JoVE Journal > Immunology and Infection
Резюме
Abstract
Introduction
протокол
Результаты
Discussion
Раскрытие информации
Acknowledgements
Materials
Ссылки
Иммунология и инфекции

Желчь соли индуцированной биопленки в кишечных патогенов: методы для идентификации и количественной оценки

Published: May 06, 2018
doi:
10.3791/57322
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
,
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition,Массачусетская больница общего профиля, 2Отделение педиатрии,Гарвардская медицинская школа

Резюме

Этот протокол позволяет читателю анализа соли желчных индуцированной биопленки в кишечных патогенов, используя многосторонний подход для захвата динамический характер бактериальных биопленок путем оценки соблюдения, формирования матрицы внеклеточного полимерные вещества, и дисперсией.

Abstract

Биопленки является динамичной, многоступенчатый процесс, который происходит в бактерий в суровых условиях окружающей среды или время стресса. Для кишечных патогенов значительный стресс ответ индуцируется во время транзита желудочно-кишечного тракта и при воздействии желчи, нормальной составляющей человека пищеварение. Чтобы преодолеть бактерицидный эффект желчи, многие кишечных патогенов образуют биопленки, предположили, чтобы разрешить выживания, когда транзитом через кишечник. Здесь мы представляем методологии для определения биопленки через присоединение твердофазный анализов, а также внеклеточного полимерные вещества (EPS) матрица обнаружения и визуализации. Кроме того Оценка дисперсии биопленки представлена имитировать анализ событий, вызывая релиз бактерий во время процесса инфекции. Фиолетовый Кристалл пятнать используется для обнаружения адэрентных бактерий в assay соблюдение высокой пропускной способностью 96-луночных пластины. Оценка производства EPS определяется двумя анализов, а именно микроскопии пятнать EPS матрицы и полуколичественного анализа с Лектин привязки дневно конъюгированных полисахарид. Наконец дисперсия биопленки измеряется с помощью графов колонии и обшивки. Позитивные данные из нескольких анализов поддерживают характеристику биопленки и могут быть использованы для выявления желчные соли индуцированной биопленки в других бактериальных штаммов.

Introduction

Биопленки является важным бактериальных выживания, индуцированной в суровых условиях окружающей среды. Подверженности бактерицидные соединения как антибиотики или изменения в питательных или наличие кислорода вызывает напряженного состояния в бактерии, которые могут быть решены через биопленки. Биопленки характеризуется бактериальных привязанность к поверхности или других бактерий и сопровождается секрецию EPS матрицы, в основном состоят из полисахаридов1,2,3. Биопленки представляет собой динамичный процесс, в котором каскад событий достигает кульминации в формировании зрелой адэрентных бактериальных сообщества1,2,3. Бактерии производят адгезины для облегчения начала вложения при переходе принимает ген выражение профили для укрепления вложений во время созревания биопленки. Одновременно производство EPS происходит пальто бактериальное сообщество в матрице защитить клетки от первоначального стресса. Бактерии, содержащиеся в биопленки растут медленно; и таким образом, сводит на нет большинство антибиотиков. Кроме того медленные темпы роста экономит энергию, пока изменения условий в пользу бактерий в1,2,3. После того, как прошло суровые условия, бактерии разогнать биопленки и возобновить планктона жизни1,2,3. Традиционно биоплёнки наблюдаются на поверхностях и представляют собой стойких клинических вызов из-за заражения водоемов на катетеры и в жилой устройства1,2,3.

Биопленки недавно описал несколько кишечных патогенов; бактерии, которые заражают тонкой кишки или кишечника4. Шигеллы видов, инфекции происходит в толстой кишке человека после транзитом через большинство из желудочно-кишечного тракта. Во время прохождения через кишечник шигеллы подвергается желчи; моющее средство унижающего достоинство липидов, секретируемых в кишечнике для облегчения переваривания липидов при одновременно убить большинство бактерий5. Кишечных патогенов имеет уникальную способность противостоять бактерицидный эффект желчь6. Наш недавний анализ используемых в естественных условиях-как комбинации глюкозы и желчных солей продемонстрировать надежную биопленки в S. Флекснера , а также других видов шигеллами, патогенных кишечной палочкии Сальмонелла4. Ранее, Salmonella enterica серовар Typhi было показано образуют желчь индуцированной биопленки благодаря уникальной колонизации желчного пузыря при хронической инфекции7,8,9, 10. Кроме того, предварительные исследования с Vibrio11и Campylobacter12 продемонстрировал биопленки в ответ желчи. Таким образом анализ продлил желчь индуцированной биопленки формирования замечания других патогенов и способствовать созданию демонстрации ответа сохраняется кишечных патогенов желчи. В отличие от хронической биопленки в котором транскрипции гена бактериальной ограничено и старение клеток может произойти1,2,3мы предлагаем, что кишечной биопленки желчь индуцированной более преходящими в природе. Это преходящее, вирулентным биопленки hallmarked по быстрой разборки (как видно в assay дисперсия) и повышение экспрессии генов вирулентности, наблюдается в биопленки населения4,6. 

Биопленки является многогранной, динамичный процесс и использование желчных солей как инициирующего фактора только была недавно описана для наиболее кишечных патогенов, инструменты и методы, используемые как уникальный и творческий применения традиционных методов. Таким образом здесь представлены три бесплатные стратегии для количественного определения нескольких важных характеристик желчные соли индуцированной биопленки, включая бактериальные присоединения, производство EPS матрицы и дисперсия жизнеспособных бактерий от биопленки. Эти методы были использованы главным образом для исследований с шигеллезом; и поэтому, оценки других кишечных патогенов могут требовать оптимизации. Тем не менее позитивные данные из всех трех анализов поддерживают идентификация биопленки и создать воспроизводимый протоколы для соли желчных индуцированной биопленки.

протокол

1. Подготовка реагентов Средний желчных солей: подготовить tryptic соевый бульон (БСЭ) содержит 0,4% желчных солей (вес/объем), Ресуспензируйте 200 мг солей желчи в 50 мл газобетона TSB. Фильтр стерилизовать, с помощью фильтра 0.22 мкм. Сделайте свежие среднего за неделю.Примечания: Желчных солей регулярно используется — 1:1 смесь холат натрия и Дезоксихолат натрия, изолированных от gallbladders баранину и говядину. Как показано ранее4, для соли желчных индуцированной биопленки требовалось наличие глюкозы. БСЭ добавил глюкозы относительно бульоне Лурия-Бертани (LB); и поэтому, было достаточно, чтобы побудить биопленки в Shigella и других кишечных патогенов проанализированы. В зависимости от бактерий, чтобы быть проанализированы концентрации различных глюкозы или сахара в различные требования могут быть необходимы. 0,5% w/v Фиолетовый Кристалл в воде: растворить 2,5 г Фиолетовый Кристалл в 500 мл дистиллированной воды. Фильтр стерилизовать, с помощью фильтра 0.22 мкм. Конканавалина А (Кона) конъюгированных флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC): восстановить запасы в однократном ПБС. Разбавить 10 мг сосредоточены акций с 400 мкл ПБС в конечной концентрации 25 мкг/мл и защищать от света. PBS + глюкоза: Растворить 0,2 г глюкозы в PBS 1 x 10 мл (2% w/v глюкозы окончательный). Фильтр стерилизовать, с помощью фильтра 0.22 мкм. Сделайте свежий в день использования. PBS + желчных солей: Растворить 40 мг в 10 мл ПБС (0,4% w/v желчных солей окончательный). Фильтр стерилизовать, с помощью фильтра 0.22 мкм. Сделайте свежий в день использования. PBS + глюкоза и желчных солей: растворить 40 мг желчных солей и глюкозы 0,2 г в 10 мл 1 x PBS (0,4% w/v желчных солей и 2% w/v глюкозы окончательный). Фильтр стерилизовать, с помощью фильтра 0.22 мкм. Сделайте свежий в день использования. Подготовьте плиты агара фунтов. Формальдегид/глютаральдегид исправить: добавить 810 мкл формальдегида (37% раствор, 3% конечной концентрации) и 125 мкл глутаровый (25% раствор, 0,25% конечная концентрация) до 14 мл ПБС. Тщательно перемешать и хранить при 4 ° C. Исправление должно быть холодным для надлежащего использования.Предупреждение: Исправление является токсичным и требует удаления опасных отходов. Antifade mountant решение: используйте antifade mountant раствор, содержащий 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) пятно для подавления Фотообесцвечивание immunofluorescent микроскопию образцов при дневно окрашивание ДНК бактерий. 2. Подготовка бактерий Растут на ночь культуры штаммов бактерий, чтобы быть проверена путем прививки 3 мл TSB с одного, хорошо изолированные колонии в стерильных культуры трубки. Инкубируйте при 37 ° C при встряхивании в 225 rpm для инкубации ночи (16-24 ч).Примечание: Штаммов должно быть restreaked из морозильника запасов каждые 2 до 4 недель и поддерживается на пластины не более 2 недель. 3. твердофазный присоединение Assay Примечание: Этот assay количественно адэрентных бактерий с помощью метода 96-луночных пластины. Бактерии выращивают статически в плоское дно тарелки. Стиральная выполняется, чтобы удалить бактерии, не сторонник и сторонником бактерии запятнаны с Фиолетовый Кристалл. Фиолетовый Кристалл пятно связывает мукопептида клеточной стенки бактерий и может быть солюбилизирован с помощью этанола. Количество бактерий, сторонником определяется на основании Фиолетовый Кристалл удержания. Созданы две 1,5 мл пробирок. Этикетка с БСЭ или TSB + желчных солей (BS). Добавьте 1 mL TSB или TSB + BS в соответствующих труб. Прививать трубы с 20 мкл ночь культуры (в 1:50 разрежения). В стерильные, ясно, плоскодонные, культуры тканей лечение 96-луночных тарелку добавьте 130 мкл/хорошо uninoculated управления СМИ трех скважин в качестве пустой элемент управления. Созданы три контроля скважин для каждого типа носителя (TSB и БСЭ + BS) для проверки. Добавьте 130 мкл/хорошо привитых культуры в три скважины и повторять до тех пор, пока все экспериментальные условия покрыты в трех экземплярах. Проинкубируйте 4-24 ч при 37 ° C статически. С помощью пластины читатель, рекорд ОД600. Установка контроля скважин как «пустой». Подтвердите, что средство управления ясно с никаких признаков замутненности. При обнаружении любых мутность, отбросить эксперимент. ОД600 значения может использоваться для нормализации данных, если имеются существенные различия между бактериальных штаммов темпов роста. Удалите носитель культуры, с помощью разрежением, слегка наклоняя тарелку и медленно аспирационных среднего по нижнему краю колодца. Не забудьте собрать все питательной среды без нарушения адэрентных бактериальная популяция, расположенные на поверхности пластика. Если матрица EPS был выпущен во время инкубации, матрица будет визуализирована как Белый преципитат. Не беспокоить EPS матрицы. Осторожно промойте лунки с 200 мкл стерильные PBS. Удаление PBS мыть с помощью вакуумной магистрали. Инвертируйте пластину для просушки. Разрешить минимум 20 мин для просушки.Примечание: Поскольку биопленки необходимо тщательно просушить до окрашивания, протокол может быть приостановлена на этот шаг на несколько часов или даже на ночь. Добавлено время сушки не изменит пятная процедуру, пока неполная сушка повлияет количественной оценки результатов и воспроизводимость. Добавьте 150 мкл Фиолетовый Кристалл 0,5% для каждой экспериментальной и управления хорошо. Инкубируйте 5 мин при комнатной температуре (RT). Промойте лунки с 400 мкл дистиллированной воды. Добавлено объем помогает для удаления остаточного Фиолетовый Кристалл пятно от сторон скважин. Удаление мыть с вакуумной линией. Промойте лунки пять раз с 200 мкл дистиллированной воды. Удаление мыть с вакуумной линией.Примечание: Тщательного мытья имеет важное значение для количественной оценки. Когда пустой колодцы из дистиллированной воды и не содержат каких-либо остаточных Фиолетовый Кристалл пятно, переходите к следующему шагу. Инвертируйте пластину в сухом, защищенном от света. Обеспечение полного высыхания плиты, как указано выше. Отмойте скважин с 200 мкл 95% этиловом спирте. Инкубируйте пластину на шейкер для 30 мин. Чтобы избежать испарения, особенно при высоких температурах, выполните этот шаг на 4 ° C. С помощью пластины читатель, рекорд ОД540.Примечание: Волны максимального поглощения Фиолетовый Кристалл находится вблизи 590 нм. Литературе сообщает о диапазоне от ОД540 – ОД5954,13,14,,1516 для поглощения Фиолетовый Кристалл; Таким образом выберите волны имеющихся основанных на пластине читателя. 4. EPS матрица обнаружение Примечание: Эти бесплатные анализы количественно и визуализировать EPS. В обоих EPS обнаруживается с помощью Лектин для привязки полисахаридов. Дневно конъюгированных белка позволяет количественной (шаг 4.1) или визуализации (шаг 4.2). Полуколичественного определения EPS Созданы две 1,5 мл пробирок. Этикетка с БСЭ или TSB + BS. Добавьте 1 mL TSB или TSB + BS в соответствующих труб. Прививать трубы с 20 мкл ночь культуры (1:50 разрежения). В стерильные, черный, плоскодонные, культуры тканей лечение 96-луночных тарелку добавьте 130 мкл/хорошо uninoculated управления СМИ трех скважин в качестве пустой элемент управления. Созданы три контроля скважин для каждого типа носителя для проверки. Добавить 130 мкл/хорошо привитых культуры к скважинам и повторять, пока все экспериментальные условия покрыты в трех экземплярах. Проинкубируйте 4-24 ч при 37 ° C статически. Передать ясно 96-луночных плита с пипеткой, в идеале многоканальные пипетки питательной среды. Будьте осторожны, чтобы собрать все питательной среды без нарушения адэрентных населения и/или EPS, расположенный на поверхности пластика. Отложите в сторону. Черный пластина для 15 мин на RT, используя 200 мкл/колодец глютаральдегид формальдегида в ПБС. Хотя фиксация адэрентных населения, оцените супернатанта фракция от шага 4.1.6. С помощью пластины читатель, рекорд ОД600. Установка контроля скважин как «пустой». Подтвердите, что средство управления ясно с никаких признаков замутненности. При обнаружении любых мутность, отбросить эксперимент. Кроме того весь assay может выполняться в черный четких днище. В этих обстоятельствах ОД600 значения могут быть записаны и питательной среды, может быть впоследствии удален перед шаг 4.1.7. OD600 значения могут использоваться для нормализации данных в случае существуют значительные различия между бактериальных штаммов темпов роста. Удаление исправления и удаления опасных отходов. Осторожно промойте лунки дважды с 200 мкл/хорошо стерильных PBS. Удалите в PBS стирку с помощью вакуумной магистрали, слегка наклоняя тарелку и медленно аспирационных мыть на нижнем краю колодца. Добавить 150 мкл/хорошо 25 мкг/мл ConA FITC и Инкубируйте 15 мин на RT. Осторожно промойте дважды с 200 мкл PBS. Добавьте 150 мкл PBS в каждой скважине. Запись флуоресценции в 488 нм. Конфокальная микроскопия визуализация производства EPS и расчета толщины биопленки Созданы две 1,5 мл пробирок. Этикетка с БСЭ или TSB + BS. Добавьте 1 mL TSB или TSB + BS в соответствующих труб. Прививать трубы с 20 мкл ночь культуры (в 1:50 разрежения). Настройка стерильные 24-ну плита с 12 мм стерильные круглые стекло coverslips. Добавьте 400 мкл/хорошо uninoculated управления СМИ трех скважин в качестве пустой элемент управления. Созданы три контроля скважин для каждого типа носителя для проверки. 400 мкл привитых культуры для скважин в двух экземплярах и повторять, пока покрытием всех экспериментальных условиях. Проинкубируйте 4-24 ч при 37 ° C статически. Визуально подтверждают рост в состоянии TSB, роста и EPS преципитат (белый) в БСЭ + BS условие и не роста и/или белый осадок в стерильных контроля скважин. Удаление supernatants. Исправление для 15 мин на RT, используя 200 мкл/хорошо раствора формальдегида/глютаральдегид в ПБС. Удаление исправления и удаления опасных отходов. Осторожно промойте лунки дважды с 200 мкл/хорошо стерильных PBS. Удаление PBS мыть с помощью вакуумной магистрали. Добавить 150 мкл/хорошо 25 мкг/мл ConA FITC и Инкубируйте 15 мин на RT. Осторожно промойте дважды с 200 мкл/хорошо PBS. Крепление с antifade mountant раствор с DAPI.Примечание: Решение является готовых, на основе глицерина горе раствор, содержащий DAPI для сохранения флуоресцентные метки при одновременно окрашивание ДНК в бактериальных клетках для визуализации как изображение. Следуйте комплект направления и рекомендации для инкубации раз до изображений образцов. DAPI пятнать процедура может выполняться до применения antifade mountant решение, которое не содержит DAPI. Оцените, confocal микроскопии. На конфокального микроскопа Установите лазер 495 нм/519 Нм возбуждения/выбросов для визуализации FITC. Установите второй лазер 360 Нм/460 Нм возбуждения/выбросов для визуализации DAPI. Найдите биопленки, сосредоточив внимание на канале DAPI. Использование FITC и DAPI каналов для определения полной толщины и задать верхний и нижний изображений границ. Запись полная толщина Z-стек изображений путем захвата изображения каждые 0,25 мкм после установки периметров для верхней и нижней части z стека. Для больше информации на confocal микроскопии пожалуйста, обратитесь к публикации в паддоке и др. 17 , 18 , 19 , 20 Реконструировать 3D изображения в ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) для визуализации полный биопленки и рассчитать толщину биопленки. Средняя толщина получены для S. Флекснера желчь соль индуцированных биопленок было 14 мкм4. 5. дисперсия Assay Примечание: В этот assay, обнаружен Разборка биопленки через бактериальный дисперсии. Здесь Зрелые биоплёнки устанавливаются и впоследствии (обычно на следующий день), средства массовой информации будут заменены PBS или дополнены PBS. Затем компонент супернатанта оценивается чтобы quantitate количество бактерий, которые отделены от биопленки. Созданы две 1,5 мл пробирок. Этикетка с БСЭ или TSB + BS. Добавьте 1 mL TSB или TSB + BS в соответствующих труб. Прививать трубы с 20 мкл ночь культуры (в 1:50 разрежения). В стерильные, ясно, плоскодонные, культуры тканей лечение 96-луночных тарелку добавьте 130 мкл/хорошо uninoculated управления СМИ трех скважин в качестве пустой элемент управления. Созданы три контроля скважин для каждого типа носителя быть проверены. Добавить 130 мкл/хорошо привитых культуры в трех скважин и повторять, пока все экспериментальные условия покрыты в трех экземплярах. Инкубируйте пластину для 4-24 ч при 37 ° C статически. Прежде чем продолжить, теплый PBS, PBS + глюкоза, PBS желчных солей и PBS + желчных солей + глюкозы до 37 ° C. Подготовьте эти реагенты свежий ежедневно. С помощью пластины читатель, рекорд ОД600. Установка контроля скважин как «пустой». Убедитесь, что носитель ясно с никаких признаков замутненности. При обнаружении любых мутность, отбросить эксперимент. ОД600 значения может использоваться для нормализации данных, если имеются существенные различия между бактериальных штаммов темпов роста. Удалите носитель культуры, с помощью вакуумной линии. Не забудьте собрать все питательной среды без нарушения адэрентных населения, расположенных на поверхности пластика. Осторожно промойте лунки дважды с 200 мкл/хорошо стерильных PBS. Удаление PBS мыть с помощью вакуумной магистрали. Заменить мыть с 130 мкл/хорошо следующее в три скважины: PBS, PBS + глюкоза, PBS желчных солей и PBS + желчных солей + глюкоза. Эти реагенты должен быть подогретым до 37 ° C. Инкубировать пластину для 30 минут при 37 ° C. Осторожно снимите пластину из инкубатора 37 ° C. Передать supernatants свежий, стерильные 96-луночных плиты. Используя блок плиты или разбавления 96-луночных, подготовить 10 (1:10) серийных разведений супернатант в стерильных PBS.Примечание: Серии разрежения должен варьируются от неразбавленном 10-6 в зависимости от бактериального штамма для проверки. Экспериментальный эксперименты можно определить оптимальное разведение диапазон. Пятно плита 5 мкл каждого разведения на LB агар с помощью многоканальных дозаторов. Инкубируйте при 37 ° C на ночь. Граф колоний на следующий день и счета для коэффициент разбавления, при определении восстановления колонии, образуя единиц (CFU). Чтобы вычислить процент дисперсии относительно 1 x PBS Управление (устанавливается на 100%), делят восстановления кое от каждого условия лечения, восстановления кое от образца управления PBS 1 x.Примечание: Обычные СМИ пластины для бактериальный штамм интерес может также использоваться. Например шигеллы могут покрытием на Конго красный пластин. Убедитесь, что пластины сухой для соответствующих методов спот обшивка.

Representative Results

На рисунке 1биопленки индуцируется в большинстве проверенных следующие роста шести кишечных патогенов в средствах массовой информации, содержащие желчных солей. Значительное увеличение адэрентных бактерий после воздействия желчных солей наблюдает?…

Discussion

Анализ биопленки является сложной задачей вследствие динамичного характера биопленки и изменчивость между штаммами, материалы, лабораторий и анализов. Здесь представлены несколько стратегий для определения биопленки в кишечных патогенов, после облучения желчных солей с эксперимент…

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Rachael B. Chanin и Алехандро Льянос-Чеа для оказания технической помощи. Мы благодарим Энтони т. Maurelli, Брайан P. Херли, Алессио Fasano, Бретт э. Swierczewski и Бобби Cherayil штаммов, используемые в данном исследовании. Эта работа была поддержана национального института аллергии и инфекционных заболеваний Грант K22AI104755 (РППО). Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья.

Materials

Tryptic Soy Broth Sigma-Aldrich  22092-500G
Crystal Violet Sigma C6158-50
Concanavalin-A FITC Sigma C7642-10mg
Glucose Sigma G7021-1KG
Bile Salts Sigma B8756-100G 
LB Agar Sigma L7533-1KG
14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile Fisher 14-959-11B
Vectashield hard-set antifade with DAPI Vector Laboratories H-1500 
Formaldehyde Sigma-Aldrich  F1635-500
Gluteraldehyde Sigma-Aldrich  G6257
Flat-bottomed 96-well plates (clear) TPP 92696
Flat-bottomed 96-well plates (black) Greiner Bio-One  655076
Flat-bottomed 24-well plates (clear) TPP 92424
Glass coverslips 12mm, round Fisher 08-774-383
96-well plate reader Spectramax
Flourescent plate reader Biotek Synergy 2
Confocal or Fluorescent Microscope Nikon A1 confocal microscope
37°C Shaking Incubator New Brunswick Scientific Excella E25
37°C Plate Incubator Thermolyne Series 5000
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Ссылки

  1. Joo, H. -. S. S., Otto, M. Molecular basis of in vivo biofilm formation by bacterial pathogens. Chem Biol. 19 (12), 1503-1513 (2012).
  2. O’Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm Formation as Microbial Development. Annu Rev Microbiol. 54 (1), 49-79 (2000).
  3. Donlan, R. M. Biofilm Formation: A Clinically Relevant Microbiological Process. Clin Infect Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
  4. Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), (2017).
  5. Ridlon, J. M., Kang, D. -. J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
  6. Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), (2016).
  7. Prouty, A. M., Schwesinger, W. H., Gunn, J. S. Biofilm formation and interaction with the surfaces of gallstones by Salmonella spp. Infect Immun. 70 (5), 2640-2649 (2002).
  8. Crawford, R. W., Gibson, D. L., Kay, W. W., Gunn, J. S. Identification of a bile-induced exopolysaccharide required for Salmonella biofilm formation on gallstone surfaces. Infect Immun. 76 (11), 5341-5349 (2008).
  9. Crawford, R. W., Reeve, K. E., Gunn, J. S. Flagellated but not hyperfimbriated Salmonella enterica serovar Typhimurium attaches to and forms biofilms on cholesterol-coated surfaces. J Bacteriol. 192 (12), 2981-2990 (2010).
  10. Crawford, R. W., Rosales-Reyes, R., Ramírez-Aguilar, M. d. e. l. a. L., Chapa-Azuela, O., Alpuche-Aranda, C., Gunn, J. S. Gallstones play a significant role in Salmonella spp. gallbladder colonization and carriage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4353-4358 (2010).
  11. Koestler, B. J., Waters, C. M. Bile acids and bicarbonate inversely regulate intracellular cyclic di-GMP in Vibrio cholerae. Infect Immun. 82 (7), 3002-3014 (2014).
  12. Svensson, S. L., Pryjma, M., Gaynor, E. C. Flagella-mediated adhesion and extracellular DNA release contribute to biofilm formation and stress tolerance of Campylobacter jejuni. PLoS One. 9 (8), e106063 (2014).
  13. Martinez-Medina, M., et al. Biofilm formation as a novel phenotypic feature of adherent-invasive Escherichia coli (AIEC). BMC Microbiol. 9 (1), 202 (2009).
  14. Naves, P., et al. Measurement of biofilm formation by clinical isolates of Escherichia coli is method-dependent. J Appl Microbiol. 105 (2), 585-590 (2008).
  15. Danese, P. N., Pratt, L. A., Dove, S. L., Kolter, R. The outer membrane protein, Antigen 43, mediates cell-to-cell interactions within Escherichia coli biofilms. Mol Microbiol. 37 (2), 424-432 (2000).
  16. Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn’s disease-associated adherent-invasive Escherichia coli adhesion is enhanced by exposure to the ubiquitous dietary polysaccharide maltodextrin. PLoS One. 7 (12), e52132 (2012).
  17. Paddock, S. W. Confocal laser scanning microscopy. Biotechniques. 27 (5), (1999).
  18. Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16 (2), 127-149 (2000).
  19. Paddock, S. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging. Biotechniques. 44 (5), (2008).
  20. Paddock, S. W., Eliceiri, K. W. Laser scanning confocal microscopy: history, applications, and related optical sectioning techniques. Methods Mol Biol. 1075, 9-47 (2014).
  21. Nataro, J. P., Steiner, T., Guerrant, R. L. Enteroaggregative Escherichia coli. Emerg Infect Dis. 4 (2), 251-261 (1998).
  22. Nesper, J., Lauriano, C. M., Klose, K. E., Kapfhammer, D., Kraiss, A., Reidl, J. Characterization of Vibrio cholerae O1 El tor galU and galE mutants: influence on lipopolysaccharide structure, colonization, and biofilm formation. Infect Immun. 69 (1), 435-445 (2001).
  23. Hadjifrangiskou, M., et al. Transposon mutagenesis identifies uropathogenic Escherichia coli biofilm factors. J Bacteriol. 194 (22), 6195-6205 (2012).
  24. Rahimpour, M., et al. GlgS, described previously as a glycogen synthesis control protein, negatively regulates motility and biofilm formation in Escherichia coli. Biochem J. 452 (3), 559-573 (2013).
  25. Sharma, V. K., Kudva, I. T., Bearson, B. L., Stasko, J. A. Contributions of EspA Filaments and Curli Fimbriae in Cellular Adherence and Biofilm Formation of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. PLoS One. 11 (2), e0149745 (2016).
  26. Keto-Timonen, R., Hietala, N., Palonen, E., Hakakorpi, A., Lindström, M., Korkeala, H. Cold Shock Proteins: A Minireview with Special Emphasis on Csp-family of Enteropathogenic Yersinia. Front Microbiol. 7, 1151 (2016).
  27. Pöntinen, A., Markkula, A., Lindström, M., Korkeala, H. Two-Component-System Histidine Kinases Involved in Growth of Listeria monocytogenes EGD-e at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 81 (12), 3994-4004 (2015).
  28. Regeard, C., Mérieau, A., Guespin-Michel, J. F. A bioluminescence assay for screening thermoregulated genes in a psychrotrophic bacterium Pseudomonas fluorescens. J Appl Microbiol. 88 (1), 183-189 (2000).
  29. Markkula, A., Mattila, M., Lindström, M., Korkeala, H. Genes encoding putative DEAD-box RNA helicases in Listeria monocytogenes EGD-e are needed for growth and motility at 3°C. Environ Microbiol. 14 (8), 2223-2232 (2012).
  30. Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror “real-world” pathogenesis?. Trends Microbiol. 13 (2), 58-63 (2005).
  31. Takai, S., Sekizaki, T., Ozawa, T., Sugawara, T., Watanabe, Y., Tsubaki, S. Association between a large plasmid and 15- to 17-kilodalton antigens in virulent Rhodococcus equi. Infect Immun. 59 (11), 4056-4060 (1991).
  32. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
  33. Kopecko, D. J., Washington, O., Formal, S. B. Genetic and physical evidence for plasmid control of Shigella sonnei form I cell surface antigen. Infect Immun. 29 (1), 207-214 (1980).
  34. Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
  35. Kobayashi, H., Oethinger, M., Tuohy, M. J., Procop, G. W., Bauer, T. W. Improved detection of biofilm-formative bacteria by vortexing and sonication: a pilot study. Clin Orthop Relat Res. 467 (5), 1360-1364 (2009).
  36. de Oliveira Ferreira, T., et al. Microbial investigation of biofilms recovered from endotracheal tubes using sonication in intensive care unit pediatric patients. Braz J Infect Dis. 20 (5), 468-475 (2016).
  37. Petruzzi, B., Briggs, R. E., Swords, W. E., De Castro, C., Molinaro, A., Inzana, T. J. Capsular Polysaccharide Interferes with Biofilm Formation by Pasteurella multocida Serogroup A. MBio. 8 (6), e01843-e01817 (2017).
  38. Payne, D. E., Boles, B. R. Emerging interactions between matrix components during biofilm development. Curr Genet. 62 (1), 137-141 (2016).
  39. Huang, R., Li, M., Gregory, R. L. Bacterial interactions in dental biofilm. Virulence. 2 (5), 435-444 (2011).
  40. Buswell, C. M., Nicholl, H. S., Walker, J. T. Use of continuous culture bioreactors for the study of pathogens such as Campylobacter jejuni and Escherichia coli O157 in biofilms. Methods Enzymol. 337, 70-78 (2001).
  41. McBain, A. J. Chapter 4 In Vitro Biofilm Models. Adv Appl Microbiol. 69, 99-132 (2009).
  42. Schiefer, H. G., Krauss, H., Brunner, H., Gerhardt, U. Ultrastructural visualization of surface carbohydrate structures on mycoplasma membranes by concanavalin A. J Bacteriol. 124 (3), 1598-1600 (1975).
  43. Liener, I. . The Lectins: Properties, Functions and Applications in Biology and Medicine. , (1986).
  44. Wittmann, V., Pieters, R. J. Bridging lectin binding sites by multivalent carbohydrates. Chem Soc Rev. 42 (10), 4492-4503 (2013).
  45. Wang, S., et al. The exopolysaccharide Psl-eDNA interaction enables the formation of a biofilm skeleton in Pseudomonas aeruginosa. Environ Microbiol Rep. 7 (2), 330-340 (2015).
  46. Okshevsky, M., Meyer, R. L. The role of extracellular DNA in the establishment, maintenance and perpetuation of bacterial biofilms. Crit Rev Microbiol. 41 (3), 341-352 (2015).
  47. Xu, D., Zhang, W., Zhang, B., Liao, C., Shao, Y. Characterization of a biofilm-forming Shigella flexneri phenotype due to deficiency in Hep biosynthesis. PeerJ. 4, e2178 (2016).
  48. O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J Vis Exp. (47), (2011).
  49. Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn’s Disease-Associated Adherent-Invasive Escherichia coli Adhesion Is Enhanced by Exposure to the Ubiquitous Dietary Polysaccharide Maltodextrin. PLoS One. 7 (12), (2012).

Теги

Bile SaltsBiofilm FormationEnteric PathogensBacterial PathogenesisShigella FlexneriCrystal Violet AssayQuantification96-well PlateStatic IncubationPBS Washing

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Nickerson, K. P., Faherty, C. S. Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification. J. Vis. Exp. (135), e57322, doi:10.3791/57322 (2018).
Загрузить цитату
Перепечатки и разрешения

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image