Методическая статья

Встраивание парафин и тонкий секционирование колонии микробной биоплёнки для микроскопического анализа

DOI:

10.3791/57196

⸱

23 марта 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Columbia University, 2Department of Biology, Barnard College, Columbia University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем фиксации, внедрение парафин и тонкого резания методы для колонии микробной биопленки. В подготовленных образцах биопленки каркаса и репортер выражение шаблоны могут быть визуализированы при микроскопии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Секционирование через встраивание парафин методика широко установленным в eukaryotic систем. Здесь мы предоставляем метод для фиксации, внедрение и секционирование нетронутыми микробной колонии биоплёнки с помощью перфузии парафина. Адаптировать этот метод для использования на колонии биопленки, мы разработали методы для поддержания каждого образца на подложке ее роста и ламинирование с агар слоя и Добавлено Лизин в фиксирующие решение. Эти оптимизации улучшить образца удержание и сохранение функции микроморфологических. Подготовленный таким образом образцы поддаются тонких секционирование и изображений на свет, флуоресценции и передачи электронной микроскопии. Мы применили эту технику в колонии биоплёнки Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilisи Vibrio cholerae. Высокий уровень детализации, видимой в образцах, созданный этим методом, в сочетании с репортером штамм инженерных или использование определенных красителей, может предоставить интересные идеи в физиологии и развитие микробных сообществ.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Большинство микробы способны формы биопленки, общины клеток скрепленных собственного производства матриц. Биопленки можно выращивать во многих типах физических установок, с различных режимов предоставления питательных веществ и субстрата. Конкретных анализов для биопленки, как правило, дают воспроизводимости многоклеточные структуры, и общей архитектуры наблюдаются филогенетически разнообразных видов на макроскопическом уровне или сообщества. Когда микробы выращиваются как колоний на твердом носителе под атмосферу, макроскопической морфология передает сведения о емкости для производства матрицы и часто коррелирует с2,другие черты в 1,3. Внутренняя архитектура микробной колоний может также предоставить подсказки относительно конкретных биопленки химия и физиология, но было трудно охарактеризовать. Последние приложений загрузки криостата и cryosectioning методов бактериальных колоний позволили изображений и визуализации определенных функций на беспрецедентной резолюции 4,5,6. Однако исследования с тканей животных показали, что парафин встраивание обеспечивает улучшенный сохранение морфологии, когда по сравнению с загрузки криостата 7 и был использован для визуализации бактерий в тканях 8,9. Поэтому мы разработали протокол для фиксации, внедрение парафин и тонкие секционирование колонии микробной биопленки. Здесь мы будем описывать подготовки Pseudomonas aeruginosa PA14 колонии биопленки шлифов 10,11, но мы также успешно применен этот метод к биопленки, образованный бактерии Pseudomonas synxantha, Сенная палочка, и холерный вибрион12.

Процесс биоплёнки парафин встраивание и тонко секционирования следует простая логика. Во-первых биоплёнки помещены в слое агар для сохранения морфология во время обработки. Во-вторых заключенная биоплёнки погружали в фиксатор чтобы crosslink макромолекул и сохранить микроморфологии. Эти затем обезвоживается с алкоголем, очищаются с более неполярных растворителей и затем проникли с жидкого парафина. После того, как проникли, образцы встроены блоки воск для разрезания. Секции являются вырезать, монтируется на слайдах и затем Регидратированные для того, чтобы вернуть их в более родного государства. С этого момента они могут окрашенных или покрыты в среде установки для микроскопического анализа.

Этот протокол производит шлифов микробной биоплёнки подходит для гистологического анализа. Колонии биопленки подструктурами видны, когда шлифов, подготовлен с использованием этого метода отражаются на световой микроскопии. Биопленки можно также выращивать на СМИ содержащие флуоресцентные пятна специфических для индивидуальных особенностей или витражи на шаге регидратации, непосредственно до монтажа (шаги 9.5-9,6). Наконец микробы могут быть спроектированы для получения флуоресцентных белков в учредительных или регулируется моды, позволяя в situ отчетности распределения или гена выражения ячейки в этих общинах. Мы использовали эти методы для определения глубины биопленки колонии, распределение ячеек, матрица распределения, шаблонов роста и экспрессии генов пространственно-временных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. рост Pseudomonas aeruginosa биоплёнки колонии

