Количественная оценка конкретных участков белка лизин ацетилирования и стехиометрии Succinylation с помощью приобретения данных независимые масс-спектрометрия

Краткое содержание

Здесь мы представляем объективной количественной оценки конкретных участков белка ацетилирования и/или succinylation размещение (стехиометрии) всего протеома путем анализа ratiometric эндогенные изменения внесенные после количественных химические Ацилирование с использованием стабильных изотопов меченых ангидриды. В сочетании с приобретения чувствительных данных независимые масс-спектрометрии получены точные сайта размещение измерений.

Аннотация

Столб-поступательные изменения (ПТМ) белков остатков лизина,_Ɛ- ацилирования N побуждает структурные изменения, которые могут динамически регулировать функций белков, например, путем изменения ферментативной активности или посреднических взаимодействий. Точное количественное определение конкретных участков белка Ацилирование размещение или стехиометрии, имеет важное значение для понимания функциональных последствий глобальной низкоуровневых стехиометрии и отдельных высокого уровня Ацилирование стехиометрии конкретных лизина остатков. Другие группы сообщили измерение лизин ацетилирования стехиометрии, сравнивая соотношение пептид прекурсоров изотопов от эндогенных, естественный изобилие ацилирования и экзогенные, тяжелые меченных изотопом Ацилирование представил после количественных Химическая ацетилирования белков с помощью стабильных изотопов меченых ангидрида уксусной кислоты. Этот протокол описывает оптимизированный подход, показывая несколько улучшений, в том числе: (1) повысили эффективность химического ацилирование, (2) возможность измерения протеина succinylation помимо ацетилирования и (3) улучшение количественных точности из-за сокращение помех с помощью фрагмент Ион Квантификация от приобретения данных независимые (DIA) вместо прекурсоров Ион сигнала от приобретения зависящих от данных (ДВР). Использование районов извлеченные пик от ионов фрагмент для количественной оценки также однозначно позволяет дифференциации уровня сайта Ацилирование стехиометрии из протеолитических пептиды, содержащие более одного остатков лизина, который не возможно с использованием прекурсоров Ион сигналы для количественной оценки. Визуализация данных в Skyline, открытым исходным кодом количественного протеомики среде, позволяет удобно данных проверки и рассмотрения. Вместе этот рабочий процесс предоставляет точной, беспристрастной и точной количественной оценки участкам лизин ацетилирования и succinylation размещение всего протеом, который может выявить и приоритеты Ацилирование биологически соответствующих сайтов.

Введение

N_Ɛ- ацилирования белков остатков лизина является важным регулятором функции протеина. Ацетилирования лизина и других acylations, например succinylation, malonylation и glutarylation, как полагают, регулировать обмен веществ, клетки сигнализации и другие клеточные процессы^1,2,3,4 , и имеют последствия в метаболических расстройств⁵. Многочисленные исследования показали, что ацильные модификации лизина проходят большие складки изменения в различных условиях в тканях млекопитающих и клеточной линии^5,6,,78 , а также бактерии^9,10,11, однако, эти изменения относительной раза не обеспечивают понимание доли общего белка изменения. Исследований, измерений заполненности сайт Ацилирование дефицитных^12,13,14, несмотря на актуальность и потребность таких исследований, поскольку они обеспечивают более подробно, чем относительные раз отчетности изменения. Например десятикратного изменения может представлять увеличение размещение сайта от 0.01 до 0,1%, 1 до 10% или даже 10 до 100%. Точной стехиометрии измерения необходимо интерпретировать биологическое значение ацилирования и предсказать воздействие относительно масштабов протеина структурного и, возможно, функциональные изменения.

Один из предыдущих методов для количественного определения сайта размещение использует тяжелые стабильного изотопа химического маркировки остатков неизмененном лизин, следуют масс-спектрометрии для измерения соотношения между эндогенного «легкие» ацетилирования по сравнению с внешними, химически-с надписью «тяжелых» ацетил лизин с использованием прекурсоров Ион интенсивности¹². Другое недавнее исследование, проведенное Чжоу и др. ¹³ описал аналогичный подход к оценке стехиометрии ацетилирования лизин, которая также занятых полный химический ацетилирования всех остатков неизмененном лизина в белках с стабильного изотопа маркировки, но используется фрагмент Ион интенсивности как измеряется ДВР. Nakayasu и др. ¹⁴ используется аналогичный подход ДВР, но вместо этого используется соотношение легких и тяжелых ацетил лизин immonium ионов для количественной оценки. Количественной оценки, основанные на фрагмент ионов, immonium или последовательность ионов (МС2), в большинстве случаев приводит к менее сигнал помех по сравнению с обработкой нетронутыми пептид прекурсоров ионов (MS1). Однако количественного определения ионов фрагмент из ДВР генерируемые МС/МС спектры может страдать от стохастической выборки недостатки, где ионы высокой изобилие прекурсоров чаще выбираться для МС/МС и таким образом, привести к неполной и предвзятой выборки прекурсоров ионов.

Этот роман рабочего процесса⁴ (рис. 1) использует концептуально стабильного изотопа химического маркировки подход, первоначально разработанный Baeza и др. ¹², однако рабочий процесс впоследствии наряду с DIA для сбора обоих прекурсоров и несколько обилия Ион фрагмент над обнаружению массы в диапазоне^15,16 обеспечение точной стехиометрии расчеты.

