Optogenetic ГРЭС гиппокампа тета колебаний в себя мышей

Активность нейронов в млекопитающих координируется колебаний сети, которые помогают передачи информации внутри и между мозга регионах^1,2,3,4. Ритмов мозга включают колебания, начиная от очень медленно (< 0,8 Гц) до сверхскоростной частоты (> 200 Гц). Большой объем доказательств поддерживает участие колебаний сети в различных мозговых функций, включая познания^5,6,,78,9,10 , врожденное поведение^11,12 , а также нервно-психических расстройств, таких как болезнь Паркинсона и эпилепсии^13,14,15. Селективный и височно точные методы для экспериментальных манипуляций колебаний сети поэтому важное значение для разработки физиологически вероятных моделей синхронизации и установления причинно-следственных связей с поведением.

Сети синхронизации при посредничестве различных биологических субстратов и процессов, начиная от молекулярных личность ионных каналов и их кинетики neuromodulation возбудимости и подключения к сети. Биологических дизайн ритм, генераторы, которые показали¹⁶ для многих ритмов мозга, различные аспекты которых (например, частота, амплитуда), часто в результате динамика типов различных клеток и сетей. Например тормозящий интернейронов ориентации somata главных клеток являются наиболее важных игроков разных частотных полос и мозга регионов^17,18, включая тета^19,20, гамма^{20 , 21}и²² колебания пульсации (140-200 Гц). В свою очередь этап синхронизации далеких клеток обеспечивается надежный канал вперед сигнализации пирамидальных клеток, который сбрасывает стрельбы интернейронов. Важнейших параметров колебаний, численность населения синхронизированных нейронов, тесно связана с измеренной LFP колебания амплитуды и, по крайней мере для быстрых колебаний, зависит от возбуждающих езды на интернейронов². В отличие от медленных колебаний, как Дельта и тета ритмов, генерируются дальнего реентерабельной петли, образованный²⁴ cortico таламуса^23,и гиппокампа медиальной межжелудочковой перегородки прогнозы^{25, 26,27}, соответственно. Колебания в таких цепях обусловлены взаимодействием задержки распространения сигналов, возбудимые ответов и их частота предпочтения в участвующих клетки^{28,,2930, 31 , 32}. тормозящий проекции от Парвальбумин ГАМК (PV)-позитивных клеток медиальной перегородки (МС) для интернейронов в гиппокампе^25,33, парагиппокампальной регионам и entorhinal кора²⁶ важное значение для генерации колебаний тета в медиальной височной доли. Таким образом физиологические механизмы колебаний сети и нейронные синхронизации можно манипулировать с помощью Оптогенетика с точностью, в реальном времени.

Клетки optogenetic конкретного типа манипуляции были применены для изучения гиппокампа и корковые колебания в vitro^{34,35,36,,3738} и в естественных условиях^{30,39,40,41,42,,4344,45}, включая функциональные исследования гамма^{5,12,,3646,47,48,49,50, 51,52} и пульсации колебания^40,,5354 и сна шпинделей^55,56. Недавно мы выразили Cre зависимой ChR2 вирус в MS, ключевым регионом для поколения гиппокампа тета-ритма, PV-Cre мышей. С помощью этого препарата, особенностей колебаний гиппокампа тета (частоты и временных стабильности) контролируется optogenetic стимуляции тормозящий проекции MS в гиппокампе¹¹. Кроме того тета частота optogenetic стимуляции ингибирующее септо гиппокампа прогнозов вызывали Тета-ритм во время бодрствования неподвижности. Optogenetically увлекаемого Тета-ритм отображаются свойства самопроизвольно тета колебаний в мыши LFP и активности нейронов уровнях.

Ключевые особенности настоящего Протокола включают в себя: (1) использование тормозной путь, который физиологически важных для спонтанного тета колебания избегая неспецифические эффекты на гиппокампа возбудимости; (2) аксональное, то есть, проекции конкретных стимуляции для сведения к минимуму непосредственное влияние на не гиппокампа MS эфферентов; (3) местные тета художественной легкой стимуляции, обеспечивая минимальное прямое вмешательство с тета художественной септо гиппокампа динамика и глобальные двусторонние волн тета колебаний; (4) параметрический контроль тета колебания частотой и регулярностью; и (5) количественная оценка верности нейроволновой синхронизации с высоким временным разрешением, используя LFP для включения анализа количественных причинно-следственных связей в поведение животных. Так как этот препарат по существу капитализирует на известные роли септо гиппокампа растормаживания в тета поколения^25,30, он позволяет надежный контроль над несколько параметров колебаний тета в себя мышей. Исследования, где другие менее исследованы пути и типы клеток септо гиппокампа схемы были манипулировать^{38,,3947,49,50,51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58} выявить дальнейшие механизмы тета-ритма.

