Методическая статья

Аденоассоциированный вирус опосредованной трансген выражение в генетически определенных нейронов спинного мозга

18K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57382

⸱

12 мая 2018 г.

 ,  ,  , 
1Institute of Pharmacology and Toxicology, University of Zurich, 2Institute of Pharmaceutical Sciences, Swiss Federal Institute (ETH) Zurich

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Межпозвонковые инъекции рекомбиназа зависимых рекомбинантных аденоассоциированный вирус (rAAV) может использоваться для манипулирования любой тип генетически маркированных клеток спинного мозга. Здесь мы опишем, как передавать нейронов в спинной рога поясничного отдела спинного мозга. Эта техника позволяет функциональной допроса манипулировать нейрон подтипа.

Аннотация

Селективный манипулирования позвоночника подгруппы нейронов был достигнут главным образом двумя различными способами: 1) совокупной генетики, whereby двойной или тройной трансгенных мышей создаются для того, чтобы достичь избирательным выражение репортер или эффекторных ген (например, от Rosa26 Локус) в желаемой позвоночника населения. 2) межпозвонковым инъекции Cre зависимых рекомбинантных аденоассоциированный вирус (rAAV); Здесь векторы AAV Cre зависимых кодирования для репортера или эффекторных гена выбора вводят в спинной мозг мышей, выражая рекомбиназа КРР в желаемой нейрональных субпопуляция. Этот протокол описывает способы создания Cre зависимых векторов rAAV и как передавать нейронов в спинной рога поясничного отдела спинного сегментах L3-L5 с rAAVs. Поясничного отдела позвоночника сегменты, L3-L5 иннервируются этих периферийных сенсорных нейронов, которые передают сенсорную информацию от гомотерия спонтанного поведения и ответы на сенсорные испытания применительно к задних конечностей, ипсилатеральные стороне инъекции могут быть проанализированы для того, чтобы допросить функцию манипулировать нейронов в сенсорной обработки. Мы предлагаем примеры как эта техника может использоваться для анализа генетически определена подгруппы нейронов спинного мозга. Основными преимуществами вирус опосредованной трансген выражения в Cre трансгенных мышей, по сравнению с классической репортер мыши индуцированной трансген выражения являются следующие: 1) различных Cre зависимой rAAVs кодирования различных репортер или эффекторных белков может быть вводят в одной Cre трансгенные линии, преодолев тем самым необходимость создания нескольких несколько трансгенные мыши линии. 2) межпозвонковым инъекции ограничивает манипуляции Cre выражая клеток в месте инъекции и на время после инъекции. Основными недостатками являются: 1) выражение гена репортера из rAAVs является более переменной. 2) хирургии требуется передавать позвоночника нейронов интерес. Какой из этих двух методов является более подходящим зависит от нейрона населения и исследований вопрос.

Введение

Спинной мозг дорсальной имеет важное значение для обмена информацией между периферии тела и мозга. Сенсорные стимулы, такие как тепло, холод, сенсорных или вредных раздражителей распознаются специализированных периферийных нейронов, которые передают эту информацию нейронов спинного мозга Спинной рога. Здесь модулирует сложной сети тормозящее и возбуждающих интернейронов и в конечном итоге реле сенсорную информацию через нейроны спинного мозга проекции supraspinal сайты1,2. Вычисления, проведенного спинного Интер- и проекции нейронов строба сенсорной информации, таким образом определить какая информация подавлены или ретранслируется на какой интенсивности. Изменения в интеграции сензорных стимулах, например изменения баланса между торможения и возбуждения, может вызвать сенсорные дисфункции Гиперчувствительность или аллодиния (болевые ощущения после обычно болезненный стимуляции). Эти изменения являются считается основной причиной хронической боли в различных государств3,4. Таким образом, позвоночника цепи имеют первоочередное значение в сенсорной обработки и, следовательно, в восприятии окружающей среды организма и сам. С недавнего появления и сочетание молекулярных и генетических и хирургические методы, которые позволяют точного манипулирования генетически выявленных спинного мозга нейрон субпопуляций ученые сейчас начинают понимать основные позвоночника цепей ответственный за обработку различных сенсорных механизмов.