Пик областях от фрагментации ионов, содержащие ацилирования сайта интересов, или «дифференциации фрагмент ионов», используются для количественного определения Ацилирование сайта размещение (Рисунок 2). Фрагмент ионов, которые не содержат изменения имеют идентичные легких и тяжелых m/z значения и используются для идентификации пептид, но не для количественной оценки. Скайлайн программного обеспечения¹⁷ используется для извлечения прекурсоров и фрагмент пик районах. Наличие нескольких фрагментов ионов, содержащие ацилирования данного сайта обеспечивает гибкость при обнаружении помех в некоторых ионов фрагмента. Визуализация данных в Skyline позволяет проверки критических соотношений фрагмент легких до тяжелых ионов. Помимо анализа данных вручную был разработан пакет R открытым исходным кодом, написанные самостоятельно, StiochiolyzeR (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR), которая использует прекурсоров Ион и фрагмент Ион собранные данные через DIA и количественно стехиометрия участкам Ацилирование из пептидов, содержащих несколько остатков лизина, функция не представляется возможным с прекурсорами Ион только интенсивность измерения⁴.

Этот протокол также демонстрирует использование endoproteinase Glu-C, который является специфичным для расщепления C-терминала на остатков глутаминовой и аспарагиновой кислоты, вместо трипсина или Arg-C протеазы, как последний часто генерировать очень большие и потенциально умножить Ацилированного протеолитических пептиды, вытекающие из заблокированных трипсина расщепление на ацилированных остатков лизина. Химическая, маркировки процедура распространяется также на включают пользование янтарной ангидрид (рис. 1), что позволило количественная оценка succinylation стехиометрии succinylation. Помимо улучшения подготовки пробы, осуществление фракционирование пептида в автономном режиме, основные рН, вспять фазы (bRP) разделение пептидов далее сократилась количественную оценку вмешательств, позволяя лучше де свертки Ацилирование стехиометрии в целом протеома образцов. Вместе, этот метод имеет и выделяет ряд преимуществ: (1) повышение эффективности химической Ацилирование; (2) Измерение белка succinylation стехиометрии помимо ацетилирования; и (3) совершенствование количественной оценки точности. Улучшение количественной объясняется снижение помех в фрагмент Ион сигналы от Диа, по сравнению с ДВР прекурсоров сигнала, а также осуществление off-line пептид предварительно фракционирование bRP.

Протокол

1. количественно Acetylate или Succinylate белков с помощью меченных изотопом уксусной или янтарной ангидрид

1. Подготовка 3 реплицирует 100 мкг белка образца бычьим сывороточным альбумином (БСА) параллельно, в концентрации 1 мкг/мкл (в общей сложности 100 мкл), с помощью мочевины и triethylammonium раствор бикарбоната (СТОС) (8 M мочевины, 200 мм СТОС, рН 8).
   Примечание: Важно использовать Амин бесплатная буфер. Образцы протеина, используется здесь в разделе представитель результаты BSA, количественно succinylated BSA, и смесей, их приносит BSA образцы с определенными succinylation размещение на 0%, 1%, 10%, 50% и 100%, соответственно (каждый образец будет подготовлен в 3 репликация). Этот протокол также была проведена с помощью белка лизатов от кишечной палочки и мышь печени⁴. Протокол также может применяться для других клеток или тканей лизатов.
2. Уменьшите 100 мкл пример BSA (100 мкг) с 8 мкл Дитиотреитол (DTT), чтобы достичь конечной концентрации 20 мм DTT и инкубировать образца при 37 ° C за 30 мин с перемешиванием при 1400 об/мин и 250 мм.
3. Алкилата сокращенной пробы BSA с 21,6 мкл iodoacetamide 200 мм для достижения конечной концентрации 40 мм iodoacetamide и Проинкубируйте образцы в темноте при комнатной температуре за 30 мин.
   Примечание: Важно иметь концентрацию iodoacetamide слегка алкилированные более чем 2 x концентрации DTT, чтобы гарантировать, что все уменьшается тиолы белка.
4. Приступайте к подготовке уксусный ангидрид -d₆ (шаг 1.4.1) или янтарной ангидрид -d₄ (шаг 1.4.2) необходимые для химического ацетилирования (количественные) или succinylation образцов.
   1. Определите Молярность (М) 1 g Алиготе водный уксусный ангидрид -d₆ решения от молекулярной массы (108.13 г/моль) и плотности (1.143 г/мл при 25 ° C).
      Примечание: Пакет 1 g содержит 9,248 мкмоль уксусный ангидрид -d₆ объема 875 мкл, уступая 10.57 M решение, используемое для за ацетилирования образцов.
   2. Подготовьте 5 М раствора янтарной ангидрид -d₄ путем растворения порошка в безводный ДМСО непосредственно перед реакции во избежание гидролиз реагента. Растворите 0,24 g янтарной ангидрид -d₄ в 461 мкл безводный ДМСО для получения решения 5 М.
5. Выполнения количественных химических ацетилирования или succinylation путем добавления 60 мкмоль уксусный ангидрид -d₆ (6 мкл раствора 10.57 М) или янтарной ангидрид -d₄ (12 мкл раствора 5 М), соответственно и инкубировать Пример на 4 ° C в течение 20 мин на вихревой смеситель.
   Примечание: Из-за кислотность ангидриды, может осадок белков. Принять к сведению и настроить, как описано в шаге 1.6.
6. 10 мкл 7,25 M NaOH, после инкубации для увеличения рН ~ 8 для устранения любых O-ацилирования побочных продуктов. Вихревой кратко и проверьте образец pH, пятнистость 1 мкл на бумаге рН.
   Примечание: Это может быть необходимо для более чем 10 мкл 7,25 M NaOH для достижения рН 8. Кроме того следует повторно распустить потенциально осажденный белки.
7. Повторите за ацилирования и pH перестройки 1.5 и 1.6 в общей сложности три раза. Проверьте значения рН и обратите внимание, объем основных решения, добавил на повторение. Работа быстро во время выше химических Ацилирование шаги, потому что ангидридами гидролизуют и потерять реактивности.
8. После окончательного обозначая реакции и рН корректировки 10 мкл раствора гидроксиламина 50% вернуться O-ацилирования побочных реакций.

