Изоляции и в пробирке культуры мышиных и человека альвеолярные макрофаги

Микроокружения легких является уникально сложной экосистемы с каналом разработки воздуха и сосудистую. Вдыхаемый воздух проходит через трахею и многочисленные филиалы бронхов и бронхиол до достижения альвеолы, где происходит обмен газа крови воздух. Из-за прямое взаимодействие с атмосферой дыхательную поверхность требует защиты от потенциально вредного воздействия частиц и загрязнителей. Количество физических, химических и иммунологических барьеров защитить легкй. В частности развертывания фагоцитов на дыхательную поверхность обслуживает систему важной первой линии обороны. Альвеолярных макрофагов (AMs) являются одним из видов легких резидентов фагоцитов, и они составляют подавляющее большинство легких макрофагов бассейн. Как их названия, AMs преимущественно локализуются в просвете альвеол и происходят как сидячие клетки, которые постоянно образца окружающей атмосферы и общаться с альвеолярный эпителий¹. В стационарном состоянии легких более 95% фагоцитов в альвеолярной пространстве являются AMs², состав которых может измениться из-за воспаления, инфекции или хронического воздействия загрязнителей.

АПП участвовать в широком диапазоне функций, которые могут быть локальными для легких и/или имеющим системное значение. Например AMs имеют важное значение в развитии и оптимального функционирования легких; иммунной наблюдения; Распродажа сотовой мусора, вторгаясь патогенов, и вдыхании частиц^3,4,5,6,7. Целевые истощение AMs известно повредить Распродажа респираторных вирусов и бактерий в^4,8. Помимо их роли как фагоцитов и первой линии защитников легочной гомеостаза, AMs известны функционировать как антиген представляющих клеток в вызывая T клетки иммунитета⁹, потенцирования эффективность интраназальная вакцина¹⁰ и влияние на легких ограничено аутоиммунные заболевания после трансплантации легких^11,12. Дефицит в AM функции были связаны с легочных альвеол proteinosis (PAP), состояние в результате генетической мутации, злокачественности или инфекции, что ухудшает Распродажа легочной ПАВ^13,14. Трансплантация AMs сейчас изучается как терапевтический подход для лечения Пап ^15,16.

АПП, как известно, происходят во время эмбриогенеза и сохраняются в легких на протяжении всей жизни без будучи заменена циркулирующих лейкоцитов^2,17. Хотя, AM оборот не обнаруживается в гомеостатических легких, различные уровни оборота утра были зарегистрированы в некоторых клинических условиях, включая инфекции гриппа вирус⁴, myeloablative облучения¹⁸, подверженности эндотоксинов ¹⁹и²⁰старости. АПП верил самостоятельного возобновить через низкосортных распространения^17,21, но некоторые недавние исследования утверждают, что моноциты может породить населением внутрисосудистого легких макрофаги^22,23 под экспериментальных условиях, но функциональность этих новообращенных легочной макрофагов еще должен быть определен в легочных заболеваний. Кроме того понимание порог стимул в контексте AM активации является потенциально интересный район, как легких пытается сохранить равновесие между воспалительных сигналов и иммунорегуляторное машины.

Физиологические и патологические изменения, которые приводят к потере иммунной регуляции имеют важное значение для оценки в различных клинических параметров (например, респираторные инфекции, заболевания легких, воспалительных и фиброзных легочных заболеваний). Тем не менее AMs все чаще признаются в качестве показателей или даже детерминанты здоровья легких^11,24. В настоящее время есть нет единых протоколов для сбора урожая, характеризующие, и/или поддержание AMs от людей и доклинические мышиных моделях. Отсутствие консенсуса по утра прекурсоров и фенотипы, а подробная методология была основным камнем преткновения в расшифровке роль(и) AM в легких здоровья и болезни. Следующий протокол предлагает окончательное определение, изоляции и в пробирке культуры стратегию, которая будет значительно глубокого понимания поведения AM и облегчить AM-целенаправленных диагностических и терапевтических исследований.

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) и институционального обзора Совет (IRB) в госпиталь и медицинский центр Святого Иосифа.

1. изоляция AMs из мышиных Бронхоальвеолярный лаваж (BAL) жидкости

1. Обезболивают 8 недельных C57BL/6 мышь с кетамин (87.5 мг/кг массы тела) и коктейль через внутрибрюшинной инъекции Ксилазина (12,5 мг/кг веса тела). Продолжить, когда мышь достигает хирургического наркоза с потеря рефлексов и расслабление мышц.
2. Поместите курсор мыши на поверхность вскрытия брюшной стороной вверх. Примените мазь офтальмологический ветеринар на глаза, чтобы предотвратить обезвоживание и протрите всю вентральной поверхности мыши с стерильных алкоголя приготовительный колодки, насыщенных с 70% изопропиловый спирт для дезинфекции.
3. Подключите мышь с все четыре ноги сдержанной.
4. Аккуратно откройте брюшной полости с микро рассечение инструменты. Необходимо позаботиться чтобы открыть столько области как можно без повреждения любого висцеральных органов или создание свисая ткани.
5. Аккуратно откройте грудной полости, медленно промо грудную клетку через средостения. Идеально грудная клетка может вырезан из стороны в сторону. Необходимо крайняя осторожность, чтобы не травмировать плевры легких при открытии грудной полости.
6. Найдите нижней полой вены и надрезают кровоточить мыши. Используйте абсорбирующий ватные подушечки, чтобы впитать крови.
7. Inject 10 мл ледяной фосфатный буфер (PBS) в правом желудочке (используя 10 мл шприц и игла 25G) для сброса циркулирующих клеток крови. Абсорбировать приток крови с абсорбирующей ватный тампон. После того, как полностью увлажненную, легкие появится бланшированные и затем готовы для промывания.
8. Аккуратно разрезать кожи и мышц в шею подвергнуть дыхательных путей. Тщательно акцизных прилегающих мышц, хрящей и жировой ткани без повреждения трахеи.
9. Сделать небольшой надрез (< 2 мм) на трахею кзади гортани. Этот разрез должен быть просто достаточно, чтобы вставить катетер в то время как трахеи еще привязаны к гортани. Вставка 1-дюймовый 22G катетер без иглы в трахею сторону легких. Безопасный катетер с шелк плетеный швом (4-0; не рассасывающиеся) с квадратный узел.
   Примечание: Катетер должен быть уравновешенным основе размера мыши. Очень короткие или длинные катетеры, как правило, утечки или слезу дыхательных путей во время промывания. Катетер длина должна быть такой, что когда полностью вставляется кончик остается хорошо в трахею и не достичь основной бронхов.
10. Приложите 1 мл шприц, наполненный ледяной бал буфера (Ca^{2 +} и Mg^{2 +} бесплатные PBS + 1 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота, ЭДТА) катетера и медленно привить буфер в легкие. Это будет раздувать легких. Держите шприц, придает катетер для пяти секунд и затем аспирационная жидкость лаважа, осторожно потянув поршень. Это будет выкачать легких. Сбор жидкости в 15 мл Конические трубки помещены на льду.
11. Повторите шаг 1.10 для девять раз и бассейн промывание жидкости. Не превышать 1 мл буфера очищаемых, как это может превышать емкость легких и привести к ее разрыву.
12. Усыпить мыши с CO₂ передозировка IACUC утверждены Протоколом.
13. Центрифуга 10 мл бал жидкости на 250 x g при 4 ° C на 10 минут. Пелле ячейка содержит клетки бал.
    Осторожностью: Пелле может быть очень мала, поэтому осторожность при аспирационных супернатант.
14. Ресуспензируйте бал клетки в 100 мкл потока/сортировки буфера (PBS + 2% тепла инактивированная плода бычьим сывороточным (ФБС) + 1 мм ЭДТА 25 мм N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic кислоты (HEPES)).
15. Блокировать неспецифических антитела связывая к Fc рецептор, добавляя мыши ФК блок (клон 2.4G2, 10 мкг/мл) и инкубации за 20 минут на льду.
16. Выполняют антитело пятная наряду с флуоресцентным минус один (FMO) и одно пятно элементов^11,25. Оценивать BAL клетки анализатором ячейки (см. Таблицу материалы) следуют одноклеточных потока cytometry анализ программного обеспечения надлежащего анализа (см. Таблицу материалы).
17. Изолировать AMs активирован флуоресценции клеток сортировщик (см. Таблицу материалы) непосредственно в 1 мл мыши я культуры среднего когда AMs предназначены для культуры в vitro или в естественных условиях клетки передачи. Кроме того сортировка АПП в 1 мл литического буфера (см. Таблицу материалы) дополнены 10 мкл/мл β-меркаптоэтанол для извлечение RNA.

2. изоляция AMs от мыши легких, одноклеточных подвеска

1. Обезболивают 8 недельных C57BL/6 мышь с кетамин (87.5 мг/кг массы тела) и коктейль через внутрибрюшинной инъекции Ксилазина (12,5 мг/кг веса тела). Продолжить, когда мышь достигает хирургического наркоза с потеря рефлексов и расслабление мышц.
2. Поместите курсор мыши на поверхность вскрытия брюшной стороной вверх. Примените мазь офтальмологический ветеринар на глаза, чтобы предотвратить обезвоживание и протрите всю вентральной поверхности мыши с стерильных Спиртовые салфетки, насыщенных с 70% изопропиловый спирт для дезинфекции.
3. Подключите мышь с все четыре ноги сдержанной.
4. Аккуратно откройте брюшной полости с микро рассечение инструменты. Необходимо позаботиться чтобы открыть столько области как можно без повреждения любого висцеральных органов или создание свисая ткани.
5. Аккуратно откройте грудной полости, медленно промо грудную клетку через средостения. Идеально грудная клетка может вырезан из стороны в сторону. Необходимо крайняя осторожность, чтобы не травмировать плевры легких при открытии грудной полости.
6. Найдите нижней полой вены и надрезают кровоточить мыши. Используйте абсорбирующий ватные подушечки, чтобы впитать крови.
7. Inject 10 мл ледяной PBS в правый желудочек (используя 10 мл шприц и игла 25G) для сброса циркулирующих клеток крови. После того, как полностью увлажненную, легкие появится бланшированные и готовы к уборке.
8. Вскрыть из легких, разрыв трахеи, кровеносных сосудов и связок в 15 мл Конические трубки с 5 мл холодного Дульбекко изменение орла среднего (DMEM). Поддерживать его на льду до следующего шага.
9. Усыпить мыши с CO₂ передозировка IACUC утверждены Протоколом.
10. Перевести перфузии легких в стерильных и пирогена бесплатно 60 мм культуры блюдо с 3 мл DMEM. С помощью рассекает щипцы дразнить из дыхательных путей и других материалов, трудно не легочной ткани, если он присутствует. Фарш легочной ткани с помощью скальпеля для < 1 мм размер.
11. Добавить 300 мкг/мл Liberase TL и 5 ед/мл DNase I, смешивать, закупорить и проинкубируйте 25 минут при 37° C в инкубаторе. Осторожно смешайте один раз закупорить после 10 минут.
12. Передайте диссоциированных легких через стрейнер ячейки 100 мкм, установлен на 50 мл Конические трубки. Использование задней поршень от 1 мл шприц к заторного скопления клеток на фильтре. Промойте фильтр с 20 мл мыть буфера (PBS + 2% тепла инактивированных FBS + 2 мм ЭДТА).
13. Центрифуга на 500 x g при 4 ° C за 5 минут. Отменить супернатант и Ресуспензируйте Пелле ячейки в буфер мыть 20 мл.
14. Повторите шаги 2.12 и 2.13 дважды, изменяя фильтр и трубы каждый раз. Предварительного замачивания фильтр в мыть буфер для более чем пяти минут увеличивает урожайность AM. Подготовка одной ячейки подвеска, добавив 100 мкл, поток/сортировка буфера ячейка Пелле.
15. Блокировать неспецифических антитела связывая к Fc рецептор, добавляя мыши ФК блок (клон 2.4G2, 10 мкг/мл) и инкубации за 20 минут на льду.
16. Выполните антитело пятная наряду с FMO и сингл пятно элементов^11,25. Оценивать легких клетки анализатором ячейки (см. Таблицу материалы) следуют одной ячейки проточной цитометрии анализ, анализ программного обеспечения.
17. AMs Сортировка по сортировщик клетки (см. Таблицу материалы) непосредственно в 1 мл мыши AM культуры среднего когда AMs предназначены для культуры в vitro или в естественных условиях клетки передачи. Кроме того сортировать АПП в 1 мл буфера Lysis дополнена 10 мкл/мл β-меркаптоэтанол для извлечение RNA.

3. изоляция AMs от человека бал жидкости

1. Организовать передачу человека бал жидкости из клиники в лабораторию при 4 ° C.
2. Центрифуга бал жидкости (10-50 мл) на 250 x g при 4 ° C на 10 минут. Пелле ячейка содержит клетки бал¹¹.
3. Помыть лепешка с 20 мл мыть буфера (PBS + 2% тепла инактивированных FBS + 2 мм ЭДТА) и центрифуги на 250 x g при 4 ° C на 10 минут.
4. Ресуспензируйте бал клетки находятся в 100 мкл буфера потока/сортировки (PBS + 2% тепла инактивированных FBS + 1 мм ЭДТА + 25 мм HEPES).
5. Блокировать неспецифических антитела связывая к Fc рецептор, добавляя человека ФК блока (клон Fc1.3070, 25 мкг/мл) и инкубации за 20 минут на льду.
6. Выполните антитело пятная наряду с FMO и сингл пятно элементов^11,24. Оценивать BAL клетки анализатором ячейки (см. Таблицу материалы) следуют одной ячейки проточной цитометрии анализ, анализ программного обеспечения.
7. AMs сортировки путем сортировки клеток (см. Таблицу материалы) непосредственно в 1 мл человека AM культуры среднего или 1 мл буфера Lysis дополнена 10 мкл/мл β-меркаптоэтанол.

4. в vitro культуры от AMs

1. После сортировки клеток, урожай клетки центрифугированием на 250 x g при 4 ° C на 10 мин.
2. Ресуспензируйте человека АПП в 1 мл человеческой культуры среднего AM [Розуэлл парк Мемориальный институт средних FBS (RPMI) 1640 с 10%, 20% L-929 культура супернатанта (как источник макрофагальный колонии стимулирующий фактор (M-CSF), конечная концентрация 100 ед/мл), пируват натрия 1 мм, 10 мм N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic кислоты (HEPES) и 1 x пенициллина/стрептомицина (Факультативного)]. Аналогичным образом Ресуспензируйте мыши АПП в 1 мл мыши AM питательной среды [DMEM, дополненная 10% FBS, 20% L-929 культуры супернатанта (как источник M-CSF, конечная концентрация 100 ед/мл), 1 мм пируват натрия, 10 мм HEPES и 1 x пенициллина/стрептомицина (опционально )].
3. Перечисление Трипановый синий, исключая жизнеспособных клеток, клеток счетчика и регулировка концентрации жизнеспособных клеток в 1 x 10-6/мл.
   Примечание: В идеале, до 5 x 10⁵ AMs может быть изолирован от бал жидкости, собранные из 8-10 недельных C57BL/6 мужчины мыши. AM доходность от легких дайджест мыши является переменной и может быть немного меньше, чем мыши бал жидкости. AM доходность от человека бал жидкости зависит от объема жидкости, бал, общий объем физиологического раствора, используемых в промывание и клинического состояния пациента.
4. Основываясь на урожайность и экспериментальной необходимость, семян клетки в камере слайды, культуры блюда или фляги культуры. В идеале семян AMs на 1 x 105/мл, 10 мл среднего в колбе T25 культуры ткани.
5. Инкубируйте клетки в увлажненные инкубатора 37 ° C с 5% CO₂ атмосферы.
   Примечание: АПП будет расти как адэрентных клеток и растут очень медленно (время удвоения > 7 дней).
6. На 24 часа после посева, AMs должно быть сторонником и не будет отсоединена нежный изменением питательной среды. Удалите носитель, аспирации от одного конца и пополняться свежими среднего, предварительно нагретой до 37 ° C.
   Примечание: Клетки теперь могут использоваться для оценки AM физиологии или воздействия раздражителей. АПП, выращенных в камере слайды можно удобно витражи с соответствующим антител и идеальны для микроскопических визуализации. Для оценки потока гранулярных AMs собирают по инкубации с неферментативного ячейки отделения решения.
7. Аспирационная питательной среды и добавьте разъединять решения достаточно для покрытия поверхности культуры (примерно 2 мл на колбу T25) и инкубировать при 37 ° C за 5-10 минут. Не очищая будет необходимо, и не рекомендуется для механически очистить клетки. Аккуратно постучите по стенкам, добавить 1-2 мл буфера потока/Сортировка и аккуратно Пипетка вверх и вниз, чтобы отсоединить большинство адэрентных клеток.
8. Для исследования РНК Лизируйте клетки непосредственно на культуры блюдо, добавив буфера Lysis.

Поток гранулярных подход к идентификации мыши АПП показано на рисунке 1. Это включает в себя анализ минимальный набор необходимых в разграничении AMs от других легких резидентом или легкого проникновения фагоцитов поверхностных маркеров. Дифференциальный анализ необходим для положительной идентификации AMs из интерстициальных макрофаги, дендритные клетки, нейтрофилов, моноцитов и моноцитарных легочной макрофаги, которые происходят в легких. Следующая схема поверхностных маркеров могут использоваться легко различать эти типы клеток друг от друга где AMs являются CD45+, CD11c+, Siglec-F+, CD64+-Ab + /-, F4/80-, CD11b- ; Интерстициальный макрофаги являются CD45+, CD11b+-Ab +, CD64+, CD24-; CD11b + Дендритные клетки являются CD45+, CD11b+, CD11c+-Ab +, CD24+, CD64-; CD103 + Дендритные клетки являются CD45+, CD11c+, CD24+, CD103+-Ab +, CD11b-; Плазмоцитарная Dendritic клетки являются CD45+, CD317+, Siglec-H+, Ly - 6 C+-Ab -, нейтрофилы являются CD45+, CD11b, Ly - 6 G++, CD11c- ,-Ab -Ly - 6 C–и моноциты являются CD45+CD64+ /-, Ly - 6 C+ /-,-Ab -. AM населения, выделены красным (CD11cПривет и Siglec-FПривет) и голубой (CD11cПривет, Siglec-Fint), соответственно, представляют обычные AMs (крупные населения) и моноцитарных легочной макрофагов ( незначительные населения), происходят в альвеолярной пространстве. Поток, сортировка CD45+, CD11cПривет, Siglec-FПривет клетки урожайности очищенный мыши AMs. Рисунок 2 иллюстрирует клеток поверхности маркеры необходимые для точной идентификации и изоляции человека АПП. Человека АПП идентифицированы как CD45+, CD11b+, CD163, HLA-DR++, CD169+и CD206+ бал клеток и может быть отсортирован по течению приложений потока.

Рисунок 1 : Анализ представительных потока гранулярных мыши AMs. (A) анатомическое расположение АПП в разделе ткани легких мыши (гематоксилином и эозином). АПП обозначаются стрелками и линейки шкалы составляет 60 мкм. (B) представитель проточной цитометрии стробирования стратегии выявления мыши АПП в клетках бал. Образцы были оценены анализатором ячейки и данные были вниз пробы на 500 событий для сравнения путем анализа программного обеспечения. Красный (CD11cПривет и Siglec-FПривет) и чирок (CD11cПривет, Siglec-Fint), соответственно, являются обычными AMs (крупные населения) и моноцитарных легочной макрофагов (незначительные населения). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Анализ представительных потока гранулярных человека АПП. (A) стробирование стратегии для идентификации человека AMs от бал жидкости от получателя трансплантации легких человека. (B) светлые области микрофотография человеческого AMs на семь дней культуры. Линейки шкалы составляет 400 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов объявить.