Методическая статья

Конкретные и точного обнаружения цитрусовых озеленение возбудителя Candidatus liberibacter spp. Использование обычных ПЦР на цитрусовые образцы тканей листа

DOI:

10.3791/57240

⸱

29 июня 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina, 2Institute of Plant Protection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, 3Department of Instructions and Teacher Education, University of South Carolina

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цитрусовые озеленение является особенно разрушительным заболевание, поражающее цитрусовых культур во всем мире. Представленные здесь является простой метод с помощью ПЦР и Геномную ДНК добыча цитрусовых листовой ткани для точной и достоверной идентификации возбудителя цитрусовых озеленение, Candidatus liberibacter spp.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цитрусовые озеленение, также известный как huanglongbing, является разрушительной цитрусовых заболевание опустошает цитрусовых ферм во всем мире. Эта болезнь вызывает асимметричный желтый лист крапчатость, пожелтение вен, дефолиации, корневой гнили и в конечном счете, смерть цитрусовых растений. Когда зараженный, цитрусовые растения низкорослые роста и производят цветы вне сезона. Эти цветы редко дают плоды, и те, которые дают небольшие, горький, неправильной формы цитрусовых, которые не являются желательными. Эта болезнь распространяется азиатских цитрусовых psyllid, Diaphorina citri и путем прививки инфицированные ткани цитрусовых. Возбудитель имеет длинный и переменной инкубационный период в цитрусовых растений — иногда годы, прежде чем симптомы появляются. Попытки культуры этот возбудитель в vitro были безуспешными, возможно из-за низкой и неравномерным концентрация патогена в инфицированных цитрусовых ткани, или потому, что трудно повторить экологических условий благоприятствующих росту патогена. Это очень трудно определить заболевание, прежде чем он распространился, благодаря его длительный инкубационный период и неспособность исследователей культуры возбудителя. В результате болезнь только становится очевидной после внезапно уничтожить весь урожай цитрусовых фермер. Представленные здесь — это метод для точной и конкретной обнаружения возбудителя цитрусовых озеленение, Candidatus liberibacter spp., с использованием геномной ДНК добыча комплект и ПЦР. Этот метод является простой, эффективной, экономически эффективным и адаптированы для количественного анализа. Этот метод может быть адаптирована для использования на любой цитрусовых ткани; Однако это потенциально ограничивается количество патогена присутствуют в ткани. Тем не менее этот метод позволит цитрусовых фермеров для выявления зараженных цитрусовых растений ранее и сдерживанию распространения этой разрушительной болезни, прежде чем она может распространяться далее.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цитрусовые озеленение, также известный как huanglongbing, вызвало значительные потери цитрусовых деревьев. Один представитель случай является Флорида, где, по прогнозам, болезнь вызывают снижение на 70% в производстве Флорида оранжевый коробки из 244 миллиона коробок в сезоне 1997-1998 годов до 70 миллионов коробок по состоянию на 2016-2017 сезон1. Свыше 90% цитрусовых деревьев во Флориде являются зараженные2, и предполагается, что цитрусовая промышленность Флорида теряет около одного миллиарда долларов каждый год благодаря цитрусовых заболеваний, в котором цитрусовых озеленение играет важную роль3. Цитрусовые озеленение распространяется главным образом при инвазивных азиатских цитрусовых psyllid Diaphorina citri, но может также передаваться путем прививки зараженные ткани. Болезнь вызывает пожелтение вен, асимметричные желтый лист крапчатость, преждевременный листопад, отмирание веточку, корневой гнили и смерти завода. Важно отметить, что болезнь вызывает цитрусовые растения производить цветы вне сезона, которые редко плодоносить. Плоды, которые производится инфицированных цитрусовых растений незрелых, зеленый и горький, дегустация4.

Цель этого метода является точно и точно идентифицировать подвижные бактерия Candidatus liberibacter spp., возбудителя цитрусовых озеленение, живущих в пределах флоэма зараженных цитрусовые деревья5. Геномная ДНК, извлеченные из ткани весь лист, который содержит живых бактерий. Этот геномной ДНК используется в качестве шаблона для обычных PCR, где олигонуклеотиды дополняет бактерия 16S рДНК последовательности используются для усиления этой последовательности. Олигонуклеотиды комплементарную цитрусовых Транслируется используются как элемент внутреннего усиления. Мы решили использовать этот метод, потому что было доказано, чтобы быть успешным в предыдущих исследований6.