2. дайджест отреагировали образцы протеина используя Glu-C Endoproteinase

1. Разбавить мочевины концентрации до 0,8 М, с использованием 50 мм СТОС, рН 8 и нормализовать громкость образца.
2. Дайджест образцы протеина путем добавления endoproteinase Glu-C в 1:50 протеазы соотношение белка субстрата (w/w) и Проинкубируйте образцы на ночь при 37 ° C с перемешиванием при 1400 об/мин.
3. Подкислять и утолить образцы пищеварение протеина путем добавления Муравьиная кислота 1% по объему.
4. Опреснения примеров с использованием гидрофильно липофильного баланса твердофазный извлечения патронов. Используйте один картридж сорбента 30 мг за образец, максимум 5 мг материал за картридж^4,18.
   Примечание: Важно, чтобы сорбент внутри картриджа мокрый этого опреснительной процесса. При необходимости, выключите вакуумный насос замедляют прохождение растворителя или образец через картридж.
   1. Вставьте картриджи в порты на стекла 24-портовый блок вакуумный коллектор и включите вакуумный насос. Оставьте неиспользуемые порты ограничен. Оставьте один или два порта ООН ограничен поддерживать низкое давление на вакуумный манометр, при необходимости.
   2. Мокрый каждого картриджа два раза с 800 мкл 80% Ацетонитрил (ACN)/0.2% Муравьиная acid/19.8% воды. Убедитесь, что растворитель уровень остается 2-3 мм выше уровня сорбента. Убедитесь, что вакуумный манометр на многообразии читает 16,9 – 67.7 кПа (5 – 20 в Hg).
   3. Сбалансировать каждый картридж три раза с 800 мкл 0,2% муравьиной кислоты в воде. Убедитесь, что вакуумный манометр на многообразии читает 16,9 – 67.7 кПа (5 – 20 в Hg).
   4. Загрузите образцы пептид на картридж. Обеспечить вакуумметр на многообразии читает 6,77 – 8,47 кПа (2 – 2.5 в Hg), и скорость потока не превышает 1 мл/мин.
   5. Мыть каждый картридж три раза с 800 мкл 0,2% муравьиной кислоты в воде. Убедитесь, что вакуумный манометр на многообразии читает 16,9 – 67.7 кПа (5 – 20 в Hg).
   6. Выньте картридж из вакуумного коллектора и поселиться в 1,5 мл микропробирок.
   7. Элюировать пептиды один раз с 800 мкл воды муравьиной acid/19.8% 80% ACN/0.2% и позволяют растворителя для инкубации с сорбентом для 2-3 мин.
   8. Использование пипетки для нажима растворителя через сорбент слой внутри картриджа. Повторите для второго элюции 400 мкл 80% воды муравьиной acid/19.8% ACN/0.2% в том же 1,5 мл микропробирок.
5. Сухие элюата вакуумной центрифугированием (фиксированная центрифугирования в 268 x g), обычно в течение 3 ч.
   Примечание: При необходимости, сушеные элюата образцы можно хранить замороженные при температуре-20 ° C до готовности приступить к фракционирования.

3. фракционировать пептиды с использованием автономных Basic рН обратной фазы ВЭЖХ