  1. Подготовка среднего бислой пластин
    1. Подготовить Триптон 10 г/Л, 10 г/Л агар решение (см. Таблицу материалов) в деионизированной воде.
    2. Автоклав для 20 минут остыть до 50-60 ° C на водяной бане.
    3. Налейте 45 мл раствора агар Триптон квадратных блюдо 100 мм x 100 мм (см. Таблицу материалы) с использованием 50 мл Конические трубки. Разрешить агар затвердеть (~ 20-30 мин). Залейте второй, 15 мл слой поверх первого слоя. Пусть затвердеть на ночь, при необходимости удаления конденсата из крышки, вытирая безворсовой салфеткой.
  2. Кровянистые выделения биоплёнки колонии
    1. Полоска штаммов интерес из морозильника запасов на LB агар пластины13 и инкубировать в темноте для 12-16 ч при 37 ° C и 80-100% относительной влажности.
    2. Для каждого штамма или репликации используйте единую колонию для прививок 2 мл фунтов и инкубировать в темноте для 12-16 ч при 37 ° C с встряхивания на 250 об/мин.
    3. Югу культуры путем разбавления 1: 100 в свежие LB и инкубации в темноте для 2,5-3 ч при 37 ° C с встряхивания на 250 об/мин.
    4. Измерение оптической плотности, используя спектрофотометр и отрегулировать с стерильных фунтов для достижения суспензию клеток с ОД500 Нм ~ 0,5.
    5. В зависимости от желаемого колонии размер, накапайте 2,5-10 мкл суспензии клеток на средне бислой пластину (подготовленный на этапе 1.1) и позволяют пятно сухой ~ 20 мин, оставив крышку Петри приоткрытой вблизи открытого пламени может способствовать сушки.
    6. Инкубируйте месте колонии при 25 ° C и 80-100% относительной влажности, в темноте до 4 дней.

2. Подготовка фиксирующие решения

  1. Подготовьте фиксирующие решение в день уборки образца. Разбавить 37% формальдегида (ФА) в однократном ПБС в конечной концентрации 4% FA.
    Предупреждение: FA летучих и токсичных. Носить защитное снаряжение и работать в хорошо проветриваемом зонта.
  2. Непосредственно перед применением, распустить L-лизина гидрохлорид в 4% FA (подготовленных на шаге 2.1) при комнатной температуре до конечной концентрации 50 мм L-лизин HCl.

3. прямое применение фиксатором в колонии биопленки [опционально]

Примечание: Мы обнаружили, что морфология биопленки лучше всего сохранилась когда агар наложения добавляется до фиксации. Однако этот шаг также является изменение экологических условий, которые могут влиять на экспрессию генов. Флуоресцентный репортер выражение шаблоны таким образом должны быть проверены с помощью отдельного протокола, в котором осуществляется фиксация шаг перед добавлением агар оверлея, как описано здесь.

  1. В день фиксации, и работать в хорошо проветриваемом Зонта Пипетка фиксатором, подготовленные на шаге 2 непосредственно на поверхности агара вокруг колонии края, что позволяет ему достичь периферии колонии без погружаемой его. Примените только как много фиксатор, как это необходимо для полного объемного колонии, примерно 500 мкл. фиксатор диффундируют в колонии и окружающие агар.
  2. После того, как фиксатор был полностью всасывается в колонии и окружающие СМИ, около 20-30 мин, и остаточные FA больше не виден на табличке, повторите шаг 3.1. Разрешить этот фиксатор диффундируют в колонии и окружающие агар.
  3. После того, как фиксатор был полностью всасывается в колонии и окружающие СМИ повторите шаг 3.1, на этот раз, применяя фиксатором на поверхности колонии непосредственно. Разрешить этот фиксатор диффундируют в колонии и окружающие агар, перейти к шагу 4 только после всех фиксирующие был всасывается и больше не виден на плите.

4. Наложение колоний с агар

  1. В день фиксации Подготовьте 10 г/Л агар решение в дейонизированной воде и автоклав для 10-20 минут, чтобы распустить. Прохладно в водяной бане до 50 градусов.
  2. Осторожно залейте 15 мл раствора агар среднего роста и колонии. Разрешить агар сформировать гель при комнатной температуре в течение 5 мин (рис. 1B).
  3. Используйте острые лезвия бритвы вырезать квадратный, 3-слойный патрон с колонией, ламинированные между два верхних слоя. Если подготовка нескольких образцов, убедитесь, что каждый патрон разрубается сопоставимого размера.
  4. Осторожно удалите избыток агар из колонии содержащих патрона.
  5. Чтобы поднять два верхних слоев агар (содержащие колонии) от нижнего слоя патрона (рис. 1 c), влажные плоский шпатель в 1 x PBS или воды и осторожно вставьте между верхней и нижней слоями. Ламинированные колонии следует отделить от нижнего слоя. Будьте осторожны, чтобы не исказить или согнуть ламинированные колонии, доставая его из своей базы.