PV-Cre забивные мышей-самцов⁵⁹, 10-25 недель, были использованы. Мышей были размещены в стандартных условиях в объекте животных и хранится на цикле свет/темно 12 h. Все процедуры были исполнены в соответствии с национальными и международными руководящими принципами и были одобрены местными органами здравоохранения (Umwelt und Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen für натур, шведским).

1. вирусные инъекций

1. В течение всей процедуры выполните биологической безопасности руководящие принципы⁶⁰. Носите пальто лаборатории, хирургические маски, сетка для волос и две пары перчаток.
2. Вырезать трубки с стерильным скальпель или ножницы длиной около 1 м, вставить его в шприц держатель блока насоса и исправить ее.
   1. Заполните трубы полностью с силиконовым маслом с помощью шприца.
   2. Проверьте, отображаются ли пузырьков воздуха в трубке. Если наблюдаются пузырьки воздуха, снова пополните труб с маслом.
   3. Исправьте поршень в блок толкателя.
   4. Медленно заранее толкателя сторону шприца держатель блока до тех пор, пока кончик поршень затрагивает труб.
   5. Вставьте наконечник поршень в трубку и автоматически переместить блок толкателя вперед на медленной скорости, выбрав «Infuse» в окне команд и низкой инфузия ставки (например, 500 нл/мин), до тех пор, пока он достигнет шприц держатель блока.
3. Приготовьте иглу (34G).
   1. Снять ступицу иглы с четкого, используя точность дрель/дробилка подключен к режущего диска. При необходимости, используйте иглы для удаления металлических остатков из свежесрезанных поверхности.
   2. Нить капиллярной трубки (3-4 см длиной) через иглу.
   3. Клей к трубки иглы с супер клей.
   4. Подключение инъекционной иглы к концу трубы, которая соединяет microsyringe насоса.
4. Прикрепите иглы для стереотаксического держателя.
5. Снять воздуха, пока не станет видна пузырек воздуха в прозрачной трубке над иглой.
6. Анестезировать мыши с изофлюрановая 1,5-3% кислорода. Подождите примерно 2-3 мин, затем убедитесь, что мышь полностью наркозом путем оценки ее ответ на щепотку мыс. На протяжении операции контролировать дыхание животного и настроить изофлюрановая концентрации, если требуется.
7. Поместите курсор мыши в стереотаксической фрейм с помощью держателей не травматической уха.
8. Защитите глаза мыши с гель липидов.
9. Придать 0,1 мл лидокаина intradermally под кожу головы, с использованием 0,01-1 мл шприц и канюли инъекции 26G.
10. Бритье и лечить голову мыши с помощью этанола раствор. Затем поочередно три раза 2% хлоргексидин с этанолом для дезинфекции хирургических сайта.
11. Выполните срединной линии разреза с помощью тонкой и острые ножницы, идя от задней части ушей на уровень глаз так, что видны bregma и лямбда.
12. Очистить черепа, применяя приблизительно 50 мкл рабочего раствора NaCl с помощью шприца и насухо салфеткой и слоеного воздуха.
13. Положение мыши головы, регулируя уровень dorso вентральной нос зажим, так что bregma и лямбда находятся на одном уровне dorso вентральной (± 0,3 мм).
14. Просверлите отверстие выше MS (AP 0,98 и L 0,5 мм со ссылкой на bregma).
15. На данный момент размораживание Алиготе вируса (должен содержать по крайней мере 2 мкл AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato.WPRESV40) примерно в 5 минут при комнатной температуре (RT).
16. Центрифуга Алиготе на примерно 4000 x g в РТ за 1 мин.
17. Пипетка 2 мкл вируса на кусок парафина; Используйте ранее защищенных сторону.
18. Погрузите кончик иглу в жидкость и тщательно снять около 500 нл/мин при соблюдении уровня жидкости. Во избежание аспирации воздуха, остановить вывод, прежде чем вирус полностью рассмотрен. Отрегулировать снять ставки в зависимости от вязкости раствора; более быстрыми темпами может облегчить выход вируса с высокой вязкостью.
19. Экологически чистые иглы бумажной салфеткой.
20. Проверьте, что вирус содержится в трубку и вирус и масла разделены пузырек воздуха. Пометьте уровень вируса на трубе, чтобы контролировать ли вирус успешно проникнуты во время инъекции.
21. Положение иглы выше краниотомии и медленно вставьте его в мозг в первой точке впрыска (AP 0,98, L 0.5, V-5.2, 5,5 ° боковых).
22. Придать 450 nL вируса в размере 100-150 нл/мин ждать 10 минут тщательно перемещения иглы до 0,1 мм и ждать еще 5 мин.
    1. Перемещение иглы на второй точки инъекции (AP 0,98, L 0.5, V-4.6) и придать еще 450 nL в 100-150 нл/мин.
    2. Снова ждать 10 минут перед перемещением иглы 0,1 мм вверх. Подождите еще 5 мин перед удалением иглы.
23. Шов надрез с Шелковый черный плетеный шва с помощью площади knots. Теплый животное с красная лампа для ускорения восстановления. Применять антибиотики (0,3 мл Erycinum (1:4 в стерильных NaCl)) и carprofen и.п. ежедневно 2-3 дня после операции.
24. Вырежьте трубки выше отметки, что уровень вируса. Трубка может использоваться для дальнейшего инъекции. Подготовьте свежие инъекционной иглы перед каждой инъекцией.
    Примечание: Эта операция занимает около 1-1,5 ч. Животное просыпается обычно в течение 5 мин после операции. Подождите как минимум времени 6 недель для достаточно аксональное выражение, но не более чем 5 месяцев перед выполнением стереотаксической имплантации, как уровни выражения начинают уменьшаться примерно через 6 месяцев после инъекции вируса.