1. Вновь приостановить за ацилированных и глу-C усваиваются образцы (готовится, как описано в разделах 1 и 2) в 200 мкл буфера A (10 мм аммония Формиат в воды, рН 10), смешайте образца для 10 мин на вихревой смеситель на 4 ° C и центрифуги на 17500 x g для 10 минут в комнате te mperature.
   Примечание: Полученный пептид образец готов быть автономный фракционированный высокий рН разделения^19,20.
2. Программа автономный метод фракционирования ВЭЖХ в зависимости от инструмента и используемого программного обеспечения. Следующий метод специфичен для двоичной системы насоса ВЭЖХ, включая двойной длины волны УФ детектор, Автоматический пробоотборник, коллектор фракций и столбец C18 (4,6 мм x 250 мм, 5 мкм размер частиц), который допускает рН 10.
3. Собирать 40 фракций для 2.1 мин на фракции и объединить каждый четвертый фракции, что приводит к четыре окончательного объединения фракции⁴. Большее число фракций пула может использоваться для дальнейшего уменьшения сложности выборки за счет время сбора данных масс-спектрометрии.
4. Сухой пуле фракций в лиофилизатор, вновь приостановить сушеные пептид образцов в 1 мл 50% АКС и 1% муравьиной кислоты в воде и передавать меньше контейнера образца. Сухие переданного образца через вакуум центрифугирования (фиксированная центрифугирования в 268 x g), обычно в течение 1 ч.
   Примечание: Низкое давление пара Формиат аммония может затруднить полного высыхания. Если значительное количество соли аммония Формиат остаются как соль осадок после высыхания, повторите извлечения твердой фазы.
5. Вновь приостановите образцы в 20 мкл 0,2% муравьиной кислоты в воде с индексированных удержания время (iRT) пептида стандартной смесью.
   Примечание: Образцы теперь готовы для анализа по масс-спектрометрии.

4. DIA анализ образцов фракционированный пептида

1. Анализ образцов, с помощью метода DIA LC-MS/MS, которое может быть скорректировано с учетом масс-спектрометрических доступных инструментов. Был проведен анализ с использованием нано LC 2D ВЭЖХ системы онлайн подключен к ортогональных квадрупольного время полета (QqTOF) масс-спектрометр.
   1. Программа инструмент программного обеспечения, таким образом, что пептид смеси передаются в микросхему с18 до столбца (200 µm x 6 мм C18-CL чип, 3 мкм, 300 Å) и мыть по 2 мкл/мин 10 мин с загрузкой растворителем (H₂O/0.1% муравьиной кислоты) для обессоливания.
   2. Отдельные пептиды хроматографически на чипе см C18-CL 75 мкм x 15 (3 мкм, 300 Å) со скоростью потока 300 нл/мин с 2 h градиента с использованием типичных (и LC-системы конкретных) водный и АКС растворителя буферы⁴.
   3. Создает метод DIA окна переменных, где окна область диапазона массы переменной ширины ( m/z5 до 90) передаются от Q1 квадрупольного клетку столкновения поэтапно полная масса диапазоне (m/z 400-1250).
      Примечание: Время цикла 3.2 s включает 250 мс прекурсоров Ион сканирования следуют 45 МС времени накопления для каждого из сегментов 64 ВАЛОК,^21,,²².
2. Идентифицировать пептиды с использованием параллельного анализа образцов, ДВР MS и здание спектральных библиотек, или в качестве альтернативы, пептиды могут быть определены непосредственно от Диа данных с использованием PIQED программное обеспечение²³, который обрабатывает все технические шаги обработки данных, Идентификация и импорта в Skyline для последующей количественной оценки.

