Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Microdissection первичной почечной ткани сегментов и интеграция с технологией Роман эшафот свободной конструкции

7.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57358

⸱

27 марта 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Medical University of South Carolina

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Ткани инженерных конструкций почечной предоставляют решение для органа нехватка и пагубные последствия диализа. Здесь мы описываем протокол к микро вскрыть мышиных почки для изоляции cortico Медуллярная сегментов. Эти сегменты имплантируется в эшафот бесплатный сотовых конструкций, образуя почечной organoids.

Аннотация

Трансплантация почки в настоящее время основной терапии для терминальной стадии почечной болезни. Однако с примерно 96 000 человек на лист ожидания и только четверть из этих пациентов, достижение трансплантации, существует острая потребность в альтернативных вариантов для тех, кто не в состоянии органов. Для уменьшения вредных последствий диализа наряду с общей медицинских расходов, которую он несет, активное расследование продолжается в поисках альтернативных решений для трансплантации. Имплантируемые почечной сотовой конструкции, ткани инженерии, один такой реальный подход к замене потерянных почечной функции. Описанные в первый раз, вот microdissection мышиных почек для изоляции жизни corticomedullary почечной сегментов. Эти сегменты способны быстрого включения в течение бесплатно эшафот эндотелия фибробластов конструкций, которые могут включить быстрое соединение с принимающей сосудистую после имплантации. Взрослый мыши почки были закуплены от живых доноров, следуют стереоскоп microdissection для получения почечной сегментов 200-300 мкм в диаметре. Несколько почечной конструкции были изготовлены с использованием первичных почек сегментов заготавливаемым от только одной почки. Этот метод демонстрируется процедура, которая может спасти функциональной почечной ткани от органов, которые в противном случае будет игнорироваться.

Введение

Хроническая болезнь почек (CKD) является одним из текущих общественного здравоохранения проблемы во всем мире1. Распространенность CKD в Соединенных Штатах составляет более 14% от общей численности населения, с более чем 600 000 американцев страдают от наиболее тяжелой формой, терминальная стадия почечной недостаточности (ТПН)2. Текущие варианты лечения доступны для тех, кто с ТПН включают диализа и почечной трансплантации. Хотя приблизительно 25 000 пациентов проходят почечной трансплантации каждый год, значительное количество пациентов добавляются ежегодно приводит к большой разрыв между теми ожидающих спасения жизни органа и тех принимающих трансплантации3. В дополнение к его серьезное негативное воздействие на продолжительность жизни и качество жизни диализ ассоциируется с удивительной финансового бремени. В 2014 году Medicare заплатил претензии составил более 30 миллиардов долларов для ТПН больных2. С ограниченной орган и без очевидной нисходящий тренд в пациентов, нуждающихся в диализе исследовательские усилия, направленные на выявление альтернативных решений для диализа и трансплантации всегда важны. Даже относительно небольшой задержки в необходимости диализа увеличивает количество пациента лет жизни с поправкой на качество и производительность существенно отложив расходов, связанных с диализа4,5,6.

Решения для потери функциональных тканей, как в ТПН, в настоящее время изучаются в тканевой инженерии и регенеративной медицины лаборатории, с широко разнообразных подходов, начиная от изготовления на основе эшафот органоид инженерных с помощью весь орган decellularized орган структур для сотовых имплантации7,8,9,10,11. Лишь частично исследован сводный комплекс почечной структур от маргинальных или брошенных почек. В самом деле почти 20% почек для пересадки удаляются для различных причин12,13. Функциональной почечной ткани из этих предполагаемых графтов может использоваться и включены в одной или нескольких тканей инженерных конструкций. Предыдущие исследования показали возможность работы с этими органами отбрасываются, используя почки внеклеточных матрицы для ткани инженерных целей14,15. Однако мало использовали первичной nephronal ткани от здоровой почки для тканевой инженерии целей16,17,18.