Этот метод имеет явное преимущество простой, относительно недороги и могут быть выполнены в любой лаборатории обычно оборудованы биохимии. Кроме того ПЦР остается наиболее точное и точный метод для обнаружения этого патогена, из-за сложности культивирования Этот возбудитель7и возбудителя способность выжить и воспроизвести лет бессимптомно принимающей8. Многие различные специальности анализы ПЦР были использованы для успешного обнаружения возбудителя; Однако обычные ПЦР остается простейший assay для точной и конкретной обнаружения, особенно в рамках бессимптомной хостов8.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Изолируйте геномной ДНК из растительной ткани, используя набор Genomic извлечения

  1. Получите цитрусовых листовой ткани резки весь свежий лист из цитрусового дерева, с использованием чистой ножницы и положите лист в чистые пластиковые сэндвич мешок.
    Примечание: Пакет, содержащий ткани листа следует поместить в холодильник 4 ° C или на льду в изотермических контейнеров как можно скорее после коллекции, чтобы избежать порчи.
  2. Добавьте небольшое количество жидкого азота для охлаждения ступку и пестик. Хотя они являются пугающими, используйте ножницы, чтобы вырезать небольшой кусок ткани листа, примерно 1 квадратный дюйм в размер. Место среза ткани в раствор немедленно заблокировать его. Добавьте более жидкий азот, в случае необходимости.
    Примечание: Изолированные перчатки должны всегда носить при обработке жидким азотом.
  3. Быстро измельчить растительной ткани в мелкий порошок, используя раствор. Далее, измельчение до жидкого азота полностью испаряется, и зеленый порошок остается.
  4. Кратко холод металлической лопаткой в жидком азоте для 10-15 s, а затем совок на земле ткани внутри раствор в 1,5 мл microcentrifuge трубку, используя шпатель.
  5. 600 мкл раствора Lysis ядер (см. Таблицу материалы) с использованием 1000 мкл Пипетка и вихревой образца для 1-3 сек, затем инкубировать в 65 ° C водяной бане 15 мин.
  6. 3 мкл раствора РНКазы lysate с помощью пипетки 10 мкл, инвертировать трубки 2 - 5 раз смешать его, и инкубировать при 37 ° C в шкаф инкубатора для 15 мин.
    Примечание: Позвольте смеси остыть до комнатной температуры перед продолжением.
  7. Добавьте 200 мкл белка осадков раствора, вихрь на высокой скорости для 20 s, а затем центрифуги для 3 мин на 13 000 x g сформировать твердые гранулы. В то время как образец является время центрифугируется, добавьте 600 мкл комнатной температуре изопропанола пробки microcentrifuge свежие 1,5 мл.
  8. С помощью пипетки 1000 мкл, тщательно удалите супернатант из центрифугировали образца, передачи его на трубу microcentrifuge свежие 1,5 мл, содержащих изопропиловый спирт. Теперь можно выбраковать гранулы.
    Примечание: Избегайте загрязнения супернатант с белком, оставляя незначительное количество супернатант выше гранулы.
  9. Инвертировать трубку, пока становится видимым как масса нитевидные нитей ДНК, а затем центрифуги на 13 000 x g 1 мин при комнатной температуре.
  10. Декант супернатанта, 600 мкл 70% этанола в гранулах, перевернуть трубку несколько раз мыть ДНК, и центрифуги на 13 000 x г за 1 мин.
  11. Тщательно аспирационная этанола, оставляя сыпучих гранул ДНК, а затем открыть и инвертировать трубки, опираясь на абсорбирующий бумаги. Воздух сухой при комнатной температуре в течение 15 мин.
  12. Добавьте 100 мкл раствора регидратации ДНК сухие гранулы ДНК, а затем инкубировать ДНК в ванну водой 65 ° C для 1 h, периодически помешивая, касания трубку.
  13. Место 1 мкл очищенной воды на microcuvette и вставить его в спектрофотометр использоваться как пустой. Рассчитайте концентрации ДНК нынешних 1 мкл пример на microcuvette, и вставка в спектрофотометра. Концентрация ДНК (нг/мкл) может быть вычисляемый как (260-320) × коэффициент разрежения × 50 нг/мкл.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Образцы можно хранить при 4 ° C.

2. выполнять ПЦР на геномной ДНК образцов

  1. Объединить 10 мкл 2 x PCR Master Mix (см. таблицу материалов), 1 мкл вперед грунт (10 pM/мкл), 1 мкл обратный грунтовка (10 pM/мкл) (см. таблицу 2 для последовательностей праймера), 100 нг геномной ДНК извлечены из образца и очищенной воды (до 20 мкл окончательный объем) в 50 мкл ПЦР-пробирку, Флик смешивать и кратко центрифуги.
  2. Вставьте Термоциклер ПЦР-пробирку и запустить соответственно (см. таблицу 1).
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. При необходимости Храните образца при температуре 4 ° C, после завершения реакции.