5. Фиксация

  1. Работа в хорошо проветриваемых Зонта, немедленно перевести ламинированные колонии (т.е., 2-слойные Чак) в внедрения кассеты (см. Таблицу материалы), помечены с химической устойчивостью маркером. Поместите внедрения кассету в почтовой программе слайд стекла (см. таблицу материалов) с фиксатором, подготовленный в шагах 2.1-2.2. Убедитесь, что есть нет пузырьков воздуха в ловушке внутри кассеты с внедрения.
  2. Проинкубируйте образцы в фиксатор на ночь в темноте при комнатной температуре.

6. образец обработки: Буфер мыть, осушки, очистки и инфильтрации

  1. После ночи фиксации Вымойте образец дважды в однократном ПБС за 1 ч. Для достижения наилучших результатов, автоматизировать гомогенизации реагентом, с помощью спин функция автоматического ткани процессора (см. таблицу материалов) присвоено значение низкий. Если не процессор доступен, обработка может выполняться вручную.
  2. Следуйте буфера мытья по обезвоживанию через серию градуированных этанола (EtOH) разведений в однократном ПБС (25%, 50%, 70%, 95%) за 1 ч при комнатной температуре.
  3. Обезвоживает в три автомойки 100% EtOH за 1 ч при комнатной температуре.
  4. Очистить обезвоженный образец в три автомойки 100% апельсин на масляной основе таможенного агента (см. таблицу материалов) за 1 ч при комнатной температуре.
  5. Инфильтрат, очищается образец дважды с расплавленный парафин воск (см. Таблицу материалы), нагревают до 55˚C, 2 ч.

7. пример внедрения

  1. Залейте расплавленный парафин нагревается до 55 градусов восковой формы. Лопаточкой подогревом, плоские для быстрой передачи проникли патрона от внедрения кассету в восковой формы, обеспечивая, что Чак лежит параллельно основание прессформы. Избегайте чрезмерного давления на патрон. Воск формы могут быть пользовательские 3-D печати или коммерчески доступных (см. Таблицу материалы).
  2. Разрешить воска, чтобы затвердеть на ночь при 4 ° c. Образцы, формованных в твердый воск может храниться бессрочно в 4 градусов.
  3. После того, как воск затвердевшим, акцизный образца от плесени и обрезать излишки воска от вокруг образца с лезвием бритвы. Оставьте излишки воска, простирающейся от одного конца образца, которая параллельна плоскости секционирование, которая может использоваться для зажима в микротома (см. Таблицу материалы). Также оставьте оболочкой воск, примерно 1 мм толщиной, вокруг образца и гладкой его лица.

8. секционирование

  1. Нагревают на водяной бане до 42 градусов. Зажимайте образец в микротом с поверхностью колонии, ориентированные перпендикулярно к краю лезвия (см. Таблицу материалы).
  2. Трим образца в интервалах 50 мкм, пока не будет достигнуто желаемого плоскости колонии, из которого будут собраны разделы.
  3. Перерезали ленточку нужное количество 10 мкм толщиной секций, используя микротом набор для резания скорость 75-80 об/мин и разминированию угол 6-10 ˚. Используйте кисть, острым концом для отсоединения ленты от лезвия.
  4. Аккуратно с помощью капли воды на кончике пипетка Пастера (предпочтительно) или щипцы, передачи ленты на водяной бане. Будьте осторожны избежать захвата воздушных пузырьков в разделе.
  5. Сразу вставить слайд в ванну воды и поместите его под лентой под углом 45о.
  6. Коснуться края узкие ленты на слайд, чуть ниже матовое метки. Ленты должны присоединиться.
  7. Затвор из водяной бани, регулируя угол для того чтобы стать перпендикулярно к поверхности воды и позволяя ленты лежать против слайд вдоль его длины. Избегайте ловушки избыток воды под лентой.
  8. Аккуратно стоите слайд на абсорбирующий безворсовой ткани, влагу лишнюю воду из секции.
  9. Положите слайд на бумажное полотенце и дайте ему высохнуть при комнатной температуре на ночь в темноте. Слайды можно хранить бессрочно в 4 градусов в темноте.