Один из методов описано ранее, Ким et al. включает изоляции почечной «сегменты» от здоровых крыс почки, которые затем были посеяны на Полигликолидная кислота (PGA) подмости для изготовления конструкции16. Однако мало информации дается относительно методологии точного рассечение, и сегменты были получены из комбинации тонкой мясорубки и фильтрации. Мы описываем изменения настоящего Протокола, который аналогичным образом производит дискретных почечной сегментов с нетронутыми nephronal архитектуры, но вместо этого опирается на методы microdissection. Nephrectomies выполняются на жизни взрослых мышей, после чего почки передаются рассечение Микроскоп где почечной капсула удаляется, и далее рассекается ткани. Малокалиберная 30½ G иглы используются как инструменты для резки и также как направляющие, пособничество в рассечение, как иглы диаметром равным диаметру целевых сегментов почек. Изолированные, в этом случае мышиных, почечной сегменты сохранять жизнеспособность в культуре и соединяются с сотовой конструкции бесплатно эшафот эндотелия фибробластов19. Ранее были использованы эти конструкции инженера других органов, включая био Искусственная поджелудочная железа20.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все животные хирургических процедур, описанных ниже были утверждены институциональный уход животных и использовать Комитет (IACUC) в медицинский университет Южной Каролины до любых животных операций или использование любых животных тканей.

1. мышиных нефрэктомия

  1. Дон хирургические маски и начес шапку, чтобы свести к минимуму риск загрязнения. Поддерживать стерильность во время настройки области хирургического.
    1. Место не перфорированную хирургические шторы на операционном столе.
    2. Откройте пакет газобетона инструментов на стерильную шторы. Инструменты, необходимые для нефрэктомия включают 3 небольших hemostats, изысканные щипцы с зубами, тонкой пинцет без зубов и ножницы прямые Ирис.
    3. Место другой не перфорированную хирургические драпировка в центре операционного стола.
    4. Подготовьте 5 мл из Дульбекко фосфат буфер солевой (DPBS) с кальцием и магнием, дополнен с 1% пенициллина/стрептомицина в 15 мл стерильного Конические трубки. Место это решение на льду рядом с операционного стола.
  2. Получите 8-12 неделя старый C57BL/6 мышь (мужчина или женщина) от животного жилого комплекса.
  3. Поместите курсор мыши внутри камеры индукции анестезии и побудить с 3,5% вдыхании изофлюрановая. Место носовой конус на мыши, с помощью изофлюрановая 2% для поддержания анестезии.
    1. Монитор для адекватной глубины анестезии периодически на протяжении хирургической процедуры оценки для педали рефлекс (фирмы мыс сжатие).
  4. Удаление всех волос из брюшной туловища, используя крем удаления волос. Промойте этой области с дистиллированной водой, чтобы убедиться, что все волосы был удален из живота.
  5. Передача мыши в стерильной операционной таблицу в лежачем положении под топ не перфорированную пелерина. Вырежьте2 порозность 2 x 2 см в пелерина, просто вышележащих мыши живота.
  6. Примените повидон йод следуют 70% этанола в брюшную полость, с помощью стерильных марлевых или хлопок шаров.
  7. С помощью тонкой щипцы с зубов и Ирис ножницы, сделать 3-4 см вертикальной брюшной Кожный разрез параллельно средней линии, 0,5 см слева от срединной линии
    Примечание: При попытке удалить правой почки, это будет разрез 0,5 см справа от средней линии.
    1. Захватите брюшины с тонкой пинцет без зубов и надрезать с диафрагмой ножницы для проникновения в брюшную полость. Применить hemostats к верхние и нижние боковые поверхности кожи и брюшины боково место напряженность и повысить воздействие.
    2. Деликатно сдвиг кишечного содержимого по правой стороне живота подвергать левой почки. Осторожно поместите тяги на почки, чтобы поднять его из живота.
    3. Поместите зажим через рубчика левой почки. Используйте ножницы радужки к створу мочеточника и почечной судов.
    4. Поместите левую почку в 1% раствор DPBS пенициллина/стрептомицина на льду.
    5. Передача трубка, содержащая почек на стерильную культуры ткани капот. Передать функции почек от 15 мл Конические трубки Петри 60 мм (рис. 1). Полоскать дважды 5 мл DPBS с помощью кальция и магния. Держите приостановлено в 5 мл DPBS в 60-мм блюдо почек.
      1. Подготовьте дополнительные 60 мм Петри с 5 мл DPBS для использования в ходе microdissection протокол.
    6. Усыпить мыши торакотомия и обескровливания после закупки почки, согласно утвержденной животных протокол IACUC.