5. пример данных анализа учебник

1. Скачать программное обеспечение Skyline (http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline) и создайте учетную запись PanoramaWeb (https://panoramaweb.org).
   Примечание: Подробные учебники, описывающие использование Skyline с данными, см (https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorials). Другие программные алгоритмы могут использоваться вместо извлечения легких и тяжелых фрагмент Ион пик областях из DIA приобретений, как открытые SWATH²⁴, ВАЛОК 2.0 плагин в PeakView²⁵и²⁶Spectronaut.
   1. Скачать файл данных Skyline для представителя результаты succinylated BSA (рис. 3) от общественности Панорама: https://panoramaweb.org/labkey/JoVEsuccBSA.url. На веб-странице Панорама перейдите к таблице «Целевых MS бежит» и скачать файл sky.zip, выбрав ссылку на скачивание на правой стороне. Распакуйте скачанный ZIP-файл папку и дважды щелкните на файл skyline.sky, чтобы открыть его в Skyline. Проверка целевого дерева фрагмента Ион пептида (левая панель) и четыре хроматограммы с определенной доли легких succinylation (правой панели).
   2. Выберите меню «Вид», перейдите к «пик областях | Реплицировать сравнения». Панель «Пик областях – реплицировать сравнение», содержащие бар графики появится в правой части окна. В пик областях панели, щелкните правой кнопкой мыши и выберите пункт «переходы | Сингл», который показывает площади пика Ион фрагмент для выбранного фрагмента Ион. Наконец, щелкните правой кнопкой мыши панель «Пик районах» и выберите «заказ | Документ».
   3. Целевого дерева на панели в левой части окна щелкните правой кнопкой мыши на пептид «E.LCKVASLRE. T | Коэффициенты для | Oneheavy», который вычисляет отношение сигнала легких ионов тяжелых ионов сигнал, свет/тяжелая.
      Примечание: Это не то же самое, как сайт размещение стехиометрии отношение Light/(Heavy+Light).
   4. Обратите внимание, что дерево целевой теперь сообщает соотношения Л/Ч в правой части света фрагмент ионов.
2. Определите «дифференциация фрагмент ионов», содержащие ацилирования сайта интересов.
   Примечание: Как показано на рисунке 3, показывая этот точный пример, дифференцируя ионы были определены как y₇ (самая высокая оценка), y-₈,₃b и b₄. Обратите внимание, что ионы-дифференцируя фрагмент в соотношении 1 в конечном дереве.
   1. В левой панели целевого дерева, под 588.30 ++ вложенный узел пептида E.LCKVASLRE. T, нажмите на y7 дифференциации фрагмент Ион
      K [₇ y]-902.49 + (rank1) [5]
      Обратите внимание на увеличение высоты пика и области.
   2. В левой панели целевого дерева, под 588.30 ++ вложенный узел пептида E.LCKVASLRE. T, нажмите на y₅ -дифференцируя фрагмент Ион [y₅ ] – 575.31 + (ранг 6) [1]. Убедитесь, что y₅ фрагмент хроматограммы Ион и пик областях остаются в том же диапазоне для всех образцов.
   3. В целевой панели дерева, просмотрите другие дифференциации (соотношение помимо 1) и дифференциации (соотношение 1) фрагмент ионов и обратите внимание на изменения и моделей в области пик бар графике и хроматограммы.
   4. Определить точное пик областях для легких и тяжелых пар ионов дифференциации для того чтобы вычислить стехиометрии (для дополнительных сведений см также Meyer et al. ⁴). Нажмите на «просмотр | Появится сетка документа» и сетка документа. В верхнем левом углу сетки документа, нажмите на «просмотров | Переходных результатов» для просмотра многостолбцового таблицы с фрагмент Ион информацию, такую как пептид последовательности, mz прекурсоров, реплицировать имя и т.д.
   5. Измените формат отчета для «опоры», снова нажав на «Мнения» в сетке документа и выбрав команду «Изменить вид», чтобы открыть окно Настройка представления. В нижнем левом углу окна «Настроить вид» «Pivot реплицировать имя» и выберите «ОК», чтобы закрыть окно Настройка представления. Наблюдать, что теперь окно таблицы «Документ сетки: переход результаты» организовал повторно сгруппировать реплицировать имя, время удержания, уголок, фон, пик ранг столбцы по репликации (1%, 10%, 50%, 100% succinylation).
   6. Для пептида «E.LCKVASLRE. T» в таблице «Документ сетки: переход результат», найдите столбец «Прекурсор Mz», «Фрагмент Ион» столбец и столбец (1% succinylation) района 1pct_light_sw1. Отметить, что существуют два прекурсоров ионов для этот пептид, легкие (прекурсор Mz 588.30 в первых восьми строках) и тяжелых (прекурсор Mz 590.32 в последних 8 строк).
   7. В столбце «Фрагмент Ион» найдите две строки для y8 фрагмент Ион соответствует ионов тяжелых прекурсоров и свет. От же строк в столбце область 1pct_light_sw1 запишите y8 областей для света (15,820) и тяжелый (1,426,461).
3. С помощью этих значений области пик, вычислить succinylation стехиометрии, или доля изменения, в соответствии с приводимой ниже формулой и получить стехиометрии коэффициент 0,01, или 1% succinylation, который соответствует долю света succinylation в этом определено смесь:
   
4. Вычислите коэффициент стехиометрии для succinylation 10%, с использованием y8 дифференциации фрагмент Ион пик области значений в столбце область 10pct_light_sw1, 144,953 (свет) и 1,188,041 (тяжелые), чтобы получить коэффициент 0,10 или 10% succinylation.
5. Вычислите коэффициент стехиометрии для 100% succinylation с использованием y8 дифференциации фрагмент Ион пик области значений в столбце область 100pct_light_sw1, 954,513 (свет) и 16,407 (тяжелые), чтобы получить коэффициент 0,98, или 98% succinylation.
6. Аналогично Рассчитайте стехиометрии соотношение 1% succinylation с использованием b3 дифференциации фрагмент Ион пик области значений в столбце область 1pct_light_sw1, 55,697 (свет) и 3,149,119 (тяжелые), чтобы получить коэффициент 0,01, или 1% succinylation.
7. Продолжать стехиометрии соотношение расчеты с использованием формулы для дифференциации ионов фрагмент, y и b ионов, чтобы получить лизин succinylation стехиометрии значения для 1, 10, 50 и 100% succinylation смеси.

Результаты

После сбора данных дифференцируя MS2 фрагмент ионов были определены из протеолитических ацилированных пептиды, впоследствии извлечения ионов хроматограммы (XIC) были обработаны в горизонт и соответствующие свет и тяжелых пик областях были экспортированы, которые были Наконец, используется для вычисления размещение сайта. Рисунок 2A показывает концептуальные иллюстрации как прекурсор Ион XIC может появиться с участием обоих легких и тяжелых пептид сигналов, и Рисунок 2B представляет собой пример соответствующего фрагмента Ион XICs с цветом (красный = света; синий = тяжелая ) для дифференциации фрагмент ионов, содержащие ацилирования модификации лизина.

Рисунок 3 показывает данные, получаемые из эксперимента размещение, такие, как описано выше анализа предварительно определенных соотношениях света/тяжелая succinylated BSA, созданного собственными силами в 1, 10, 50, или 100% и определение succinylation размещение их. Импорт DIA размещение данных в Skyline позволяет легко визуализации целевого дерева, отображение последовательностей пептид и фрагмент ионов для легких и тяжелых ионов (Рисунок 3А). Данные от Диа-MS каждого определенного succinylated BSA соотношения показали immanently относительные различия в соотношении y легкие и тяжелые₇ иона, высоким рейтингом Ион дифференциации фрагмент из выявленных пептид спектры матча (указывается в красный, Рисунок 3B). Рисунок 4 показывает обзор обработанные результаты, подтвердили succinylation проценты размещение ввода белка, расчета размещение MS2 здесь состоящий из BSA pre-succinylated. В таблице 2показаны измеренные лизин succinylation вместимость 20 протеолитической succinylated пептиды, полученные из коммерческих pre-succinylated BSA, succinylated на определенные проценты (например, 0, 1, 10, 50 и 100%). Для каждого из 20 протеолитических BSA пептиды высокий рейтинг, дифференцируя MS2 фрагмент ионов использовалась для расчета лизин succinylation (Ksucc) размещение, как L/(L+H) в %. В целом количественная оценка на базе MS2 показал очень хорошая точность в определении Ацилирование размещение даже на низких stoichiometries.

Рисунок 1: процесс стехиометрии. (A) белки инкубируют в три раза с уксусный ангидрид -d₆ acetylate неизмененным лизин остатков. Далее, ацетилированный белки усваиваются с endoproteinase Glu-C, следуют ВЭЖХ фракционирование протеолитических пептидов, используя basic рН обратная фаза хроматографии. Наконец, пептиды анализируются LC-MS помощью DIA с шириной окна переменных прекурсоров. (B) тот же рабочий процесс используется для определения, что стехиометрии succinylation, как описано в (A), за исключением тяжелого Ацилирование реагент изменяется янтарной ангидрид -d₄. Рисунок, адаптированный Мейер и др. ⁴ (масса Soc. Am. J. Spectrom., Открытый выбор). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: пример полученных данных и вычисления стехиометрии. (A) свет (L) и тяжелых ионов прекурсоров MS1 (H), содержащий один ацетилированный лизин отличаются 3 единицах массы. XICs создаются для легких и тяжелых изотопов конверты, указано в красный и синий, соответственно. (B) Квантификация от MS2, Ион XICs фрагмент от Диа приобретений может производиться с использованием «различия» фрагмент легких и тяжелых ионов, которые содержат сайт ацетилирования указывается в красный и синий. Общие фрагмента ионы отображаются пунктирный черным и не содержат сайт модификации. Рисунок, адаптированный Мейер и др. ⁴ (масса Soc. Am. J. Spectrom., Открытый выбор). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: Skyline визуализация succinylated протеолитической BSA пептида на уровнях различных размещение. (A) Skyline целевого дерева показаны протеолитических пептидные LCKsuccVASLRE и в ее результате фрагментации ионов. (B) Skyline извлечены фрагмент хроматограммы иона на разных уровнях succinylation размещение. Наивысший рейтинг дифференциации Ион, y₇, увеличение площади пика, 1, 10, 50 и 100%, сопоставляя входные процент pre-succinylated BSA (созданного собственными силами). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: Оценка BSA Ацилирование стехиометрии BSA pre-succinylated. Пять различных образцов BSA в определенные проценты тяжелой модификации (например., 0, 1, 10, 50 и 100%) были подвергнуты MS2 размещение определения. Размещение сайта на 20 succinylated BSA пептиды были определены с высоким рейтингом дифференциации фрагмент ионов для пяти различных образцов BSA в определенные проценты легкой модификации (например, 0, 1, 10, 50 и 100%). Box нитевидные сюжет отображает распределение 20 succinyl пептидов, в поле «» (процентиль 25% до 75% процентиль) находятся значения от 50% пептидов, верхний ограничитель выбросов указывает значения процентили 75% максимум (100%) и нижний ограничитель выбросов указывает значения процентили 25% минимум (0% процентиль). (Масса Soc. Am. J. Spectrom., Открытый выбор). Количественное определение измерений можно найти в таблице 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Время (минуты)	% A	% B
0.00	100	0
7.27	92	8
45.27	73	27
49,27	69	31
65,27	61	39
72.27	40	60
80.00	10	90
85.00	10	90
86.00	100	0
120.00	100	0
Скорость потока: 0,7 мл/мин
Буфера A: 10 мм аммония Формиат в воды, рН 10
Буфера B: 10 мм аммония Формиат в воды АКС и 10% 90%, рН 10
Примечание: pH обоих мобильных этапов скорректирована до 10 с аккуратным аммиака

Таблица 1: градиент для автономных basic рН обратная фаза ВЭЖХ фракционирования. Градиент Длина: 120 мин буфера A: 10 мм аммония Формиат в воды, рН 10. Буфера B: 10 мм формате аммония в 90% АКС и 10% воды, рН 10.

L / L + H в %	L / L + H в %	L / L + H в %	L / L + H в %	L / L + H в %
Ksucc 0%	Ksucc 1%	Ksucc 10%	Ksucc 50%	Ksucc 100%
0.2	1.7	11.1	50,9	99,2
1.2	2.3	12.3	49.4	97,6
2.9	3.8	14	48,6	99,5
0.5	1.8	11.7	50.8	99,5
0.2	1.7	11.1	48,3	98.2
0.2	1.2	11	47,5	96.1
0,3	1.6	12,8	51	99,2
3.7	5.2	14.7	51,9	89,5
1.5	1.8	12.5	47.2	91,1
0,8	1.5	11.3	48,4	96,8
0.2	1.6	13,9	49.7	98.9
0.1	1.1	10.7	48.2	98,6
0.2	0.9	10.3	49.4	99,4
0.5	2.5	17.2	52,3	97,5
0.1	3.5	20,8	51	99
0,3	1.9	10.7	49,6	98.2
2	1.7	10.9	47,7	96,3
0,3	1.2	10	53	98
1.1	1.8	12,9	57,9	94.1
0.2	1.4	11.6	48,6	98,8

Таблица 2: количественная оценка измеренных BSA лизин succinylation вмещает 20 протеолитической succinylated пептидов. Succinylated пептиды, полученные из коммерческих pre-succinylated BSA, succinylated на определенные проценты (например, 0, 1, 10, 50 и 100%). Для каждого из 20 протеолитических BSA пептиды высокий рейтинг, дифференцируя MS2 фрагмент ионов использовалась для расчета лизин succinylation (Ksucc) размещение, как L/(L+H) в %.

Обсуждение

Этот протокол обеспечивает Роман и точный метод для количественной оценки конкретных лизин ацетилирования и размещение succinylation, который может быть применен для всего протеома. Этот метод полагается на измерение внутреннего света пептидов и экзогенные тяжелых пептиды, последний из которых являются созданные в пробирке с использованием количественного химического Ацилирование белков с транс уксусный ангидрид -d₆ или янтарной ангидрид -d₄ (рис. 1). Подобные методы стабильных изотопов маркировки родной неизмененном лизин остатков и исполнена количественной размещение сайта на основе либо прекурсоров Ион только¹² или фрагмент ионов из ДВР приобретений^13,14. Этот протокол применяется несколько шагов во время подготовки проб для повышения эффективности ацилирования и расширяет химических маркировки для succinylation. Сбора данных с использованием DIA приобретений получает Ион прекурсоров и MS2 фрагмент Ион интенсивности по всему диапазону обнаружению массовых, тем самым уменьшая фрагмент ионных взаимодействий. Анализ и количественная оценка через Skyline и пользовательские скрипты, собственной разработки позволяют рассчитать размещение сайта для пептидов, содержащие более одного остатков лизина и более чем одной Ацилирование на одном сайте.

Существует несколько важных шагов на этапе подготовки образца этот протокол, который должен быть внимательно следил. Поскольку весь протокол опирается на эффективный химической модификации всех остатков лизина, этот шаг имеет первостепенное значение. Ангидриды реагируют с бесплатные амины, поэтому следует избегать Амин содержащие буфер или загрязняющими молекул в lysate белка. Также во время шага химического ацилирование, убедитесь, что рН реакционной смеси является обратно к рН 8 после каждого из трех инкубаций с реактивом ангидрида как эта реакция подкисляет смесь, и O-ацилирования побочные реакции могут образовывать. Кроме того разбавление 8 M мочевины содержащих реакция смеси около 0,8 М мочевины до пищеварение и проверка, что pH в пределах оптимального диапазона имеет важное значение для оптимальной деятельности endoproteinase Glu-C. Еще одним ключевым компонентом нашей протокола является шагом сбора данных и введение DIA рабочего процесса, который преодолевает любые несоответствия данных выборки ДВР и который позволяет для количественной оценки на уровне Ион фрагмент MS2. Одно главное преимущество DIA методологии является снижение помех, которые, как правило, гораздо более проблематичным и ошибкам при количественной оценке MS1 прекурсоров Ион сигнал (как предлагали некоторые из предыдущих изданий).

Несколько изменения рабочего процесса могут быть сделаны при подготовке весьма сложные образцы. Количество фракций в пул после того, как автономный фракционирование ВЭЖХ обратная фаза basic рН может быть уменьшена снизить сложность объединения образцов, которые будут приобретаться по LC/жа Кроме того, больше хроматографического градиенты могут также быть использованы во время приобретение для лучшего разделения пептид. В качестве альтернативы может использоваться несколько протеаз переваривать образцов производят большее разнообразие рассеченного пептидов и увеличить охват белков остатков лизина. Суд работает и оптимизации может проводиться с использованием коммерческих BSA, содержащие конкретные процентные ацетилирования или succinylation.

Одно ограничение к настоящему протоколу является потенциально небольшой сайт размещение переоценки из-за пропавших без вести другие модификации лизина, например метилирования или ubiquitination и т. д.на том же сайте⁴. Рассчитано из области пик легких и тяжелых ацил модификаций, L/(L+H), размещение сайта основывается на предположении, что общий уровень изменения на сайте лизин состоит из только эндогенного «свет» Ацилирование (L) и химически помечены «тяжелый» Ацилирование (H). Однако фактическое общее Ацилирование размещение на сайте в естественных условиях может включать в себя другие модификации после ацетилирования и/или succinylation. Кроме того, сообщил изотопный чистоту приобретенных реагентов уксусный ангидрид -d₆ (99%) и янтарной ангидрид -d₄ (> 98%) может способствовать небольшое преувеличение до 2% (succinyl) или 1% (ацетил) эндогенные Ацилирование уровня⁴. Вместе, эти небольшие переоценки добавить трудность количественного определения сайтов с менее чем 1% размещение. Большое изобилие различия между полным химически ацилированных пептидов и родной ацилированных пептиды также способствуют потенциальные ошибки квантификации размещение сайта, особенно для низкого эндогенного ацилированных пептиды²⁷. Недавнее исследование, проведенное Weinert и др. ²⁷ обнаружили, что снижение обилия различия между полным за ацетилированные пептидов может уменьшить ошибки количественная оценка²⁷.

Стехиометрия количественной, собранной с помощью этого протокола может определить важные Ацилирование горячих точек в частности белка и формы гипотезы для биологических последующих экспериментов, таких как сайт Направленный мутагенез определенных мест, представляющих интерес. Этот протокол также может выявить комбинированные эффекты низкой Ацилирование стехиометрии сайтов, которые могли бы оказать косвенные или тонкие влияния на структурную стабильность белков и локализованные клеточной среды. Кроме того осуществление этого протокола для измерения ацетилирования и succinylation и другие возможные лизин Ацилирование модификации после ацетилирования будет уникально предлагают взглянуть на динамических Ацилирование воздействия на белки при различных биологических условий.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
водный уксусный ангидрид-d6	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, США	175641-1G	1% изотопной чистоты
янтарный ангидрид-d4	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, США	293741	2% изотопной чистоты
секвенирования эндопротеиназа класса Glu-C	Roche, Индианаполис, Индианаполис, США (через Sigma	)10791156001	соотношение протеазы и субстрата белка 1:50 (масса:масса)
Oasis HLB Твердофазная экстракция (SPE) картриджи	Waters Corp., Милфорд, Массачусетс, США	WAT 094225
ВЭЖХ ацетонитрил	Бердик и Джексон, Маскегон, Мичиган, США	BJAH015-4
ВЭЖХ вода класса	Burdick and Jackson, Muskegon, MI, США	BJAH365-4
йодоацетамид	Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	I1149-25G
дитиотреитол (DTT)	Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	D9779-5G
FLUKA муравьиная кислота (FA) для масс-спека	Thomas Scientific, Сведенсборо, Нью-Джерси, США C988C27		~98%
мочевины	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, США	PI29700
бычьего сывороточного альбумина (BSA)	Pierce, Рокфорд, Иллинойс, США	88341
бикарбонат триэтиламмония (TEAB)	Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	T7408-100ML
безводный диметилсульфоксид (ДМСО)	Alfa Aesar, Тьюксбери, Массачусетс, США	43998
гидроксид натрия (NaOH)	EMDМиллипор, Берлингтон, Массачусетс, США	SX0590
50% раствор гидроксиламина в воде	Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	438227-50 мл
вода класса LC-MS	Burdick and Jackson, Muskegon, MI, США	BJLC365-4
LC-MS ацетонитрил	Burdick and Jackson, Muskegon, MI, США	BJLC015-4
Eppendorf Themomixer Compact	Eppendorf AG, Гамбург, Германия	T1317-1EA
Thermo Scientific Savant SPD131DDA концентратор SpeedVac	Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США	SPD131DDA-115
Waters 1525 Бинарная насосная система ВЭЖХ Waters	Corp., Милфорд, Массачусетс, США WAT022939
Waters 2487 Двухволновой УФ-детектор	Waters Corp., Милфорд, Массачусетс, США WAT081110
Waters 717plus Autosampler	Waters Corp., Милфорд, Массачусетс, США	WAT022939
Waters Fraction Collector III	Waters Corp., Милфорд, Массачусетс, США	186001878
Agilent Zorbax 300Extend C18 колонка	Agilent Technologies, Inc., Санта-Клара, Калифорния, США	770995-902
Система сублимационной сушки Labconco Freezone 4.5 Лиофилизатор	Labconco, Канзас-Сити, Миссури, США	7751000
Стандарт пептида нормализации времени удержания (iRT)	Biognosys AG, Шлирен, Цюрих, Швейцария	Ki-3002-2
Ultra Plus nano-LC 2D система ВЭЖХ	Sciex LLC, Eksigent Division, Фрамингем, Массачусетс, США	модель # 845
ортогональный квадрупольный времяпролетный (QqTOF) Масс-спектрометр TripleTOF 5600	Sciex LLC, Фрамингем, Массачусетс, США	по котировке
ортогональный квадрупольный времяпролетный (QqTOF) Масс-спектрометр TripleTOF 6600	Sciex LLC, Фрамингем, Массачусетс, США	по котировке
Стружка предварительной колонки C18 (200 μ m & times; 6 мм чип ChromXP C18-CL, 3 мм; м, 300 & Аринг;)	Sciex LLC, Фрамингем, Массачусетс, США	804-00006
Плагин SWATH 2.0 в PeakView 2.2	Sciex LLC, Фрамингем, Массачусетс, США	скачать программное обеспечение Sciex
Spectronaut	Biognosys AG, Шлирен, Цюрих, Швейцария	чип Sw-3001
C18-CL (75 & микро; m x 15 см ChromXP, 3 & микро; м, 300 & Аринг;)	Sciex LLC, Фрамингем, Массачусетс, США	804-00001