2. Подготовка оптических волокон (рис. 1A)

1. Использования многомодового оптоволокна (105 мкм ядро, стекло, одетой с ядром кремнезем, 0.22 NA). Полосы 125 мкм обшивки волокна ядра с помощью микро зачистки в то время как волокно еще привязаны к волокна золотника.
2. Отрежьте волокно длиной примерно 2-3 см, с использованием алмазный нож.
3. Вставить волокна в обойма керамические ручки циркония (ID: 126 мкм). Примерно 0,5-1 мм оптического волокна должны выступать с выпуклой стороны обойма.
4. С помощью иглы, нанесите одну каплю эпоксидной клея на обоих концах обойма, но не по бокам обойма. Кроме того используйте супер клей.
5. Разрешить клей для просушки минимум 30 мин.
6. Польский выпуклой стороне обойма с использованием алмазов, доводка волокна полировки фильм (крупы 3 мкм).
7. Проверка верности передачи света, используя Измеритель оптической мощности.
   1. Установка длины волны на измеритель мощности на одной волне как лазер.
   2. Установите патч-корд с кончиком, с которыми сталкивается Центр датчика. Включите лазер и считывать измеритель мощности светового потока. Запишите значение.
   3. Подключите оптический патч-корд через соединительный рукав и расположите его с кончика волокна, с которыми сталкивается Центр датчика. Включите лазер и считывать измеритель мощности светового потока. Запишите значение.
   4. Вычислить скорость передачи: разделить второе значение первое значение. Если скорость передачи ниже 0.5, удалить волокна, в противном случае использовать его для имплантации.
   5. Протестируйте скорость передачи для каждого волокна до имплантации.
   6. Для более поздних экспериментах, настроить выход интенсивности света лазера на скорость передачи оптического волокна: значение светового потока от кончика патч-корд 5-15, деленное на скорость передачи для достижения окончательного светоотдачи от кончика волокно 5-15 МВт.
      Примечание: Также смотрите ⁶¹ ссылка для подготовки оптических волокон.

3. Подготовка Вольфрамные проволоки массивов для LFP записи (рис. 1B)

1. Приклейте несколько (например 6) 100 мкм кремний трубки направляющие параллельно на липкой стороне кусок ленты. Вырежьте один кусок, примерно 4-6 мм, для Ассамблеи массив одного провода.
2. Резьба formvar изолированные 45 мкм вольфрама провода через трубы руководство, с помощью щипцов.
3. Газа шесть эмаль изоляцией Медь рафинированная склеивания с помощью скальпеля, чтобы отчищать изоляции на обоих концах провода (около 5 мм) и провод заземления (примерно 2-3 см длиной). Паять их к штифтам nanoconnector.
4. Подключите каждый провод склеивание к одной Вольфрамные проволоки, используя одну каплю Проводящая серебряная краска, соответственно. Пусть сухой для по крайней мере 30 минут.
5. Применять минимальное количество цемента для покрытия проводов. Не применять цемент на провода вольфрама, которые будут вставлены в ткани мозга или на верхней части nanoconnector. Пусть Цемент сухой для по крайней мере 30 минут.
6. Выполнить угловые разреза (5-20°) провода вольфрама, включение надежных имплантации проводов ниже или выше зоны вентрально прилегающих к pyramidale слой, где амплитуда тета является слишком низким для оценки с помощью тупыми ножницами из нержавеющей стали нейроволновой синхронизации верности.
7. Deinsulate наконечник (примерно 2 мм) из заземляющий провод отчищать изоляции с помощью скальпеля. Относиться к нему с потока и presolder.
8. Проверка потенциальных кросс переговоры между электродами с помощью цифровой мультиметр. Чтобы сделать это, подключите контактов разъема к мультиметр, который должен быть установлен в режим измерения сопротивления. Проверьте парного сочетаний каналов; чтение на мультиметр ниже 5 MΩ показывает значительное кросс talk.
9. Проверьте сопротивление каждого провода электрода в солевой используя Измеритель импеданса. Типичный импеданс значения находятся ниже 100 kΩ.
10. Чтобы облегчить имплантацию, клей один оптоволоконного провода массив так, что кончик волокна на уровне короткий провод и кончик волокна находится в непосредственной близости, но не касаясь провода вольфрама. Храните угол волокна как можно меньше для того, чтобы предотвратить повреждение тканей во время имплантации.
    Примечание: См. также ⁶² ссылка для изготовления Вольфрам проволока массивов.

4. Стереотаксическая имплантации

1. Выполнение подготовки, как описано в шагах 1.6-1,13.
2. Удаление соединительной ткани из верхней части черепа и надавите мышцы шеи тщательно, примерно 2 мм для предотвращения мышечных артефакты во время записи.
3. Очистить черепа с помощью хлопок кончик аппликатора и физиологического раствора и 4 отверстия (2 передних) и 2 выше мозжечка, диаметром 0,8 мм поставить Костные винты из нержавеющей стали (00-96 x 1/16) для наземного и стабилизации имплантата (рис. 1 d). Положение земли винт, подключенных к одной медной проволоки (примерно 2-3 см длиной) выше мозжечка.
4. Покрывают землю винт полностью с цементом, чтобы предотвратить мышцы артефакты во время электрофизиологических записи. Постройте цементного кольца, подключение все винты (Рисунок 1E).
5. Выполните краниотомии выше стороне имплантации (гиппокампа, AP-1.94, 1.4 Л, V 1.4 со ссылкой на bregma). Примените примерно 5 мкл стерильных NaCl на поверхности ткани мозга.
6. Медленно опустите проволока массив с помощью stereotaxis в краниотомии. Для унитарного записей имплантаты силиконовые зонд вместо проволоки массив⁶³; для того, чтобы предотвратить optoelectric света артефакты, имплантат волоконно отдельно в гиппокампе кончиком волокна не непосредственно перед зонд (Рисунок 1 c -я). Для расследования координации нейроволновой синхронизации между полушариями имплантат дополнительных оптических волокон в области контралатерального СА1 гиппокампа.
7. Примените примерно 5 мкл теплых жидкий воск/парафинового масла, разогретую на 70 ° C, с помощью шприца над сайтом имплантации для защиты ткани мозга.
8. Применять цемент вокруг провода массив и охватывают череп с цементом.
9. Нанесите одну каплю flux проволоки presoldered земли/ссылки и presoldered провод подключен к земле винт, например с помощью иглы и предохранитель провода с помощью пайки машины.
10. Покрывают весь заземляющий провод с цементом.
11. Администрировать 0,3 мл Erycinum (1:4 в стерильных NaCl) и и.п. carprofen (5 мг/мл) после операции и для по крайней мере двух дней после. Мышь обычно просыпается в течение 15 мин, после операции. Теплый животное с красная лампа для ускорения восстановления.
12. Ежедневно контролировать вес мыши для первой недели после операции или до тех пор, пока вес стабильным. Потеря веса не должна превышать 10% от веса мыши зарегистрированы до хирургии. Для ускорения стабилизации веса, питания мыши с мокрой продовольствия и сгущенное молоко в первые дни после операции.
13. Для записи гиппокампа клеточной активности во время захвата, имплантата силиконовые зонд в гиппокампе (AP-1.94, 1.4 Л, V 1, с последующим понижением), как описано в ref. ⁶² (Рисунок 1 c -я). Имплантат оптоволокна в гиппокампе в АП -3, 1.4 Л, V-1.6, 39 ° хвостового Ростральных. Если стимуляция клеток somata имплантата дополнительных оптических волокон в мс (AP +0.98, 1 Л, V 3.9, боковые 15 °).

5. Optogenetic стимуляции и приобретение электрофизиологических данных

1. Приучать мыши для установки записи (например, сессий 15 мин, 1-2 сеанса в день в течение 3 дней). Изучите поведение животных, прежде чем начиная с первых экспериментов. Если мышь движется в камере, изучение окружающей среды, нюхает, выполнение rearings и т. д., запустите первый экспериментальный сеанс.
2. Поместите курсор мыши в камере знакомые в отсутствие других животных в той же комнате.
3. Прикрепите светодиодные на голову-сцену с помощью клейкой ленты для отслеживания позиции животного. Убедитесь, что светодиод захвачен камеры на протяжении периода животное изучает записи камеры до начала экспериментов. Запись в темноте, чтобы отслеживать светодиодный свет. Расположите камеру выше запись камеры.
4. Проверьте световой поток от патч-корд. Оцените светоотдачи от кончика волокна после подключения в зависимости от скорости передачи волокна имплантированных. Убедитесь, что световой поток от кончика волокна между 5-15 МВт, чтобы включить надежное нейроволновой синхронизации.
5. Соедините headstage предусилитель с хронически имплантированных. Волоконно-оптические патч корды соединиться хронически имплантированных гиппокампа волокна для optogenetic стимуляции экспериментов. В экспериментах легкой стимуляции управления Подключите волоконно к Макетные обойма, подключен к гарнитуре.
6. Поместите курсор мыши в зале регистрации.
7. Открытое программное обеспечение для управления стимул генератор для создания протокола стимуляции.
8. Выберите канал, который управляет 473 Нм DPSS лазер. В первой строке введите 3000 МВ (первый столбец), время 30 мс (вторая колонка), значение 0 mV (третий столбец), время 112 мс (4-я колонка), ряд повторных 840 и группа повторить 1, чтобы создать протокол для 2 минут 7 Гц стимуляции с 30 мс длинные импульсы. Отрегулируйте длительность 4 столбцов и количество строк повторений при необходимости стимуляции на другой частоте или различной длительности. В второй строки выберите 0 МВт (первый столбец), время 500 h (вторая колонка), строка повторять 1, группы и повторить 1, чтобы обеспечить, что лазерная настоящее время выключен после стимуляции протокола прекращается.
9. Нажмите кнопку «Файл > Сохранить как» и сохраните файл с именем нужного.
10. Заверить, что стимулятор TTL выход активирован лазер подключен к цифровой рысь аналоговый входной платы для синхронизации на приобретение электрофизиологических и optogenetic данных.
11. Кроме того параметрически регулировать изменчивости частоты колебаний тета, примените поезда световых импульсов на различных интервалов между импульса, с периодами после распределения Гаусса. Измените дисперсия между пульс интервалы для различных протоколов, например, от 3.2 до 15,1 мс²шага. Примените эти протоколы для создания тета эпох с различными изменчивость тета частоте (рис. 6).
12. Откройте программное обеспечение записи системы. Щелкните дальше «ACQ» для приобретения и «REC» для записи. Подождите до начала легкой стимуляции для записи базового поведения (например, 2 мин до получения базовой скорости или 30 мин для извлечения полей базовых место).
13. Открытое программное обеспечение для управления генератора стимул. Нажмите кнопку «Файл > Открыть» и выберите файл протокола выбора. Нажмите «Загрузить и начать «инициировать легкой стимуляции.
    Примечание: Эксперимент можно произвести съемку и стимуляции начал через пульт дистанционного управления; Это исключает влияние присутствия экспериментатора на поведение животных. В зависимости от цели исследования стимуляции может быть начата и прекращены в течение определенного поведения.

6. комбинированный подход для Optogenetic ГРЭС и проекции конкретных ингибирование гиппокампа вывода

1. Экспресс ChR2 в клетках MS ГАМК PV-Cre мышей, как описано в разделе 1.
2. Кроме того ввести в общей сложности 2.4 мкл CamKIIα зависит от галородопсин (eNpHR3.0, AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH) в обоих полушариях спинной гиппокампа (AP -1,7; L ± 1,05; V -2.05 и - 1,4 мм; AP -1,7; L ± 1,7; V -2.05 и - 1.55 мм; AP-2.3; L ± 1,5; V-2.2 и - 1.3 мм; AP-2.3; L ± 2,2; V-1.65 и - 2,45 мм).
3. Разрешить 6 недель выражения времени.
4. Имплантат массив Вольфрам проволока с оптоволокна в регионе СА1 гиппокампа, как описано в разделе 4. Кроме того, имплантат на двусторонней основе оптических волокон в боковые перегородки (LS, AP 0.1, 0.25 Л, V-2.25 мм и AP 0.5, Л-0.3, V-2.7 мм).
5. Выполните optogenetic тета волн эксперименты, как описано в шагах 5.4-5.5.
   1. Для одновременного ингибирование гиппокампа вывода LS, создавать стимул поколение протокол: например, триггер наступления в выходной канал подключен к 593 Нм DPSS лазера 15 s с непрерывной импульса длительностью общее 45 s, прежде чем спровоцируют выходных импульсов до 473 Нм DPSS лазер.
   2. Подключите оба волокна в LS через патч-корды, с использованием многомодового волокна Оптические муфты до 593 Нм DPSS лазер.
   3. Начать запись и скачать и активировать протокол для управления генерацией стимул.

7. обработка данных

1. Преобразовать электрофизиологических сигналов и положение данных отслеживания с менеджером нейрофизиологических данных (ND) форматы .dat и .pos, соответственно⁶⁴.
2. Получите LFP НЧ-фильтрации и вниз выборки широкополосного сигнала до 1250 с помощью ND менеджер⁶⁶Гц.
3. В каждой записи, выберите канал с максимальной амплитудой тета колебания (используя Neuroscope)¹⁹.
4. Обнаружения отметок времени лазерных импульсов и стимуляции эпох с порога обнаружения алгоритм (с использованием MATLAB функции findpeaks.m или подобные)¹¹.
5. Чтобы импортировать файл .dat в многоканальных данных анализа программного обеспечения, нажмите кнопку «Файл > Импорт», выберите «двоичные файлы» как тип данных и выберите файл .dat. В диалоговом окне конфигурации введите правильное количество каналов и дискретизации 1 250 Гц, нажмите кнопку «ОК» и сохраните как файл .smr. Участок спектра мощности, выбрав «Анализ > новый результат вид > PowerSpectrum». В настройках выберите канал с высокой амплитудой тета и 16.384 размер БПФ, нажмите кнопку «Новый», определяют как «Время начала» в начале эпохи стимуляции и как «Время окончания» конец эпохи стимуляции, и нажмите кнопку «Процесс».
6. Рассчитать верности нейроволновой синхронизации как отношение спектральной плотности совокупные мощности (PSD) в диапазоне частот optogenetic стимуляции (стимуляции частоты ± 0,5 Гц), чтобы совокупное PSD в полосе тета (5-12 Гц) с помощью метода multitaper (NW = 3, Размер окна 8192) для 10 s эпох (например, Инструментарий < http://chronux.org/>).
7. Исключить записи эпох, где доминирующим пик PSD-≤ 5 Гц от анализа (не тета эпох, с использованием MATLAB функции find.m).
8. Печать растровых спектры мощности LFP для всех записанных эпох согласно верности вычисляемых нейроволновой синхронизации (с помощью MATLAB функций sortrows.m и pcolor.m). Загрузить мощности спектры и увлечения верности, нажав «File > Open», хранится в переменной мощности типа дюйма = sortrows(In,1); pcolor(Power(:,2:end)).

Нападения на ChR2 клетки ГАМК в МС, как описано в разделе 1 проиллюстрирован на рисунке 2A. Optogenetic стимуляция аксоны ячейки MS ГАМК в спинной гиппокампа через оптические волокна, который вживляется выше области СА1 захватывает тета колебания с частотой стимул на ипсилатеральной (рис. 2B) а также контралатеральной полушарие (рис. 2 c). Тета колебаний может быть более или менее эффективно увлекаемого optogenetic стимуляция (Рисунок 3А), эффективность которого рассчитывалась для каждой записи эпоху как относительное тета LFP питания вокруг стимуляции частоты, т.е., верность ГРЭС (рис. 3B). Нейроволновой синхронизации верности выше 0,3, то есть, выше, чем в спонтанной свет off записи, наблюдалось в примерно 80% записи эпох. Optostimulation на частотах, не тета был менее эффективным (рис. 3 c).

Явные т.е., параметрические манипуляции тета колебаний, частота сопровождается возникающих изменений тета регулярности: временные регулярность амплитуды и частоты колебаний тета была увеличена во время эпохи с высоким нейроволновой синхронизации верности. Стабильность колебаний может также регулироваться параметрически применения поезда световых импульсов, периоды которого следуют нормальным распределением с разными дисперсиями (рис. 4).

Optogenetic контроль над частотой колебаний ликвидированы корреляции между тета частоты и скорости бега, по согласованию с частотой управления через MS по возрастанию афферентов во время движения (Рисунок 5A). Optostimulation также индуцированной тета колебания во время бездействия (Рисунок 5B). Преференциального стрельбы фазы записан в области СА1 предполагаемого пирамидных клеток и интернейронов были неизменными по сравнению с optogenetically увлекаемого тета колебаний по сравнению с спонтанное тета (рис. 6).

Для изучения вклада гиппокампа в боковые перегородки путь в тета опосредованное регулирование передвижения, мы optogenetically ингибирует этот путь. Галородопсин (eNpHR3.0) на двустороннем уровне была выражена в гиппокампа пирамидных клеток (рис. 7A), тогда как ChR2 была выражена в клетках MS ГАМК как выше и тета колебания были optogenetically увлекаемого (рис. 7B). Тета волн снижение изменчивости работает скорость, но не когда была тормозится гиппокампа в путь LS (рис. 7 c).

Рисунок 1: Иллюстрация оптических волокон, электроды и хирургии. (A) Иллюстрация оптического волокна. (B) Иллюстрация приклеены к оптоволокна для записи гиппокампа LFP во время увлечения гиппокампа тета колебаний провода массива. (C) для записи гиппокампа клеточной активности, силиконовые зонд монтируется на microdrive. (D) миниатюрные винты расположены на черепе. Провода медные presoldered Справочник по городу и винт перед позиционирование их выше мозжечка. (E) цемента применяется для покрытия и подключения винты. Верхняя синий круг указывает, где была выполнена краниотомии для имплантации силиконовые зонд. Нижняя синий круг указывает, где была выполнена краниотомии для имплантации оптоволокна в гиппокампе. (F) один волоконно имплантируется в хвостовой ростральной угол целевой области СА1 гиппокампа. Второй волокна могут быть имплантированы в медиальной перегородки если стимуляция клеток somata (опционально). (G) силикон зонд опускается до чуть выше области СА1 гиппокампа. (H) границы microdrive и разъем укрепил имплантата и землю, и ссылка провода припаяны. (я) Медь сетки построен вокруг имплантата и служить клетку Фарадея. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: подготовка для увлечения гиппокампа тета optogenetic. ChR2 (A) была выражена в+ медиальной межжелудочковой перегородки фотоэлементы в PV-Cre мышей (Верхняя схема). Яркие флуоресценции в мс (1, 2) подтверждает успешно построить выражение в somata. MS волокна проекта через свод (f) и бахромок (fi) в гиппокампе (3-6); ACA: передней спайки; Передняя часть. HDB: ядро горизонтальная конечностей диагональной полосы; Или: пласт oriens. Оптические волокна для стимуляции optogenetic с голубой свет имплантируется выше пирамидальной слоя области СА1 гиппокампа (Нижняя схема). Масштаб бары: 500 мкм (Фото 1, 3, 4) и 50 мкм (Фото 2, 5, 6). (B) гиппокампа LFP во время колебаний спонтанное тета (слева) и 7 Гц (в середине) или 10 Гц (справа) optogenetic ГРЭС. Синие полосы указывают время окна света приложений. Обратите внимание на фазу, сброс от светового импульса, указано стрелкой. Примечание гамма конверты во время спонтанной и увлеченные тета, показателем физиологического тета-ритма. Фаза разворота между пласт oriens (ул. или.) и слой radiatum (ул. rad.) также поддерживается во время захвата. (C) нейроволновой синхронизации является надежным во время ипсилатеральной (верхних участков), а также контралатеральной (нижних участков) optogenetic стимуляции. Схемы иллюстрируют позиции волокон в отношении позиции электродов. Пример LFP следы во время тета и применение световых импульсов показаны в середине. На правом, спектры мощности гиппокампа LFP ИПСИ - и контралатерального стимуляции цветом в зависимости от частоты стимуляции. Этот показатель был изменен номер 11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: верности уноса гиппокампа тета optogenetic. (A) пример гиппокампа LFP следы при низких и высоких волн верности. (B) власть спектральной плотности 10 s эпох во время спонтанного тета, с рядами, приказал согласно ведущих тета частоте (слева) и во время 7 Гц (в середине) и стимуляции (справа) optogenetic 10 Гц, с рядами, приказал согласно нейроволновой синхронизации верности. Соответствующим примером спектры мощности (указано стрелкой) на диаграмме выше. Обратите внимание надежной уноса верности различных эпох. Справа отображается вероятность общей верности нейроволновой синхронизации частот тета. (C) нейроволновой синхронизации требует тета ритмической стимуляции. Гиппокампа сетевой активности может быть успешно увлекаемого использование частот между 6-12 Гц. На более низких частотах (например, 2 или 4 Гц) или выше частоты (например, 20 Гц) нейроволновой синхронизации не является надежным. Этот показатель был изменен номер 11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: Параметрический манипуляции регулярность колебаний тета. (A) стимуляции был применен на разных частотах в диапазоне тета с частотой среднее 7,8 Гц после распределения Гаусса. Стандартное отклонение интервалов между импульса была увеличена через протоколы от σ = 3.19 σ = 15.09. В общей сложности 11 протоколы были создается и применяется, каждый с общей продолжительностью стимуляции эпохи 1 мин. Из тех распределения вероятностей 5 протоколы отображаются на левой стороне фигуры. Спектральная плотность мощности в диапазоне 1-14 Гц гиппокампа LFP во время применения соответствующих протоколов, выводятся в центре рис. Вероятности тета периодов во время применения соответствующих протоколов показано справа. Интервалы между импульса (B) дисперсии прикладной определяется дисперсия периода параллельного тета (Пирсона r = 0,94, p = 0.0002). (C) отношения между тета амплитуды изменчивости и Интер пульс интервал (Пирсона r = 0,61, p = 0,08). Этот рисунок был изменен с реф 70. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5: Optogenetic тета художественной нейроволновой синхронизации определяет гиппокампа LFP во время поведение. (A) Optogenetic стимуляции частота определяется тета частоте во время передвижения. Следовательно связанные с скорость афферентов не влияют гиппокампа тета частоте, и как следствие, скорость не коррелирует с тета частоте (синий), как это во время спонтанной тета (черный). Данные представлены как означает ± s.e.m. (B) во время тихой бодрствования, гиппокампа тета может вызвали в отсутствие движения. Гиппокампа LFP следы до и во время успешной уноса указаны выше, и ниже приводится пример скорость следы, записанный во время нейроволновой синхронизации (красный след соответствует гиппокампа LFP трассировки, изображенные выше). Синие полосы Марк время windows импульсов света стимуляции. Этот показатель был изменен номер 11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6: гиппокампа клеточную активность во время тета волн. (A) клеточной активности был записан с помощью силикона зондов (схема). Один интернейронов и пирамидальные клетки были изолированы и определены согласно их соответствующих осциллограмм. Здесь показан средняя сигнала (в середине) и auto некотором примера изолированных пирамидальной клетке. (B) фазы разряда Предпочитаемые пирамидальных клеток (Pyr) не отличался во время спонтанного (в черный, n = 29 нейронов) и optogenetically увлекаемого (в синий, n = 30) тета (p = 0,79). (C) показанный здесь является auto-correlogram (слева) и преференциальных стрельбы фазы быстрого обжига межнейронного во время спонтанной и optogenetically увлекаемого тета. Ниже соответствующего гиппокампа LFP ритм во время спонтанного (слева) и увлеченные тета (справа). (D) Предпочитаемые разряда фазы быстрого обжига интернейронов не отличалась во время спонтанного (в черном) и optogenetically увлекаемого (в синий, n = 28 нейронов) тета (p = 0,97). Средняя auto некотором показано слева. (E) средняя auto некотором ул oriens клетки. (F) Предпочитаемые разряда этап ул oriens интернейронов не был различных во время спонтанного (черный) и optogenetically увлекаемого (синий, n = 10 нейронов) тета (p = 0,56). Гистограммы предпочтительного выполнения этапов отображаются справа. (G) средний огонь ставки не были затронуты тета волн в пирамидальных клеток (p = 0,98), быстро обжиг интернейронов (p = 0,96) или ул. oriens интернейронов (p = 0,85). Этот показатель был изменен номер 11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 7: сочетание гиппокампа тета волн и optogenetic ингибирования гиппокампа подкорковых вывода через LS. (A) eNpHR3.0 (галородопсин) была выражена в пирамидальных клеток гиппокампа (Верхняя схема). Успешное выражение конструкции была подтверждена ярко флуоресценции в somata в гиппокампе (верхняя изображения) и аксоны в LS (Нижняя изображения). Оптические волокна были имплантированы на двустороннем уровне выше LS (Нижняя схема). Масштаб бары: 500 мкм (фото слева), 50 мкм (фото справа). (B) гиппокампа тета успешно увлекаемого в процессе торможения гиппокампа для LS путь. Здесь изображены спектральной плотности мощности для 9 Гц синий свет стимуляции во время вывода ингибирование. (C) ингибирование основных гиппокампа подкорковых выходного пути предотвращает эффект уноса гиппокампа тета на скорость. Здесь показан снижение изменчивости скорости на optogenetic ГРЭС (белый бар с голубой границ), с отсутствует при одновременной ингибирование гиппокампа для LS путь (желтый бар с голубой границ). Соответствующих исходных средняя скорость отображается на левой стороне. Этот показатель был изменен номер 11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Авторы не имеют ничего сообщать.