3. electrophorese амплифицированного ДНК в агарозном геле

  1. Весят 0.4 g агарозы порошок и добавить его вместе с 1 x TAE буфер в чистой 200 мл колбу Эрленмейера, заполнение до 50 мл.
  2. Микроволновой на высоко в течение 1,5 мин, пожимая каждые 30 сек, пока полностью не растворится агарозы.
    Примечание: Изолированные перчатки следует надевать при обработке жидких агарозы для предотвращения ожогов.
  3. 2.5 мкл бромид ethidium 10 мг/мл жидкого агарозы и встряхните смесь, затем вылейте жидкость агарозном геле в форму уровня геля. Быстро вставьте стандартные 12-зубов гель Расчески после заливки.
  4. Разрешить гель остыть в течение 20 минут при комнатной температуре, а затем удалить гелем Комбс и поместите гель в поле уровень Гель заполнены с 1 x TAE буфера.
  5. С помощью микропипеткой, загрузите всего усиливается образцы ДНК в скважины. Добавьте 5 мкл ДНК лестница (см. Таблицу материалы) в отдельной скважины от ваших образцов.
  6. Electrophorese образцы для 35 мин с постоянной 90 V, а затем удалить гелем и место в УФ transilluminator.
  7. Фотография и анализировать гель диапазонов шаблон при использовании ультрафиолетового просвечивания в 302 Нм.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Положительный результат дает различные группы соответствует 500 bp Candidatus Liberibacter Азиатская Las606/Lss6, и/или отдельных группы, соответствующий 700 bp для Laa2/Laj5, Вставка в рибосомных β 16S Оперон9. Группа внутреннего усиления контроля должны также появляются на 400 bp. Эта группа соответствует амплификации цитрусовых Транслируется гена10и должны появиться на р...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Важно, что все шаги выполняются точно для достижения оптимального экспериментальных условиях. Весь лист ткани был использован во время этой демонстрации; Однако можно изменить протокол теоретически включать любые виды растительной ткани. Ранее Исследователи извлекали геномной ДНК из Вены ткани листа, а не весь лист ткани и достигнутые аналогичные результаты11. Если группы, соответствующий цитрусовых Транслируется ген не появляется, результатом является недействительным, и там может быть о...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Huan Chen, Ian Артур Палмер, Чэнь Цзянь, Чанг Минг, Стивен Томпсон, Fengquan Лю и Фу Цин Чжэн объявить отсутствие конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Концептуализации, H.C. и Z. Q. ф; Расследование, H. C., J. C и Z. Q. F; Ресурсы, Z. Q. ф; Написание - оригинальный проект, I. A. P.; Написание – обзор и редактирование, I. A. P., J. C., H. C., с л. т. и з. Q. ф; Визуализация, H. C.; Надзор, Z. Q. ф; Финансирование приобретения, Z. Q. F и F. Q. л

Проект поддержан Южная Каролина улучшение учитель качества высшего образования государственный грант под названием, повышение среднего классов науки учителя знания растений процессов, структур и функций посредством участия в наук исследования растений (завод Наука)

Фонды, награжден Соединенные Штатов Департамента образования (CFDA номер 84.367B)

Авторы хотели бы поблагодарить Nian Ванг из университета Флориды для предоставления геномной ДНК образцов от инфицированных Citrus sinensis Валенсии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Набор для очистки геномной ДНК WizardPromega A1120Источник решений для лизиса ядер, РНКазы, осаждения белков и регидратации ДНК
Жидкий азотВоздухПродукты Н/Д
Мастерциклер про с панелью управленияEppendorf6321000019
1250 Вт Микроволновая печьPanasonicН/Д
5424 настольная центрифугаEppendorf05-403-93
Isotemp 215 цифровая водяная баняFisher scientific15-462-15Q
Металлический шпательSigma-AldrichZ283274
Ступка и пестикSigma-AldrichZ247464
LSE Vortex MixerCorning6775
2-пропанолSigma-AldrichI9516
Стерильные 10 & мкм; L насадкиTipOne1161-3730
Sterile 200 μ L наконечникиTipOne1163-1730
Sterile 1250 μ L наконечникиTipOne1161-1750
Набор пипеток переменного объемаVWR75788-460
Бромид этидияSigma-AldrichE1510
АгарозаIBI ScientificIB70041
EDTAThermo Fisher Scientific17892
Уксусная кислотаFisher ChemicalA38-212
База TrisSigma-Aldrich10708976001
μ кюветаEppendorf6138000018
Штабелируемый литейный лоток и гребниCarolina213655
PowerPac Basic Power SupplyBio-Rad1645050
Mini-Sub Cell GT SystemBio-Rad1704487EDU
Биоспектрометр базовыйEppendorf6135000009
0,2 мл ПЦР-пробиркиFisher scientificAB-0620
1,5 мл микроцентрифужные пробиркиThermo Fisher Scientific3439
2X Taq Green PCR Master MixPromegaM7122
Форвард праймерThermo Fisher ScientificN/A
Обратный праймерThermo Fisher ScientificN/A
Вода, ПЦР маркиSigma-Aldrich3315953001
Гель Doc XR+Bio-Rad1708195
1 КБ+ ДНК-лестницаThermo Fisher Scientific10787018

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Field Office, F. lorida Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size. , USDA, NASS, Florida Field Office. (2016).
  2. Singerman, A., Useche, P. Impact of citrus greening on citrus operations in Florida. Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , EDIS (FE983) (2015).
  3. Spreen, T. H., Hodges, A. The economic impact of HLB on the florida citrus industry. , University of Florida. (2012).
  4. UICEP. Pathology. , (2013).
  5. Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria. Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).
  6. Fujikawa, T., Iwanami, T. Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium "Candidatus Liberibacter asiaticus" by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers. Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).
  7. Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. Co-cultivation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' with actinobacteria from citrus with huanglongbing. Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).
  8. Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015). , (2015).
  9. Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon. Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).
  10. Mafra, V., et al. Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions. PLoS One. 7 (2), e31263(2012).
  11. Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing. J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи