Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Изготовление язык внеклеточного матрикса и воссоздание язык плоскоклеточный рак в пробирке

5.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57235

⸱

20 июня 2018 г.

 ,  , 
1Key Laboratory of Gene Engineering of the Ministry of Education, State Key Laboratory of Biocontrol, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University

В этой статье

Краткое содержание

Метод здесь показан для подготовки язык внеклеточного матрикса (ТЕА) с эффективным decellularization. ТЕА может использоваться как функциональные подмости для реконструкции модели плоскоклеточный рак (ККТС) язык в условиях статического или перемешивают культуры.

Аннотация

Для того, чтобы построить эффективную и реалистичную модель для язык плоскоклеточный рак (ККТС) в пробирке, методы были созданы для производства decellularized язык внеклеточного матрикса (ТЕА) которая обеспечивает функциональные леса для строительства ККТС. ТЕА обеспечивает в vitro нишу для роста клеток, дифференциация и миграции клеток. Микроструктур родной внеклеточного матрикса (ECM) и биохимические композиций, сохранить в матрице decellularized обеспечивают ткани конкретных ниш для закрепления клетки. Изготовление ТЕА может быть реализована путем пищеварение дезоксирибонуклеаза (DNase), сопровождается серьезным органических или неорганических предварительной обработки. Этот протокол проста в эксплуатации и обеспечивает высокую эффективность для decellularization. ТЕА показал благоприятные cytocompatibility для ККТС клеток в условиях статического или перемешивают культуры, который позволяет построение модели ККТС. Самодельные биореактор использовался также для стойких перемешивают условия для клеточной культуры. Реконструированный ККТС, используя ТЕА показал характеристики и свойства, напоминающие клинических ККТС гистопатология, предлагая потенциал в области исследований ККТС.

Введение

Язык имеет различные важные функции, такие как глотания, артикуляции и дегустации. Таким образом нарушение функции язык имеет большое влияние на качество жизни пациентов1. Наиболее распространенным злокачественности в ротовой полости является язык плоскоклеточный рак (ККТС), который обычно возникает у людей, которые пьют алкоголь или дыма табака2.

В последние годы был достигнут незначительный прогресс в фундаментальных исследованиях по ККТС. Отсутствие эффективных в vitro исследования моделей остается одним из самых больших проблем. Таким образом внеклеточная матрица (ECM) оказывается возможного решения. Так как ECM является сложной сети кадр состоит из компонентов высокоорганизованных матрицы, эшафот материалы, имеющие ECM-как структура и состав бы компетентным для исследований рака. Decellularized ECM может прекрасно обеспечить нишу для ячеек из той же происхождения в пробирке, который оказывается наиболее существенным преимуществом ECM.

ECM может быть сохранена с клеточных компонентов, удаляется из тканей через decellularization, с использованием моющих и ферментов. Различные компоненты ECM, включая коллаген, фибронектин и Ламинин decellularized матрицы обеспечивают микроокружения родной ткань как для культивируемых клеток, содействия выживанию, пролиферации и дифференцировки клеток3. Кроме того иммуногенность для трансплантации снижается до минимального уровня с отсутствием клетчатых компонентов в ECM.

До настоящего времени были опробованы методы изготовления для decellularized ECM в различных тканях и органах, таких как сердце4,5,6,7, печени8,9,10 ,11, легких12,13,14,,1516,17и18,почек19 , 20. Однако, не соответствующие исследования показали на аналогичную работу на языке, в меру наших знаний.

В этом исследовании decellularized язык внеклеточного матрикса (ТЕА) был сфабрикованы ряда физических, химических и ферментативные лечение эффективно и недорого. Затем ТЕА был использован для пилки ККТС в пробирке, показаны соответствующие моделирования ККТС поведения и развития. ТЕА имеет хорошие биосовместимость, а также способность направлять клетки ткани конкретных нишу, которая указывает, что ТЕА может иметь большой потенциал в ККТС исследований3. Протокол, показанный здесь обеспечивает выбор для исследователей, изучение патогенеза или клинической терапии ККТС.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все животные работа была выполнена в соответствии с законом животных, институциональных руководящих принципов и утверждена институциональный уход животных и использование Комитетом, Sun Yat-sen University.