9. тепло фиксации, регидратации и монтаж

  1. Тепло выровняли плита до 45 градусов. Тепла слайд за 30-60 мин. Воск станет полу расплавленного и сгладить против слайд.
  2. Аккуратно снять слайд из поджарки и заложить плашмя на поверхность гладкой, выровненные, комнатной температуры, с использованием меры к тому, что расплавленный воск не тянуть к любой стороне слайда, до тех пор, пока воск затвердеет (~ 1 мин).
  3. С помощью рассылки слайд стекла, де воск слайды в четырех моет очистки агента для 5 минут каждый, с использованием Бюхнера Аспиратор для удаления решение между моет.
  4. Вымойте слайды три раза в 100% EtOH за 1 мин.
  5. Увлажняет слайды в градуированных серии этанола в обратном порядке обработки (95%, 70%, 50% и 25%), за 1 мин, которую каждый следуют два 1-мин моет в однократном ПБС.
  6. Сразу же монтировать разделы в среде трис буфер монтажа (см. Таблицу материалы) и применить coverslip, избегая внедрения воздушных пузырьков. Позволяют монтаж среднего для полимеризации на ночь при комнатной температуре.
  7. После полимеризуется, печать coverslip на слайд, используя четкие ногтей. Запечатанный слайды могут храниться бессрочно в темноте на 4 градусов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод создает биопленки, тонко секции которой морфологических особенностей и зон экспрессии генов может быть imaged DIC, флуоресцентной микроскопии и ТЕА. В то время как DIC изображений с помощью 40 X цель погружения нефти может быть достаточно, чтобы показать некоторые морфологические особенности (Рисунок 2E), мы нашли что флуоресценции микроскопии штаммов инженерии конститутивно Экспресс флуоресцентный белок обеспечивает расширение визуализация распред...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Образцы тканей парафин встраивание и тонко секционирования представляет собой классический гистологический метод, который позволяет изображения микро морфологических структур и широко используется на эукариотических ткани и с некоторым успехом был применен для микробиологических образцов8 ,9. Хотя загрузки криостата позволяет сильный удержания эндогенных и immunofluorescent сигнала, парафин встраивание обычно предпочтительнее, как он обеспечивает лучшее сохранен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана NSF карьеры премии 1553023 и NIH/NIAID премии R01AI103369.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
5 3/4" Пастеровская пипеткаFisher Scientific13-678-6AПриобретена в университетских биомагазинах 
Агар Текнова A7777
Бухнеровский аспиратор (вакуум) колба Pyrex5340Куплено в университетских биомагазинах 
Химически стойкая маркировочная ручкаVWR103051-182Производитель: Leica
Clear Лак для ногтей Купленный в магазине
Конго красный индикатор классаVWRAAAB24310-14Производитель: Alfa Aesar
Coomassie Blue VWREM-3340Производитель: EMD Millipore
TRIS-buffered Монтажная среда (с DAPI) Fisher Scientific50 247 04Производитель: Электронная микроскопия Sciences
Embedding Mold 3D-печатная
собственная форма для встраивания (коммерческая) Электронная микроскопия науки70182
Этанол 200PDecon Labs, Inc. 2701Куплено в университетских биомагазинах 
тонким наконечникомМагазинная куплена, кисть для рисования
Glass Coverslips 60x22ммFisher Scientific12-519-21C
Glass Rehydration Mailer Тед Пелла2104320 слайд-почтовая рассылка 
Histoclear-II, очищающий агент на основе апельсинового масла Fisher Scientific50 899 90150Производитель: National Diagnostics 
Histosette, встраивание CasetteFisher Scientific15 182 701A
L-лизина гидрохлорид Fisher ScientificBP386 100
Низкопрофильные микротомные лезвияFisher Scientific22 210 048Производитель: Sturkey 
Микропипетка VWR89080-004Promo-pack
Наконечники для микропипеток Смотрите разделкомментариев стр10 (Fisher Scientific, 02 707 469), стр. 200 (VWR, 89079-474), стр. 1250 (VWR, 89079-486).
Fisher Scientific905200U/00016050Модель: HM355S, Производитель: Microm, НЕТ КАТАЛОГА, Каталог поставщика # 905200U/00016050
Формальдегид, 37% водный (формалин)Ricca ChemicalRSOF0010-500A
Paraplast Xtra (парафин)VWR15159-486Производитель: McCormick Scientific 
Чашки Петри квадратные 100x100x15ммлабораторные одноразовые изделия D210-16
Хлорид калия EMD Chemicals PX1405-1Компонент фосфатно-солевого буфера, приготовленный на собственном производстве 
Фосфат калия Fisher ScientificP380-500Компонент фосфатного буферного раствора, приготовленный на собственном производстве 
Бритвенные лезвия VWR55411-050Приобретен в университетских биомагазинах 
Подогреватель горки Fisher ScientificNC0865259НЕ КАТАЛОГ, Каталог поставщика # 12857D
Хлорид натрия VWR0241-1KGКомпонент фосфатно-солевого буфера, приготовленный на собственном производстве 
Фосфат натрия VWRBDH9296.500, компонент фосфатного буферного раствора, приготовленный на собственном производстве 
Гистология надмерзлотных пород Слайды Fisher Scientific12-544-2
Тканевая флотационная водяная баня Научный NC0815797 FisherПроизводитель: Тед Пелла, Каталог производителя # 28156-B
Автоматический процессор салфеток Fisher Scientific813160U/Q#00009061Модель: STP120 Тканевый процессор
Триптон Текнова T9012
Дрожжевой экстрактTeknova У9010
Кисть с .