2. мышиных почек Microdissection для изоляции почечной сегмент

  1. Продолжить использование стерильных для этой части протокола, включая стерильные перчатки, хирургические маски и начес, чтобы свести к минимуму риск загрязнения.
    1. Место стерильным шторы на платформе стерео Микроскоп, а также относительно только что покинул районы и право Микроскоп иметь стерильный поле для инструментов. Место Самоклеющиеся листы пластика на Микроскоп фокус ручки и спрей с 70% этиловом спирте. Включите двойной гусиная шея осветитель свет этапа.
    2. Открытый стерилизованные инструменты (штраф пинцет без зубов, ручка для скальпеля, лезвие скальпеля #15, две прямые hemostats, два 30½ манометрическое полые отверстие иглы) на стерильную шторы. Место в #15 лезвия на скальпель обрабатывать теперь и прикрепить один кровоостанавливающий каждой иглы адаптер/концентратор для создания инструментов рассечение иглы для последующего использования, как показано на рисунке 1.
  2. Переместите Петри 60-мм, один содержит почки в DPBS и другие только DPBS, от культуры ткани капот к области микроскопа.
    1. Место Петри 60-мм под цели и снять крышку подвергать почки. Оставьте DPBS-содержащих блюдо в сторону на стерильную поле для последующего использования.
    2. Переместите блюдо, так что только передней или задней поверхности почек в представлении (например, большие плоские лица почки, с другим лицом, касаясь в нижней части блюда). Масштабирование до 3,2-4 X для этой части процедуры. Недоминирующей руки, использование тонкой пинцет без зубов Пирс и закрепить почек против блюдо вблизи нижней и Улучшенный полюса почки.
    3. Держите руку недоминирующих в месте, чтобы закрепить почки. С доминирующей рукой используйте лезвие #15 для удаления полупрозрачный слой волокнистых капсульной из внешней поверхности. Бритье самое поверхностное 0,5 мм от внешней поверхности почек, чтобы удалить оставшуюся часть капсулы.
    4. Используйте лезвие #15 для того чтобы рассечь перевернутая пирамида ткани из области очищенные, примерно 2 мм3 в размер. Получить 60-мм блюдо, содержащие только DPBS и место пирамиды ткани в чистую посуду. Отменить оставшуюся часть почки.
    5. Уменьшите масштаб до 1,5-2,0 X для остальной части рассечение. Использование двух инструментов кровоостанавливающий иглы как режущих инструментов, нарежьте фрагмент ткани постепенно меньшие части до тех пор, пока участки ткани, меньше или равно диаметру иглы советы. В размер 2 мм почечной ткани3 будет производить более 50 раз полностью расчлененные сегментов.
    6. Перемещение 60-мм блюдо с почечной сегментов на культуре ткани капот. Удалите DPBS с 1000 мкл пипеткой. Добавьте 5 мл DMEM, дополнена 10% плода Bovine сыворотки (ФБС) и 1% пенициллина/стрептомицина.
    7. Культура для 3 дней при 37 ° C в инкубатор или имплантата в сотовой конструкции немедленно.

3. почечной сегмент сотовой конструкции изготовление

  1. Культура нормальный кожный фибробластов (NHDF) и человека жировой микрососудистой эндотелиальных клеток (HAMEC) на несколько недель для получения 7.2 x 105 фибробластов и 1.8 x 105 эндотелиальных клеток на конструкцию желаемого. В культуре ткани капот, семя соответствующие соотношения фибробластов в эндотелиальных клеток (4:1) в палочковидные скважины в агарозном формы сформировать эшафот бесплатный предварительно сосудистого эндотелия фибробластов конструкции (SPEC) как описано ранее, Чайка и др. 19.
  2. Получение стерилизованные кровоостанавливающий, 30½ G иглы и стерильные шпатель с плоским концом.
    1. Удалите часть средств массовой информации из 60-мм пластины, содержащая почечной сегментов, стараясь не аспирационная и удалить почечной сегментов.
    2. Оборудуйте хирургические лупы для визуализации имплантации сегментов.
    3. Скрип конца шпателем аккуратно в нижней части 60-мм блюдо, чтобы получить 10-15 сегментов, равномерно вдоль самого кончика шпателем. Место кончике шпатель как можно ближе к губы хорошо, где был посеян SPEC.
    4. Используйте инструмент иглы зажим-30½ G в другой для перемещения каждого индивидуального сегмента от кончика шпателем на край колодца. Аккуратно вниз каждый сегмент в хорошо используя кончик иглы, до тех пор, пока слегка погруженным в ранее в сеяный сотовых подвеска.
    5. Культура почечной сегмента SPEC в 2:1:1 отношение FGM-2/СГЭ-2/DMEM среды (общий объем 2,5 мл). Изменить культуру СМИ каждые 24 ч в течение 3 дней. Удаление конструкций из формы на 72 h и исправить или флэш замораживания для обработки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Протокол, в описанный производит около 50 почечной сегментов на пирамидальную 2мм3 часть почечной ткани. Почечная сегментов, которые были обработаны и образы имеют трубчатых и клубочковых компоненты в различных пропорциях (см. Рисунок 2). Нетронутыми сегменты были подвергнуты assay для определения жизнеспособности различных сегментов один раз каждые 24 часа в течение трех дней. Зеленый флуоресцентный Флуорексон ам присутствует с активность внутрикл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Методы, используемые для инженер почечной ткани жизни конструкции различаются в отношении как тип клеток и биоматериалов использованы и во многих случаях являются устаревшими или не хорошо изученных в литературе7. Хотя многие используют подходы стволовых клеток или перечислении отдельные компоненты архитектуры почек в изоляции, перспектива искусственно воссоздать весь орган с более чем 26 типов различных дифференцированных клеток из клеточных суспензий Подавляющее рассмотреть21

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

NIH институциональных докторантура Грант, низ HL-007260

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Нефенестрированный стерильный FieldBusse Hospital Disposables696
Fenestrated Sterile FieldBusse Hospital Disposables697
Halsted Mosquito Щипцы 5 ИзогнутыйMiltexMil-7-4"Hemostat" in manuscript
Extra Fine Graefe Щипцы, изогнутые с зубамиFine Science Tools11155-10Тонкие щипцы с зубами
Очень тонкие щипцы Graefe, зазубренные (без зубов)Fine Science Tools11152-10Тонкие щипцы без зубов
Тонкие ножницы - карбид вольфрамаFine Science Tools14568-09Ножницы для ирисов
Betadine Хирургический скраб с насосом, повидон-йод 7,5%Purdue Products L.P.67618-151-17
Стерильная ватная марлевая салфетка (4" x 4")Fisher Healthcare22-415-469
Буферный раствор фосфата ДульбеккоCorning21-030-CV
раствор пенициллина/стрептомицина, 100XCorning30-002-Cl
изофлуран, USPПроизводитель: Piramal, дистрибьютор: McKesson2254845
Nair Hair RemoverNair22600-23307Крем для удаления волос в тексте
200 Proof EthanolDecon Laboratories2705Разбавленный до 70% раствор этанола
BioLite 60 мм Чашка для культуры тканейThemo-Scientific130181
Press'n SealGlad12587-70441Нанесено на стереоскоп
SZX16 СтереомикроскопOlympusSZX16
Волоконно-оптический осветительCole Parmer41720-20
Самонесущая двойная световая труба, 23 "L гусиная шеяCole ParmerEW-41720-60
Ручка скальпеля # 3MiltexMil-4-7
Стерильное ребро назад Лезвие из углеродистой стали, размер лезвия 15Bard-Parker371115
игла 31 1/2 калибраThermoFisher Scientific14-826FBecton Dickinson 305106
Dulbecco's Modified Eagle's MediumCorning10-017-CV
Fetal Select 100% бычья сывороткаAtlas BiologicalsFS-0500-AD
Нормальные дермальные фибробласты человекаLonzaCC-2511
Жировые микрососудистые эндотелиальные клетки человекаНаучные исследовательские лаборатории7200
Хирургические лупы (2,5x)Ораскопическая(Н/Д) по индивидуальному заказу
FGM-2 (Базальная среда фибробластов с добавлением FGM-2 SingleQuots)LonzaCC-3131, CC-4126
EGM-2 (Эндотелиальная базальная среда с добавлением EGM-2 SingleQuots)LonzaCC-3156, CC-4176
Набор для жизнеспособности/цитотоксичности живых/мертвых клеток млекопитающихThermoFisher ScientificL3224
Антитело к цитокератину-18Abcamab668
Антитело к мышам IgG у козы, Alexa Fluor 633ThermoFisher ScientificA-21052
У козы против кролика IgG, Alexa Fluor 546ThermoFisher ScientificA-11010
Антитело к фактору фон ВиллебрандаAbcamab6994
Альбумин, флуоресцеин изотиоцианат КонъюгатSigma AldrichA9771-50MG
Hoescht 33342BD Pharmingen561908
Background BusterInnovex BiosciencesNB306

Ссылки

  1. Jha, V., et al. Chronic kidney disease: global dimension and perspectives. Lancet. 382 (9888), London, England. 260-272 (2013).
  2. 2016 USRDS Annual Data Report: Epidemiology of Kidney Disease in the United States. U.S.R.D. , Available from: https://www.usrds.org/2016/download/v2_ESRD_16.pdf (2016).
  3. Hart, A., et al. OPTN/SRTR 2015 Annual Data Report: Kidney. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 17, Suppl 1 21-116 (2017).
  4. de Vries, E. F., Rabelink, T. J., van den Hout, W. B. Modelling the Cost-Effectiveness of Delaying End-Stage Renal Disease. Nephron. 133 (2), 89-97 (2016).
  5. Lefebvre, P., Duh, M. S., Mody, S. H., Bookhart, B., Piech, C. T. The economic impact of epoetin alfa therapy on delaying time to dialysis in elderly patients with chronic kidney disease. Disease management : DM. 10 (1), 37-45 (2007).
  6. Mennini, F. S., Russo, S., Marcellusi, A., Quintaliani, G., Fouque, D. Economic effects of treatment of chronic kidney disease with low-protein diet. Journal of renal nutrition : the official journal of the Council on Renal Nutrition of the National Kidney Foundation. 24 (5), 313-321 (2014).
  7. Moon, K. H., Ko, I. K., Yoo, J. J., Atala, A. Kidney diseases and tissue engineering. Methods. 99, San Diego, Calif. 112-119 (2016).
  8. Wobma, H., Vunjak-Novakovic, G. Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2015: A Year in Review. Tissue engineering. Part B, Reviews. 22 (2), 101-113 (2016).
  9. Langer, R., Vacanti, J. Advances in tissue engineering. Journal of pediatric surgery. 51 (1), 8-12 (2016).
  10. Jakab, K., et al. Tissue engineering by self-assembly and bio-printing of living cells. Biofabrication. 2 (2), 022001(2010).
  11. Fisher, M. B., Mauck, R. L. Tissue engineering and regenerative medicine: recent innovations and the transition to translation. Tissue engineering. Part B, Reviews. 19 (1), 1-13 (2013).
  12. Stewart, D. E., Garcia, V. C., Rosendale, J. D., Klassen, D. K., Carrico, B. J. Diagnosing the Decades-Long Rise in the Deceased Donor Kidney Discard Rate in the United States. Transplantation. 101 (3), 575-587 (2017).
  13. Mohan, S., et al. The weekend effect alters the procurement and discard rates of deceased donor kidneys in the United States. Kidney international. 90 (1), 157-163 (2016).
  14. Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34 (24), 5915-5925 (2013).
  15. Katari, R., et al. Renal bioengineering with scaffolds generated from human kidneys. Nephron. Experimental nephrology. 126 (2), 119(2014).
  16. Kim, S. S., Park, H. J., Han, J., Choi, C. Y., Kim, B. S. Renal tissue reconstitution by the implantation of renal segments on biodegradable polymer scaffolds. Biotechnology letters. 25 (18), 1505-1508 (2003).
  17. Guimaraes-Souza, N. K., Yamaleyeva, L. M., AbouShwareb, T., Atala, A., Yoo, J. J. In vitro reconstitution of human kidney structures for renal cell therapy. Nephrology, dialysis, transplantation : official publication of the European Dialysis and Transplant Association - European Renal Association. 27 (8), 3082-3090 (2012).
  18. Kelley, R., et al. Tubular cell-enriched subpopulation of primary renal cells improves survival and augments kidney function in rodent model of chronic kidney disease. American journal of physiology. Renal physiology. 299 (5), 1026-1039 (2010).
  19. Czajka, C. A., Drake, C. J. Self-assembly of prevascular tissues from endothelial and fibroblast cells under scaffold-free, nonadherent conditions. Tissue engineering. Part A. 21 (1-2), 277-287 (2015).
  20. Rhett, J. M., Wang, H., Bainbridge, H., Song, L., Yost, M. J. Connexin-Based Therapeutics and Tissue Engineering Approaches to the Amelioration of Chronic Pancreatitis and Type I Diabetes: Construction and Characterization of a Novel Prevascularized Bioartificial Pancreas. Journal of diabetes research. 2016, 7262680(2016).
  21. Al-Awqati, Q., Oliver, J. A. Stem cells in the kidney. Kidney international. 61 (2), 387-395 (2002).
  22. Aboushwareb, T., et al. Erythropoietin producing cells for potential cell therapy. World journal of urology. 26 (4), 295-300 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Микродиссекция почечной тканибескаркасные конструкциипервичные сегменты почеквыделение почек мышиприменение в тканевой инженериидиссекция под стереоскопомэндотелиально-фибробластные конструкциианализ жизнеспособностиреабсорбция альбуминафактор Виллебранда
Microdissection первичной почечной ткани сегментов и интеграция с технологией Роман эшафот свободной конструкции
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.