1. Подготовка ТЕА

  1. Выполнение мышей с шейки матки дислокации и удалить языки, используя стерильные хирургические ножницы и щипчики.
  2. Погружать язычки в 75% этанола на 3 мин, то положить каждый язык в 1,5 мл Эппендорф (EP) трубка с 1 мл стерильного фосфата 10 мм буфер решение (PBS).
    Примечание: Концентрация PBS в следующие действия такой же, как концентрация в этом шаге.
  3. Сотовый лизис путем замораживания-оттаивания: заморозить язычки в EP трубок-80 ° C для 1 h и затем разморозить языки при комнатной температуре 45 мин для 3 циклов.
  4. Загрузить каждый язык на кусок шовного хирургического иглой и оберните конец шва с небольшой кусочек стерильного фольги. Выполните операцию в 3,5 см или 6 см культуры блюдо, содержащие 75% этанола в стерильных условиях.
    Примечание: Соответствующие каждый кусок шовного составляет около 20 см, и соответствующий размер каждый кусок фольги составляет примерно 0,3 см2 (1 × 0,3 см). Язык должен быть загружен возле фольги.
  5. Промойте каждый язык с 3 мл стерильного PBS в 3,5 см или 6 см культуры блюдо за 30 с. выполнение этой операции в стерильных условиях.
  6. Вымойте язычки с ультрачистая вода: добавить ампициллина в широкий рот бутылку с 250 мл стерильного ультрачистая вода в конечной концентрации 90 мкг/мл. Положите язычки в бутылки, содержащие бар stir. Закрутите крышку бутылки с частью шва, остающиеся за пределами бутылки. Выполните эту операцию в стерильных условиях.
    Примечание: До 5 языки могут быть введены в такой же бутылке при рассмотрении Твининг шва. В конце шва в бутылке для предотвращения соскальзывания язык фольги. Язычки должны располагаться 2 см в высоту от нижней части бутылки, регулируя длину шва, оставаясь внутри бутылки. Эта заметка является также шаги 1.8, 1.10, 1.12 и 1.16.
  7. Положите бутылку на магнитной мешалкой для 12 h.
  8. Вымойте язычки с NaCl: добавить ампициллина в широкий рот бутылку с 250 мл стерильного 1 M NaCl в конечной концентрации 90 мкг/мл. Переместите языки и перемешать бар в бутылку. Закрутите крышку бутылки с частью шва, остающиеся за пределами бутылки. Выполните эту операцию в стерильных условиях.
  9. Положите бутылку на магнитной мешалкой для 24 h.
  10. Сотовый лизиса на Тритон X-100: добавить ампициллина в конечной концентрации 90 мкг/мл в широкий рот бутылку с 250 мл стерильного 2% Тритон X-100 в PBS. Переместите языки и перемешать бар в бутылку. Закрутите крышку бутылки с частью шва, остающиеся за пределами бутылки. Выполните эту операцию в стерильных условиях.
  11. Положите бутылку на магнитной мешалкой в течение 48 часов.
  12. Вымойте язычки с CaCl2/MgCl2: добавить ампициллина в широкий рот бутылку с 250 мл стерильного 5 мм CaCl2/MgCl2 в конечной концентрации 90 мкг/мл. Переместите языки и перемешать бар в бутылку. Закрутите крышку бутылки с частью шва, остающиеся за пределами бутылки. Выполните эту операцию в стерильных условиях.
  13. Положите бутылку на магнитной мешалкой для 24 h.
  14. Пищеварение, DNase: добавить 1 мл Хэнка сбалансированного солевого раствора (HBSS) для каждого EP трубки. Добавить DNase в HBSS соответственно в конечной концентрации 300 µM. Переместите каждый язык в каждую пробирку EP, с частью шва за пределами трубки. Выполните эту операцию в стерильных условиях.
    Примечание: Убедитесь, что часть шва, которая остается внутри бутылки в предыдущих шагах также остается внутри трубки EP в этот шаг и убедитесь, что часть шва, которая остается за пределами бутылки в предыдущих шагах также остается вне EP трубку в этом шаге.
  15. Инкубируйте язычки в EP трубы при 37 ° C в течение 24 ч.
  16. Вымойте язычки с PBS: добавить ампициллина в широкий рот бутылку с 250 мл стерильного PBS в конечной концентрации 90 мкг/мл. Переместите языки и перемешать бар в бутылку. Закрутите крышку бутылки с частью шва, остающиеся за пределами бутылки. Выполните эту операцию в стерильных условиях.
  17. Положите бутылку на магнитной мешалкой для 24 h.
  18. Храните подготовленный ТЕА в стерильных PBS на 4 ° C до использования.

2. трехмерные (3D) восстановление ККТС

  1. Статические модели строительства ККТС
    1. Семя 1.0 x 106 единого ККТС клетки (Cal27) в культуре блюдо 3,5 см. Добавьте 3 мл Дульбекко изменение среднего/F12 (DF12) содержащий 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), ампициллина 90 мкг/мл и 90 мкг/мл канамицин орла.
    2. Культура клетки Cal27 при 37 ° C 2 до 3 дней. Убедитесь, что клетки охватывать по меньшей мере 60% площади дна блюдо.
    3. Загрузить ТЕА на монослое Cal27 в культуре блюдо.
    4. Поместите блюдо в CO2 инкубатора при 37 ° C в течение 28 дней.
    5. Обновите каждый день во время процесса культуры клеток питательной среды. Концентрация CO2 в инкубаторе составляет 5%.
  2. Перемешивают ККТС модель строительства
    1. Подготовка самодельные перемешивают minibioreactor
      1. Выньте поршень от шприц 10 мл.
      2. Выкопайте яму (диаметр 1 см) возле нижнего терминал стержня и загрузки бар переполох в отверстие.
      3. Выкопайте яму (диаметр 0,5 см) в центре крышку бутылки пластиковые широкий рот бутылку и поставить шток через крышку.
      4. Вырезать половины 50 мл пластиковых пробирок и варить его на внешней стороне крышки бутылки.
      5. Прикрепите fishhooks к стержню, завернув стержень с лески, которые связаны с fishhooks.
        Примечание: До 4 fishhooks может быть присоединен к стержню.
      6. Автоклав самодельные комплекс перед использованием.
        Примечание: Сделать не автоклав широкий рот бутылку. Используйте новый стерильных пластиковых широкий рот бутылку при культивировании клеток.
  3. Динамических клеточной культуры
    1. Семя 1.0 x 106 отдельные ячейки Cal27 в самодельных minibioreactor. Добавьте 150 мл DF12 среда, которая содержит 10% FBS, 90 мкг/мл ампициллина и канамицин 90 мкг/мл.
    2. Загрузить ТЕА на minibioreactor с помощью fishhooks, прилагается к стержню.
    3. Завинтите крышку бутылки и поставить minibioreactor на магнитной мешалкой. Активируйте minibioreactor на 200 об/мин в инкубатор CO2 при 37 ° C 7 до 14 дней.
      Примечание: Концентрация CO2 в инкубаторе CO2 — 5%.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот протокол для подготовки ТЕА оказывается эффективно и целесообразно. ТЕА показал идеальный decellularization, по сравнению с родной язык тканей. Эффективность decellularization было подтверждено гематоксилином эозином, (он) окрашивание (рис. 1A-B). Он пятнать результаты показали полное исчезновение ядерного пятнать в ТЕА (рис. 1Б). Кроме того содержание ДНК количественной оценки от предыдущей...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Устоявшихся протокол для decellularized ECM изготовления следует сохранить родной ECM состав при удалении клетчатых компонентов в тканях почти полностью21. Несмотря на в настоящее время сообщил decellularization протоколов, которые требуют перфузии через сосудистую удалить ячеистых материалов конвективной транспортом механические агитации был принят здесь, известный как традиционный простой и недорогой способ22 , 23 ,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы признают поддержки научно-исследовательских грантов от национального фонда естественных наук Китая (31371390), программа проекта развития хай-тек (2014AA020702) и программа Гуандун науки и технологии (2016B030231001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
C57-BL/6JУниверситет Сунь Ятсена Центр лабораторных животных Этанол
Гуанчжоуский завод химических реактивовHB15-GR-2,5L
Хлорид натрияSangon BiotechA501218
хлорид калияSangon BiotechA100395
двухосновным фосфатом натрияГуанчжоуский заводхимических реактивовBE14-GR-500G
Моноосновной фосфат калия Sangon BiotechA501211
1,5 мл EP пробиркаAxygenMCT-150-A
Сверхнизкотемпературная морозильная камера Thermo Fisher Scientific
3,5 смThermo Fisher Scientific153066
чашка для клеточных культур 6 смGreiner628160
Triton X-100Sigma-AldrichV900502
хлорид кальцияSigma-Aldrich746495
хлорид магнияSigma-Aldrich449164
ДНКазаSigma-AldrichD5025
Сульфат магнияSangon BiotechA601988
глюкозаSigma-Aldrich158968
Бикарбонат натрияSigma-AldrichS5761
АмпициллинSigma-AldrichA9393
КанамицинSigma-AldrichPHR1487
Хирургический шовный материалShanghai Jinhuan
250 мл флакон с широким горлышкомSHUNIU1407
Магнитная мешалкаAS ONE1-4602-32
CO2 инкубаторSHEL LABSCO5A
10 мл шприцHunan Pingan
50 мл центрифуга пробиркаGreiner227270
Cal27 клеткаКитайская академия наук, Шанхайский банкЯзык плоскоклеточная карцинома клеточная линия
U2OS клеткаКитайская академия наук, Шанхайский банкКлеточная линия остеосаркомы человека
DMEM/F12Sigma-AldrichD0547
Пируват натрияSigma-AldrichP5280
Hepes свободная кислотаBBI
FBSHycloneSH30084.03
4 ° C холодильникHaier
Очиститель водыELGA
ГемоцитометрBLAU717805
мыши Чашка для клеточных культур клеток клеток A600264