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ray, V. A., Morris, A. R., Visick, K. L. A semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development. J. Vis. Exp. (64), e4035(2012).
  2. Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol. Microbiol. 51 (3), 675-690 (2004).
  3. Okegbe, C., et al. Electron-shuttling antibiotics structure bacterial communities by modulating cellular levels of c-di-GMP. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114 (26), E5236-E5245 (2017).
  4. Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22 (7), 945-953 (2008).
  5. Serra, D. O., Richter, A. M., Klauck, G., Mika, F., Hengge, R. Microanatomy at cellular resolution and spatial order of physiological differentiation in a bacterial biofilm. MBio. 4 (2), e00103-e00113 (2013).
  6. Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms. J. Bacteriol. 195 (24), 5540-5554 (2013).
  7. McGlinn, E., Mansfield, J. H. Detection of gene expression in mouse embryos and tissue sections. Methods Mol. Biol. 770, 259-292 (2011).
  8. Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA. J. Vis. Exp. (99), e52836(2015).
  9. James, G., Hunt, A. M. A. Imaging Biofilms in Tissue Specimens. Antibiofilm Agents. , 31-44 (2014).
  10. Madsen, J. S., et al. Facultative control of matrix production optimizes competitive fitness in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilm models. Appl. Environ. Microbiol. 81 (24), 8414-8426 (2015).
  11. Jo, J., Cortez, K. L., Cornell, W. -C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. An orphan cbb3-type cytochrome oxidase subunit supports Pseudomonas aeruginosa biofilm growth and virulence. bioRxiv. , 171538(2017).
  12. Fong, J. C., et al. Structural dynamics of RbmA governs plasticity of Vibrio cholerae biofilms. Elife. 6, (2017).
  13. Bertani, G. Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems. J. Bacteriol. 186 (3), 595-600 (2004).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  15. Dietrich, L. E. P., Teal, T. K., Price-Whelan, A., Newman, D. K. Redox-active antibiotics control gene expression and community behavior in divergent bacteria. Science. 321 (5893), 1203-1206 (2008).
  16. Zupančič, D., Terčelj, M., Štrus, B., Veranič, P. How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section? Protoplasma. , (2017).
  17. Priester, J. H., et al. Enhanced visualization of microbial biofilms by staining and environmental scanning electron microscopy. J. Microbiol. Methods. 68 (3), 577-587 (2007).
  18. Boyles, J., Anderson, L., Hutcherson, P. A new fixative for the preservation of actin filaments: fixation of pure actin filament pellets. J. Histochem. Cytochem. 33 (11), 1116-1128 (1985).
  19. Blackburn, M. R. Examination of normal and abnormal placentation in the mouse. Methods Mol. Biol. 136, 185-193 (2000).
  20. Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. J. Biol. Chem. 290 (44), 26404-26411 (2015).
  21. Jennings, L. K., et al. Pel is a cationic exopolysaccharide that cross-links extracellular DNA in the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (36), 11353-11358 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи