно вызвать человека iPSCs дифференцировать и формируют гепатоцито подобных клеток в течение 20 дней. Хотя это подходит для большинства анализов, длина культуры может продлеваться по улучшению зрелости клеток.

  1. Покрытие плиты 96-луночных тканевой культуры с уменьшение фактора роста базальной мембраны матрица
    1. Подготовьте запас путем разбавления матрицы до 2 мг/мл с ледяной стерильные среде DMEM/F12 культуры ткани. Разделите матрицы на 250 мкл аликвоты и хранить в-80 градусов до тех пор, пока требуется. Холод 10 мл DMEM/F12 на льду на 30 мин получить 250 мкл Алиготе акций матрица 2 мг/мл и оттепели на льду.
    2. Объединить матрица с 10 мл холодной среде DMEM/F12 путем смешивания аккуратно с помощью предварительно охлажденные пипетки сделать окончательный концентрации 0,05 мг/мл.
    3. Передачи 100 мкл разбавленного матрицы для каждой скважины плиту 96-луночных культуры ткани. Инкубируйте на 37 градусов, 4% O2/5% CO2 для по крайней мере 1 h. отменить матрицы и заменить 50 мкл M-средний за хорошо. Хранить при 37 ° C, 4% O2/5% CO2 до тех пор, пока требуется.
  2. Плита клетки для дифференциации
    1. Культура iPSCs на 100-мм пластины до тех пор, пока клетки подход 80% слияния. Убедитесь, что пластины содержит около 2 x 107 клеток. Определите число клеток клеток проточный цитометр или Горяева.
      Примечание: С опытом работы качество iPSCs клетки можно судить по микроскопии; Однако около 98% клеток выразить плюрипотентности маркеры например TRA-1-60 epitope когда измеряется СУИМ или иммуноокрашивания. Важно, что клетки остаются активного деления и не зарастает.
    2. Урожай iPSCs от каждого 100-мм пластины, аспирационная питательной среды и промыть с 5 мл DPBS (-). Заменить полоскание с 3 мл раствора отряд клеток (например, accutase) и проинкубируйте около 2 минут при 37 ° C, 4% O2/5% CO2.
      Примечание: Важно следовать за отрядом клеток при микроскопии. Сделать не на дайджест с accutase. Цель – освобождение клетки как небольших кластеров с минимальной обработкой.
    3. Как только клетки начинают отсоединить, урожай, добавляя 7 мл М-среды. Пипетка несколько раз, чтобы отделить колоний клеток в небольших кластеров вокруг 3-6 клеток (рис. 1A).
    4. Соберите iPSCs в стерильных пластиковых 15 мл пробирок и центрифуги на 300 x g 5 минут удалить супернатант и вновь приостановить Пелле клеток в 5 мл М-средний.
    5. Равномерно распределить клетки на 96-луночных матрица покрытием пластин, дозирования 50 мкл подвеска клеток в каждой скважине. Чтобы настроить каждый 96-луночных пластины, используйте один из 100-мм пластины iPSCs с клетки на приблизительно 80% confluency, который содержит около 5 х 106 клеток для установки дифференциации. Используйте многоканальные пипетки ускорить этот процесс. Культура клетки на ночь на 37 градусов, 4% O2/5% CO2.
      Примечание: Важно, что равное количество клеток осаждается в каждой скважине обеспечить воспроизводимость дифференцирования.
  3. Побудить дифференцировки клеток
    1. Изучите 96-луночных пластины по микроскопии для обеспечения что клетки охватывать по меньшей мере 70% поверхности каждого человека хорошо. Если охват составляет менее 70%, замените свежим среднего среднего и проинкубируйте дополнительные 24 ч при 37 ° c, 4% O2/5% CO2.
      Примечание: Инкубации клеток в течение более чем 48 часов после покрытия не вызывая дифференциация обычно снижает эффективность дифференциации. Дифференциация также произойдет с помощью атмосферного кислорода, хотя эффективность может быть пострадавших.
    2. День 1, день 2 дифференциации, замените питательной среды RPMI дополнена 2% B27 (без инсулина), 100 нг/мл Activin A, BMP4 10 нг/мл и 20 нг/мл FGF2. Добавьте 100 мкл среды в колодец и Инкубируйте на 37 градусов, окружающего O2/5% CO2 с ежедневно среднего изменения за 2 суток.
      Примечание: Борьбы с большим количеством пластин 96-луночных требуют использования помощи пипетки или робот. 12- и 96-канальные пипетки идеально подходят для ежедневного среднего изменения.
    3. На 3 день к день 5 дифференцировки заменить питательной среды с RPMI дополнена 2% B27 (без инсулина) и 100 нг/мл Activin а. культуры клеток в 37 градусов, окружающего O2/5% CO2 с ежедневно среднего изменения за 3 суток.
    4. В день 5, дифференциация перед заменой свежей питательной среды, лечить каждый также с 100 мкл 0,02% раствора ЭДТА для 30 сек, затем удалить и заменить с свежей питательной среды.
      Примечание: Если дифференциация чтобы эндодермы является эффективным, однослойная дифференциации клеток подвержен пилинг от пластины. Краткое обращение с 0,02% раствора ЭДТА помогает облегчить мобильный отряд. Это лечение не влияет на дифференциации в гепатоцитах.
    5. Для дифференциации между 6 дней 10 замените питательной среды с RPMI / 2% B27 (с инсулином) дополнены 20 нг/мл BMP4 и 10 нг/мл FGF2 и Инкубируйте на 37 градусов, 4% O2/5% CO2 на 5 дней с ежедневной среднего изменения. Этот этап стимулирует клетки дифференцироваться в клетки печени прародителя.
    6. Для дифференциации между 11 дней до 15 замените питательной среды с RPMI / 2% B27 (с инсулином) дополнены HGF 20 нг/мл. Инкубируйте на 37 градусов, 4% O2/5% CO2 на 5 дней с ежедневной среднего изменения.
    7. Для дифференциации между 16 дней до 20 замените гепатоцитов клеток питательной среды (HCM) дополнены 20 нг/мл Oncostatin-M (OSM) питательной среды. Инкубируйте клетки на 37 градусов, окружающего O2/5% CO2 с ежедневно среднего изменения на 5 дней.
      Примечание: Воспроизводимость дифференциации между отдельными скважин эффективно может определяться посредством измерения относительного уровня альбумина, AFP или АПОВ, выделяемый ELISA в среду (см. 3.2).

3. малые молекулы скрининг

Примечание: Ниже описывается процедура, используемая для выявления соединений, которые могут использоваться для снижения уровня АПОВ в среде гепатоцито как клетки, полученные из семейной гиперхолестеринемией iPSCs. Описание модели и ее использование в определении снижения холестерина наркотики подробно ранее5,9. В текущем примере были проверены 1000 соединений из библиотеки коллекции соединения Южная Каролина (SC3). Каждое соединение был испытан в концентрации 2 мкг/мл.

  1. Лечение iPSC - производных гепатоцитов с малых молекул
    1. Разбавьте мастер соединения библиотека для создания пластины рабочих запасов с соединениями в концентрации 20 мкг/мл в 2% ДМСО и хранить на уровне-20 ° c.
    2. Подготовьте достаточно 96-луночных пластины iPSC производные гепатоцитов, чтобы позволить каждого соединения для проверки.
      Примечание: Количество соединений для проверяться будут диктовать количество 96-луночных пластин, которые требуются. В общем сингл также должны быть готовы для каждого соединения, а также дополнительных скважин для любых элементов управления. Внешний скважин пластины обычно избежать уменьшить возможность краевых эффектов, которые могут повредить интерпретации. Ответы могут быть определены с помощью метода z скор без необходимости использовать реплицирует. Если репликация включена, это более целесообразно использовать t-тест.
    3. В связи с завершением дифференциации (день 20, см. 2.3.7), заменить питательной среды с 100 мкл свежих HCMдополнены 20 нг/мл Oncostatin-м. Инкубируйте на 37 градусов, 4% O2/5% CO2 для точно 24 h. получить питательной среды в свежий 96-луночных пластины и хранить на уровне-20 ° c. Используйте этот пример для вычисления уровня АПОВ в среде перед добавлением наркотиков.
    4. Добавление 90 мкл свежих HCM, дополнены 20 нг/мл Oncostatin-м в каждую лунку. Добавьте 10 мкл каждого соединения из рабочей партии после смешивания, закупорить. Добавить ДМСО на 0,2% до контроля скважин матч конечная концентрация в обработанных образцов и Инкубируйте на 37 градусов, окружающего O2/5% CO2 для точно 24 h. собирать питательной среды и хранить на уровне-20 ° c. Используйте этот пример для определения уровня АПОВ после лечения с соединениями.
    5. Дополнительно - остальные ячейки могут быть обработаны иммуноокрашивания, жизнеспособность клеток или анализ уровня мРНК, с использованием стандартных подходов.
      Примечание: Этот экран был разработан для выявления наркотиков, которые имели быстрое воздействие на уровни АПОВ. Однако в зависимости от модели болезни, вниз по течению анализов или механизм действия препарата, он может быть полезным для лечения образца для нескольких дней.
  2. Определить уровни АПОВ, Элиза
    1. Определения аполипопротеина B (АПОВ) концентрации от обоих пред- и пост наркотиков обработанных образцов с использованием человеческого развития АПОВ ELISA комплекта следующие протоколы производителя.
    2. Подготовка следующие решения
      1. Мыть буфера, состоящий из 0,05% 20 анимации в PBS, рН 7,4. Хранить при 4 ° c до использования.
      2. Инкубационный буфер, составленные из 0,05% 20 анимации и 0,1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBS, рН 7,4. Хранить при 4 ° c до использования.
    3. Подготовка антител АПОВ (МАБ 20/17) путем разбавления до 2 мкг/мл в PBS, рН 7,4. Добавьте 100 мкл разбавленного антитела на хорошо и Инкубируйте на 4 ° c на ночь.
    4. Удалите антитела от пластины пробирного и мыть каждый хорошо дважды с 200 мкл PBS, рН 7,4.
    5. Добавить 200 мкл/хорошо 0,05% Tween-20, 0.1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBS, рН 7,4 и инкубировать на тряску платформе за 1 ч при комнатной температуре.
    6. Подготовка 8-точка калибровочной кривой с помощью 0,05% 20 анимации и 0,1% BSA в PBS, рН 7,4 с следующих концентраций АПОВ: 300 нг/мл, 200 нг/мл, 175 нг/мл, 150 нг/мл, 125 нг/мл, 100 нг/мл, 75 нг/мл и 50 нг/мл.
    7. Разбавляют тестирования образцы 1:4 с 0,05% 20 анимации и 0,1% BSA в PBS, рН 7,4.
    8. После 1 h блокировки с буфером инкубации, сбросить буфер и мыть пробирного пластины пять раз с 200 мкл 0,05% 20 анимации в PBS, рН 7,4.
    9. Полностью удалить любые остаточные Отмывающий буфер и передаче 90 мкл разбавленного образцов и стандартов АПОВ пробирного пластины. Инкубации при комнатной температуре на шейкер для 1 h.
    10. Удалить образец и мыть с 200 мкл 0,05% 20 анимации в PBS, рН 7,4 в колодец. Повторите стирок в общей сложности 5 раз. Добавьте 100 мкл на хорошо МАБ ЛПНП 11-биотин разбавленных 1:1,000 0,05% 20 анимации и 0,1% BSA в PBS, рН 7,4. Инкубации при комнатной температуре на тряску платформу для 1 h.
    11. Отменить реагент и мыть с 200 мкл на хорошо Отмывающий буфер 5 раз. Добавить 100 мкл на хорошо антитела стрептавидина-ПХ (1:1, 000 разрежения с помощью инкубации буфера), затем инкубации при комнатной температуре на тряску платформу для 1 h.
    12. Отменить реагент и мыть с 200 мкл 0,05% 20 анимации в PBS, рН 7,4 в колодец. Повторите стирок в общей сложности 5 раз. Полностью удалить остаточные Отмывающий буфер из плит пробирного и добавить 100 мкл на хорошо Tetramethylbenzidin (ТМБ) раствора субстрата и инкубации при комнатной температуре за 8 мин.
    13. Без удаления субстрата ТМБ, напрямую добавьте 100 мкл на хорошо стоп раствора (1N HCl).
    14. Определить поглощения в 450 Нм, с помощью пластины читателя.
    15. С помощью метода четыре параметра логистической регрессии, а затем используется для определения концентрации АПОВ в каждом образце10может устанавливаться калибровочной кривой.
    16. Изучить до наркотиков: после наркотиков соотношение АПОВ в каждом примере для определения соединений с потенциалом для снижения АПОВ уровнях в среде.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поколение гепатоцитов - как клетки: Рисунок 1 описывает сроки изменения, которые происходят во время дифференциация человеческого iPSCs гепатоцито подобных клеток. Культура iPSCs на E-Cad-ФК обеспечивает примерно 2 мм диаметр колоний, которые выражают плюрипотентных маркер OCT4 (рис. 1A-B). Морфология клеток, выращенных на E-Кадгерины матрица будет немного отлича...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Целевой основе лекарств, где выявлены небольшие молекулы которые влияют на активность определенного белка, был в центре внимания многих существующих скрининг усилия. Хотя этот подход предоставил многочисленные Фармацевтика, экраны, основанные на натяжном фенотип, классической фармакологии, были более успешными в выявлении первого в класс соединений, которые были клинически эффективным1. Недостаток фенотипические лекарств является, что она зависит от наличия соответствующей болезни моделей. Это мож...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана национальных институтов здравоохранения (DK55743, DK087377, DK102716 и HG006398 к САР). Мы хотели бы поблагодарить д-ра Behshad Pournasr, д-р Джеймс Хеслоп и Цзин побежал за их вклад.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Стерильные чашки для культивирования тканей 100 мм x 20 мм Corning430167
100 мм x 20 мм стерильные чашки для культуры суспензииCorning430591
96-луночный планшет для культуры тканей Corning3595
Античеловеческий альбуминDakoA 0001
Античеловеческий FOXA2(6C12)Novus BiologicalH00003170-M12
Античеловеческий HNF4 альфаSanta CruzSC-6556
Античеловеческий антитело Oct-3/4Santa CruzSC-9081
Античеловеческий SOX17R& DAF1924
Античеловеческий TRA-1-60 FITC конъюгированныймиллипорFCMAB115F
активином А рекомбинантный человеческий белок Добавка ИнвитрогенPHC9563
В-27, за вычетом инсулина Invitrogen0050129SA
B-27 Добавка, без сыворотки Инвитроген17504044
рекомбинантный человеческий белок BMP4 InvitrogenPHC9533
StemPro  Accutase Invitrogen
CellTiter-Glo Promega7572
DPBS+(кальций, магний)Invitrogen14040-133
DPBS-(без кальция, без магния)Invitrogen14190-144
DMEM/F-12, HEPES Invitrogen11330057
ELISA human APOB ELISA development kitMabtech3715-1H-20
Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2)InvitrogenPHG0023
гепатоцитарная культуральная среда (HCM Bullet Kit) LonzaCC-3198
Фактор роста гепатоцитов  (ХГФ)InvitrogenPHC0321
L-глютамин Invitrogen25030081
MEM раствор заменимых аминокислотInvitrogen11140076
Oncostatin M (OSM) рекомбинантный белок человека ИнвитрогенPHC5015
пенициллин-стрептомицин Invitrogen15140163
Питательная среда для свободных плюрипотентных стволовых клеток: mTesR1 Технологии стволовых клеток5850
Матрикс базальной мембраны с пониженным фактором роста ИнвитрогенA1413301
RPMI 1640 средний, HEPES Invitrogen22400105
StemStick Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc)Primorigen BiosciencesS2071
TMB-ELISA Substrate SolutionThermo Scientific 34022
Anti-TRA-1-60 FITC конъюгированныйMilliporeFCMAB115F
Versene (EDTA) 0,02% Lonza17-711E
Y-27632 Ингибитор ROCKSTEMCELL Technologies72302
Реагент для диссоциации клеток Анализ жизнеспособности люминесцентных клеток A1110501

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered? Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
  2. Zeilinger, K., Freyer, N., Damm, G., Seehofer, D., Knospel, F. Cell sources for in vitro human liver cell culture models. Exp Biol Med (Maywood. 241 (15), 1684-1698 (2016).
  3. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
  4. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
  5. Cayo, M. A., et al. A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia. Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).
  6. Nagaoka, M., et al. E-cadherin-coated plates maintain pluripotent ES cells without colony formation. PLoS One. 1, e15(2006).
  7. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
  8. International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
  9. Cayo, M. A., et al. JD induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes faithfully recapitulate the pathophysiology of familial hypercholesterolemia. Hepatology. 56 (6), 2163-2171 (2012).
  10. DeSilva, B., et al. Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules. Pharm Res. 20 (11), 1885-1900 (2003).
  11. Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells Dev. 19 (8), 1231-1240 (2010).
  12. Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60(2010).
  13. Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells. 26 (4), 894-902 (2008).
  14. Mallanna, S. K., Cayo, M. A., Twaroski, K., Gundry, R. L., Duncan, S. A. Mapping the Cell-Surface N-Glycoproteome of Human Hepatocytes Reveals Markers for Selecting a Homogeneous Population of iPSC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 7 (3), 543-556 (2016).
  15. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  16. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J Biomol Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
  17. Lorenz, C., et al. Human iPSC-Derived Neural Progenitors Are an Effective Drug Discovery Model for Neurological mtDNA Disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
  18. Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).
  19. Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17 (8), 971-983 (2015).
  20. Ogawa, M., et al. Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (8), 853-861 (2015).
  21. Sampaziotis, F., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nat Biotechnol. 33 (8), 845-852 (2015).
  22. Mallanna, S. K., Duncan, S. A. Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 26 (Unit 1G 4), (2013).
  23. Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Res. 19 (11), 1233-1242 (2009).
  24. Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).
  25. Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
  26. Pashos, E. E., et al. Diverse Population Cohorts of hiPSCs and Derived Hepatocyte-like Cells Reveal Functional Genetic Variation at Blood Lipid-Associated Loci. Cell Stem Cell. 20 (4), 558-570 (2017).
  27. Davidson, M. D., Ware, B. R., Khetani, S. R. Stem cell-derived liver cells for drug testing and disease modeling. Discov Med. 19 (106), 349-358 (2015).
  28. Choi, S. M., et al. Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells. Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).
  29. Tafaleng, E. N., et al. Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from alpha1-antitrypsin deficiency. Hepatology. 62 (1), 147-157 (2015).
  30. Jing, R., Duncan, C. B., Duncan, S. A. A small-molecule screen reveals that HSP90beta promotes the conversion of induced pluripotent stem cell-derived endoderm to a hepatic fate and regulates HNF4A turnover. Development. 144 (10), 1764-1774 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

96B

Похожие статьи