Протокол описывает инженер perfusable сосудистой сети в сфероида. Окружающие микроокружения сфероида разрабатывается побудить ангиогенеза и подключить сфероида к микроканалов microfluidic устройства. Метод позволяет перфузии сфероида, который является долгожданный технику в трехмерном культур.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Perfusable сосудистая сеть с моделью ткани в устройстве Microfluidic
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Сфероиде (многоклеточных совокупности) рассматривается как хорошая модель живых тканей в организме человека. Несмотря на значительные улучшения в культурах сфероида perfusable сосудистой сети в сфероидов остается важнейшей задачей для долгосрочной культуры, необходимо поддерживать и развивать их функции, такие как выражения протеина и морфогенеза. Протокол представляет новый метод для интеграции perfusable сосудистой сети в пределах сфероида microfluidic устройства. Чтобы побудить perfusable сосудистой сети в сфероида, ангиогенных ростки, подключенных к микроканалов на сфероиде руководствовались используя ангиогенных факторов от человеческих легких фибробластов, культивируемых в сфероида. Ростки ангиогенных достиг сфероида, объединилась с эндотелиальных клеток, совместно культивируемых в сфероида и формируется непрерывный сосудистой сети. Сосудистой сети может perfuse интерьер сфероида без какой-либо утечки. Сконструированный сосудистой сети может далее использоваться в качестве маршрута для поставки питательных веществ и удаления отходов, имитируя циркуляцию крови в vivo. Этот метод предоставляет новую платформу в культуре сфероида сторону лучше перепросмотре живых тканей.
Введение
Переход от монослойном культивировании (двухмерный) к трехмерной культуре мотивируется необходимость работы с моделями культуры, которые имитируют клеточных функций живых тканей1,2,3. Плоские и жесткие пластиковые субстраты, широко используется в культуре клеток не напоминают большую часть внеклеточных средах в человеческом теле. В самом деле многие исследования показывают, что трехмерная культуры воссоздать ткани конкретных архитектуры, механические и биохимических подсказки и связи ячеек, которые не наблюдались в обычных двумерных культуры4,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Изготовление прессформы Microfluidic устройства
- Дизайн-шаблон microfluidic устройства с использованием имеющегося программного обеспечения (Clewin5 или AutoCAD 2016, и т.д.). Для функции Clewin5 смотрите руководство пользователя (http://manualzz.com/doc/7159150/clewin-user-s-manual).
Примечание: Файл дизайн доступен в дополнительных файлов 1. - Перенесите файл дизайн микро модель генератора и загрузить инструмент с маской хром покрытием с позитивного фоторезиста.
- Разоблачить позитивного фоторезиста в области шаблон, с помощью микро модель генератора.
- Развитие позитивного фоторезиста, используя разра....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рисунок 1 показывает, Дизайн и фото microfluidic устройства. Она имеет три параллельных каналов, в котором канал 2 содержит сфероида хорошо. Для культуры HUVEC используются каналы 1 и 3 и 2 канал для сфероида. Каждый канал отделяется трапециевидной microposts предназначен шаблон PDMS. Microposts предотвратить гидрогеля на канале 2 от утечки в каналах 1 и 3, поверхностное натяжение и позволяют обмена веществ между сфероида и HUVECs в микроканалов
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Предыдущие доклады показывают, что hLFs выделяют коктейль из нескольких ангиогенных факторов, таких, как Ангиопоэтин-1, Ангиогенин, фактора роста гепатоцитов, превращая фактор роста α, фактора некроза опухоли и некоторые внеклеточного матрикса белки29, 30. Этот assay полагается на секрецию ангиогенных из hLFs в coculture сфероиде, который является ограничение техники. Таким образом крайне важно для формирования стабильной сосудистой установить сфероиде coculture.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Автор заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана гребень JST (Грант № JPMJCR14W4), общества для поощрения от науки (JSP) KAKENHI (номер 25600060, 16K 16386 Грант), центр инновационной программы от МПКСНТ и JST, проект был сосредоточен на разработке технологии оценки ключ от Японское агентство для медицинских исследований и развития, AMED, Mizuho Фонд содействия развитию наук. Микротехнологий поддержали Киотский университет нано технологии концентратора.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| AutoCAD 2017 | Autodesk | AutoCAD 2017 | |
| Хромированная маска с покрытием AZP 1350. | ТЕХНОЛОГИЯ ЧИСТОЙ ПОВЕРХНОСТИ | CBL2506Bu-AZP | |
| Микрогенератор шаблонов | Heidelberg | uPG101 | |
| MF CD-26 проявитель | Rohm and haas electronic | materials-Проявитель | в протоколе 1.4 |
| S-Clean | Sasaki Chemical | S-24 | Хромовый травитель в протоколе 1.5 |
| Aceton | Wako | 012-00343 | |
| Кремниевая пластина | Canosis | SiJ-4 | |
| Spin Coater | MIKASA | 1H-D7 | |
| Hexamethyldisilazan (HMDS) | Tokyo Ohka Kogyo | H0089 | |
| SU-8 3050 | MicroChem-Негативный | фоторезист в протоколе 1,9 | |
| УФ-воздействия | Нанометрические технологии Inc | LA310s | |
| SU-8 Проявитель | MicroChem | Y020100 | Проявитель для негативного фоторезиста в протоколе 1.13 |
| 2-пропанол | Wako | 163-04841 | |
| Профилограф поверхности | Veeco | Veeco Dektak XT-S | |
| (Трихлор (1H, 1H, 2H, 2H-перфтороктил) | силан Sigma | 448931 | |
| полидиметилсилоксан (PDMS) | Dow Corning Toray | 184W/C | |
| Biopsy Punch (1.0mm) | Kai Industries | BP-10F | |
| Biopsy Punch (2,0 мм) | Kai Industries | BP-20F | |
| Плазменная система | Femto Science | COVANCE | |
| Cover Glass | MATSUNAMI GLASS | C024241 | |
| чашки для культур | Iwaki | 1000-035 | |
| RFP экспрессия эндотелиальных клеток пупочной вены человека | ангиопротеомии | cAP-0001RFP | |
| нормальные фибробласты легких человека | lonza | CC-2512 | |
| Среда для роста эндотелиальных клеток | Lonza | CC-3162 | |
| Наборы питательных сред для фибробластов | Lonza | CC-3132 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| сыворотка плода крупного рогатого скота | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| раствор пенициллин-стрептомицина | Wako | 168-23191 | |
| 0,05 вт/об% трипсин-0,53 ммоль/л ЭДТА&бык 4Na раствор с фенолом Red | Wako | 204-16935 | |
| PBS (фосфатные буферные соли) | Takara bio | T900 | |
| 96-луночная пластина | Sumitomo бакелитовый | 631-21031 | |
| 1000мкл чип | NIPPON Genetics | FG-402 | |
| 200ul Чип | NIPPON Genetics | FG-301 | |
| 10 мкл Чип | NIPPON Genetics | 37650 | |
| CO2 инкубатор | Thermo Fisher Scientific | Model 370 | |
| GFP экспрессирующий эндотелиальные клетки пупочной вены человека | ангиопротеомия | cAP-0001GFP | |
| Фибриноген из плазмы крупного рогатого скота | Sigma | F8630 | |
| Апротинин из легкого крупного рогатого скота | Sigma | A6279 | |
| Коллаген I | Corning | 354236 | |
| Тромбин из плазмы крупного рогатого скота | Sigma | T4648 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H21492 | Флуоресцентный краситель для окрашивания ядер в протоколе 5.5 |
| Раствор параформальдегида | Wako | 163-25983 | |
| Инвертированный флуоресцентный микроскоп | OLYMPUS | IX71 | |
| Дегитальная ПЗС-камера | OLYMPUS | ORCA-R2 | |
| Конфокальный лазерный сканирующий биологический микроскоп | OLYMPUS | FV1000 | |
| Инвертированный флуоресцентный микроскоп | OLYMPUS | IX-83 | |
| Флуоресцеин изотиоцианат-декстран | Sigma | FD70S |
Ссылки
- Abbott, A. Cell culture: Biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10),....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
