Анализ митохондриальной кальция приток в изолированных митохондриях и культивируемых клеток

Joshua T. Maxwell; Chin-Hsien Tsai; Tahmina A. Mohiuddin; Jennifer Q. Kwong

doi:10.3791/57225

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Анализ митохондриальной кальция приток в изолированных митохондриях и культивируемых клеток

14K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57225

⸱

27 апреля 2018 г.

Joshua T. Maxwell¹ , Chin-Hsien Tsai¹ , Tahmina A. Mohiuddin² , Jennifer Q. Kwong¹

¹Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, ²Emory College of Arts and Sciences, Emory University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем два протокола для измерения митохондриальной Ca^{2 +} приток в изолированных митохондриях и культивируемых клеток. Для изолированных митохондриях, мы подробно плиты на основе чтения Ca^{2 +} импорта с помощью Ca^{2 +} чувствительной пробирного красителя кальция Грин 5N. Для культивируемых клеток мы описываем confocal микроскопии метод, с помощью Ca^{2 +} краситель кондицио-2/AM.

Аннотация

CA^{2 +} обработка митохондрий функция критической регулирования физиологических и патофизиологических процессов в широком спектре клеток. Способность точно измерить приток и измеряем Ca^{2 +} от митохондрий имеет важное значение для определения роли митохондриальной Ca^{2 +} обработка в этих процессах. В настоящем докладе мы представляем два метода для измерения митохондриальной Ca^{2 +} обработка в изолированных митохондриях и культивируемых клеток. Мы сначала подробно пластины читателя-платформа для измерения митохондриальной Ca^{2 +} поглощения с использованием Ca^{2 +} чувствительной краситель кальция Грин 5N. На основе чтения формат пластины обходит потребность в специализированном оборудовании, и краска кальция Грин 5N идеально подходит для измерения Ca^{2 +} от изолированных ткани митохондрий. Для нашего приложения мы описываем измерения митохондриальной Ca^{2 +} поглощения в митохондриях, изолированных от мыши ткани сердца; Однако эта процедура может применяться для измерения митохондриальной Ca^{2 +} поглощения в митохондриях, изолированный от других тканей, таких как печень, скелетные мышцы и мозг. Во-вторых мы описываем конфокальной микроскопии основанные assay для измерения митохондриальной Ca^{2 +} в permeabilized клеток с помощью Ca^{2 +} чувствительной краситель кондицио-2/AM и обработки изображений с использованием 2-мерной лазерной сканирующей микроскопии. Этот протокол permeabilization устраняет загрязнения цитозольной краситель, позволяя для конкретной записи изменений в митохондриальной Ca^{2 +}. Кроме того лазерной сканирующей микроскопии позволяет высокие частоты кадров для захвата быстрого изменения митохондриального Ca^{2 +} в ответ на различные препараты или реагентов, применяемых в решении внешней. Этот протокол может применяться для измерения митохондриальной Ca^{2 +} поглощения во многих типах клеток, включая клетки первичной например культивировании и нейронов и увековечен клеточных линий.

Введение

Митохондрии являются важнейшие объекты внутриклеточных Ca^{2 +} хранения и сигнализации. Десятилетия исследований показали, что митохондрии имеют возможность импорта и секвестр Ca^{2 +} ¹^,². Митохондрии, однако, являются не просто пассивные узлы Ca^{2 +} хранения. CA^{2 +} в отсеке митохондриальной выполняет основные сигнальные функции, включая регулирование метаболических вывода и активации пути смерти клетки митохондриального опосредованной, который был рассмотрен ранее³. Для регуляции метаболизма Ca^{2 +} усиливает деятельность трех матрица ло....