Ссылки

  1. Elfring, T., Boliek, C. A., Winget, M., Paulsen, C., Seikaly, H., Rieger, J. M. The relationship between lingual and hypoglossal nerve function and quality of life in head and neck cancer. J. Oral Rehabil. 41, 133-140 (2014).
  2. Patel, S. C., et al. Increasing incidence of oral tongue squamous cell carcinoma in young white women, Age 18 to 44 Years. J. Clin. Oncol. 29, 1488-1494 (2011).
  3. Zhao, L., Huang, L., Yu, S., Zheng, J., Wang, H., Zhang, Y. Decellularized tongue tissue as an in vitro. model for studying tongue cancer and tongue regeneration. Acta Biomaterialia. 58, 122-135 (2017).
  4. Ng, S. L., Narayanan, K., Gao, S., Wan, A. C. Lineage restricted progenitors for the repopulation of decellularized heart. Biomaterials. 32, 7571-7580 (2011).
  5. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
  6. Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion. J. Vis. Exp. (6), e50059(2012).
  7. Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C-ME. 16, 525-532 (2010).
  8. Baptista, P. M., Siddiqui, M. M., Lozier, G., Rodriguez, S. R., Atala, A., Soker, S. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
  9. Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6, 134-136 (2010).
  10. Soto-Gutierrez, A., et al. A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 677-686 (2011).
  11. Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. 16, 814-820 (2010).
  12. Bonvillain, R. W., et al. A nonhuman primate model of lung regeneration: detergent-mediated decellularization and initial in vitro recellularization with mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 2437-2452 (2012).
  13. Daly, A. B., et al. Initial binding and recellularization of decellularized mouse lung scaffolds with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 1-16 (2012).
  14. Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
  15. Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
  16. Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Pt A. 16, 2581-2591 (2010).
  17. Wallis, J. M., et al. Comparative assessment of detergent-based protocols for mouse lung de-cellularization and re-cellularization. Tissue Eng. Part C-ME. 18, 420-432 (2012).
  18. Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
  19. Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat. Med. 19, 646-651 (2013).
  20. Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
  21. Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J. Clin. Invest. 122, 3817-3823 (2012).
  22. Song, J. J., Ott, H. C. Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds. Trends Mol. Med. 17, 424-432 (2011).
  23. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
  24. Shamis, Y., et al. Organ-specific scaffolds for in vitro expansion, differentiation, and organization of primary lung cells. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 861-870 (2011).
  25. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng. Pt A. 16, 2207-2216 (2010).
  26. Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Pt A. 16, 2565-2580 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Децеллюляризированный внеклеточный матрикс языкаобработка ДНКазойбиореактор собственной разработкистатический культивирование клетокдинамическое культивирование клетококрашивание гематоксилином и эозиномклетки Cal-27децеллюляризация тканей
Изготовление язык внеклеточного матрикса и воссоздание язык плоскоклеточный рак в пробирке
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.