Межпозвонковым инъекции rAAV в мышах одичал тип или трансгенных внесла манипуляции, анализа и понимания функции конкретных подмножеств нейронов спинного мозга5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11. Этот метод позволяет доставки маркера белков (например GFP / GFP синтез белков), репортер белков (например, GCaMP), или эффекторных белков (например, бактериальные токсины, channelrhodopsin или фармакогенетических рецепторов) в пространственно ограниченным образом нейронов спинного мозга. Местные инъекции Cre зависимой rAAVs в трансгенных мышей, выражая рекомбиназа КРР в определенное подмножество нейронов спинного мозга позволяет конкретный анализ соответствующих нейронов населения. Мы использовали этот метод для обозначения, удалять, подавляют или активировать спинного glycinergic нейронов, демонстрируя, что они являются неотъемлемой частью позвоночника ворота контроля боли и зуд передачи7. В этих экспериментах межпозвонковые инъекции Cre зависимой rAAV в GlyT2::Cre мышей позволили селективного манипуляции glycinergic нейронов в поясничного отдела спинного мозга. Таким образом можно избежать одновременной манипуляции supraspinal цепей, которые содержат glycinergic нейронов, решающее значение для выживания животного.

Хотя межпозвонковым инъекции rAAVs ограничивает инфекции на сайт инъекции, вирусный трансдукции может возникнуть не только в местных нейронов, но и в нейроны, которые подключаются к инъекции через аксональное прогнозы. Последние часто используется для трассировки ЦНС областях нейронов предоставления определенного ядра в головном мозге. Инфекция аксональное прогнозы однако, также может быть смешанным фактором при определенных населения нейронов должно учился в определенном сайте. Для решения этих вопросов, мы недавно провели всесторонний анализ AAV серотипов и выражение кассет для выявления серотипов и промоутеров, которые могут использоваться для сведения к минимуму или максимизировать Ретроградная трансдукции. В контексте конкретных исследований в позвоночнике цепей мы проанализировали способность различных серотипов и промоутеров передавать retrogradely нейронов в спинной корень ганглиев (DRG), Ростральные вентромедиального продолговатого мозга (RVM) и соматосенсорной коры 12. техника, изложенные в настоящем Протоколе, поэтому может использоваться для анализа позвоночника нейронов в месте инъекции или для анализа проекции нейронов, которые обеспечивают вклад вводят сайт спинного мозга. В протоколе, описанные здесь три инъекции rAAV в левой части поясничного отдела спинного выполняются для включения трансдукции нейронов в трех поясничных сегментов (L3-L5). L3-L5 сегментов получают большинство сенсорного ввода от задних конечностей ипсилатеральные в месте инъекции. Мы продемонстрировать, что функциональные манипуляции генетически помечены нейронов в L3-L5 достаточно, чтобы вызвать надежные поведенческие изменения, таким образом обеспечивая функциональные доказательств для цепи функции подтипом генетически помечены нейрона.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на животных были утверждены управлением Швейцарии кантональных ветеринарные (Цюрих) и находятся в соответствии и соблюдение всех соответствующих нормативных и институциональных руководящих принципов.

Примечание: Все материалы вместе с соответствующими производителями или поставщиками, перечислены в Таблице материалов.

1. поколение векторы AAV Cre зависимых

Примечание: Можно приобрести разнообразные Cre зависимых векторов с различными промоутеров (см. Таблицу материалов) или, если нужное выражение конструкция не доступен, он может быть создана путем изменения существующих конструкций AAV. Обратите внимание, что промоутер и серотип может иметь влияние на распространение вирусных трансдукции (см. 12). В первой части настоящего Протокола кратко описывает поколения двух различных векторы AAV Cre зависимых, подходит для выгоды и потери функции экспериментов, соответственно.

  1. Фармакогенетических активации (усиление функции)
    1. Заказать pAAV.hSyn.flex.hM3D (Gq)-mCherry (см. Таблицу материалы) для дизайнера рецепторов, исключительно активированную дизайнерские наркотики (DREADD)-опосредованной активации.
    2. После получения бактериальной удар культуры, полоса бактерий на ФУНТ пластин (агар бактериологического класса растворяют в жидкой среде Лурия Бертани) дополнены соответствующим антибиотиком. Инкубируйте на ночь при 37 ° C и выбрать единую колонию на следующий день.
      Примечание: Плазмиды, содержащие AAV геномов вектор может быть нестабильным и рекомбинации вирусного генома, особенно в рамках вирусный Перевернутый терминал повторяет (ИТР), может произойти во время усиления в E. coli. Мы предлагаем с помощью recA недостаточным/подавлены штаммов таких как MDS42 или Stbl3, чтобы избежать рекомбинации в плазмиды, содержащие AAV генома.
    3. Усилить бактерий следуя указаниям производителя выбранного ДНК-макси-Kit и готовить высококачественные плазмида ДНК с коммерчески доступных ДНК-макси-Kit (например, смотрите Таблицу материалы). Выполните контроль качества подготовки ДНК плазмиды путем проверки целостности и личность плазмидной ДНК через ограничение дайджест Алиготе плазмидной ДНК.
      Примечание: Есть признание сайты для эндонуклеазы ограничения ссии в РМЭ. Включите дайджест ссии контроля качества для проверки целостности РМЭ.
    4. Отправьте объекте ядро вирусный вектор для того чтобы произвести высокое качество rAAV ДНК.
      Примечание: Высокий титр, вирусный парфюмерные высокого качества имеют решающее значение для избегая смешанным фенотипов, вызванные загрязнений в Вирусный prep. Поэтому рекомендуется rAAV выбор производится в установленных вектор основного объекта, если производство AAV хорошо установленной в лаборатории.
  2. Аблация (потеря функции)
    Примечание: Бактериальные токсины или токсинного рецепторов может использоваться посредником клеток абляции или нейронов глушителей. Мы породили pAAV.EF1α.flex.DTA Экспресс дифтерии токсин фрагмент (DTA) в зависимости от КРР.
    1. Чтобы создать вирусный вектор Cre зависимых, выберите Cre зависимых вектор с подходящей промоутер (например, pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP). Усилить кодирующая последовательность выбора (например, DTA) полимеразной цепной реакции с праймерами, которые включают AscI и NheI или совместимый эндонуклеазы признания в их свесы (см. Фостер и др. 7)
    2. С помощью стандартных молекулярные методы биологии, выполнять дайджесты ограничения дна вектора (pAAV.EF1α.FLEX.hChR2(H134R)-eYFP) и ПЦР усиливается insert (NheI-ДТА-AscI) с эндонуклеазами ограничения AscI и NheI. Перевязать очищенный фрагментов.
    3. Трансформировать реакции перешнуровки в подходящих бактерий, согласно протоколу, предоставленных поставщиком компетентным бактерий выбора и пластины бактерий на ФУНТ пластин. Используйте recA недостаточным/подавлены штаммов, например MDS42 или Stbl3, для клонирования и последующего усиления плазмидной ДНК.
    4. На следующий день после преобразования выберите клонов и прививать им в среде LB дополнена соответствующим антибиотиком ночевкой в 37 ° C. На следующий день экстракт плазмида ДНК из искусственного бактерий. Проверка успешного клонирования путем ограничения дайджесты и секвенирования извлеченные плазмидной ДНК.
    5. Усилить высокого качества, бактериальных плазмида ДНК (см. шаг 1.1.3). Отправьте амплифицированного ДНК на вирусный вектор основной объект для производства вирус.

2. трансдукции клеток спинного мозга

  1. Приготовление раствора вирус
    Предупреждение: Вирусы являются инфекционные реагентов и должен осуществляться согласно соответствующим руководящим принципам. В большинстве случаев rAAVs может быть обработано на уровне биобезопасности 1 (BSL1).
    1. В день, инъекции размораживание запасов Алиготе желаемого очищенный вирус на льду и держать его на льду пока непосредственно перед инъекцией. Избегайте повторяющихся замораживания оттаивания циклов, как это позволит снизить эффективную титр вируса.
      Примечание: В случае необходимости, размороженные аликвота вирус может храниться при температуре 4 ° C до 3 дней.
    2. Разбавить частицы вируса в стерильного 0,9% NaCl или фосфата буфер солевой раствор (PBS).
      Примечание: Соответствующие титр зависит экспериментальных целей и должны быть определены экспериментально. Хорошее общее вирусная нагрузка начать с – 3 х 109 генома экземпляров (3.33x1012 GC/мл, 3 x 300, которые вводят nL). Принимая избыточное и некоторые потери при загрузке капилляров в счет, около 2,5 мкл раствора вирус будет необходимо для каждой мыши.
  2. Подготовка Micropipettes к межпозвонковым инъекции
    1. «Тянуть» тонкостенных стеклянные капилляры (наружный диаметр 1 мм) на микропипеткой съемник для создания ~5.5 мм в длину, неглубокие хвостовик. Используйте накаливания нагреватель 3,0 мм и параметры программы 00 с P(A), адаптирована как показано в таблице 1.
      Примечание: Потянув можно сделать заранее. Вытащил капилляров должны храниться в закрытом контейнере на пластилин, чтобы избежать пыли, которая позже может засорить микропипеткой. Автоклавирование micropipettes нет необходимости.
    2. Клип хвостовик вытащил капилляра с щипцами Ламинэктомия длиной около 4,5-5 мм для создания кончик открытия с внутренним диаметром 25-35 мкм. С помощью микроскопа с микрометра масштабе, Измерьте внутренний диаметр несколько micropipettes, чтобы получить чувство для как большие открытия должна быть, или измерения для каждого микропипеткой.
      Примечание: Меньше подсказка может привести к засорению; большие чаевые может вызвать повреждение тканей и трудности проникнуть спинного мозга.
  3. Подготовка хирургической установки и инструменты
    1. Убедитесь, что оборудование является чистым и готов к использованию. Лечить области работы, вытирая с 70% этанола и стерилизовать инструменты автоклавирования или их обеззараживания. Не допускайте любой дезинфектант микролитр шприц, который бы вред вирусный вектор для использования.
  4. Анестезия и подготовка животного для хирургии
    Примечание: Общая продолжительность операции составляет 60-90 мин.
    1. Выберите 6 - до 10 - неделю старых мышей для облегчения хирургической процедуры.
      Примечание: Если это требуется экспериментальный дизайн, инъекции молодых или старых животных возможен. Любое напряжение и обоих полов могут быть использованы в принципе, но использовать же фон деформации (например, C57BL/6J) для сравнения между различными трансгенные мыши линии поведения. Если половые различия, как ожидается, или должны расследоваться, анализировать мужчин и женщин в отдельных группах.
    2. Вызвать обезболивание с помощью ~ 5% изофлюрановая. Животное в Стереотаксическая рама на мат тепла и поддержания анестезии в изофлюрановая 1-2,5% (воздушный поток скорость 900 мл/мин). Монитор частоты дыхания на протяжении операции.
    3. Применение смазки глазную мазь для предотвращения высыхания роговицы во время операции.
    4. Брить спины животного и удалить волосы тщательно с мокрой ткани. Продезинфицируйте бритой кожи раствором йода и позволяют коже высохнуть.
    5. Дать обезболивающее лечение (например, 0,1-0,2 мг/кг бупренорфин подкожно).
  5. Экспозиции позвоночного столба на уровне поясничного отдела спинного мозга
    Примечание: Из-за дифференциального развития спинного мозга и позвоночного столба, соответствующие уровни не совпадают, но поясничного отдела спинного сегменте L4 находится на том же уровне, как грудной позвонок T13.
    1. Найдите наиболее хвостового пара ребер, пальпируя вдоль позвоночного столба. С помощью скальпеля, делают продольный разрез 1,5-2,5 см в кожу, начиная от просто ростральной наиболее хвостового паре ребер.
    2. Снять кожу с щипцами и отсоединить его от основных мышц с ножницами. На протяжении операции, держать облученных тканей влажным с стерильным 0,9% NaCl.
    3. С помощью тонкой щипцы и маленькие ножницы, надрезать в следующий, тонкий слой мембранное рядом срединной и отрезать его от остистого отростка. Это отдельно от основной paraspinous мышц, но придает остистого отростка.
  6. Идентификация позвонков на уровне поясничного отдела спинного мозга
    Примечание: После того, как подвергается позвоночного столба, межпоперечный связки и спинной остистого отростка должно быть видимым. Некоторые анатомические ориентиры могут помочь в определении правильного позвонка до цели (рис. 1B).
    1. Потяните кожу обратно к хвосту подвергать подвздошной кости. На том же уровне наиболее хвостового пара видимых межпоперечный связок соединяет остистого отростка L6. Граф назад в хвостовой ростральной направлении для идентификации позвонка интерес.
    2. Ощупывайте вдоль позвоночного столба. Наиболее хвостового пара ребер расположен просто ростральной T13 позвонка и тазовые кости на уровне бедер на уровне позвонка L6.
    3. Найдите место, где сухожилия вдоль стороны позвоночного столба белее и наиболее медиальной. T13 позвонка расположен просто Ростральных. Поясничного отдела спинного сегменте L4 расположен в пределах этого позвонка.
  7. Фиксация позвоночника и воздействия поясничного отдела спинного мозга
    1. Поместите животное на подушке засучив тканей, чтобы поднять его позвоночника зажимы стереотаксической рамы.
    2. Исправьте целевой позвонка во избежание движений позвоночника из-за дыханием. Для этой цели Совместите зажимы, прилегающих к целевой позвонка, исправить один зажим в положении и удерживая второй зажим фиксации позвоночника, пинцетом Adson.
      Примечание: Столбец должен быть перпендикулярен плоскости инъекций и твердо закреплены так, чтобы он не двигаться на давление сверху. При необходимости, вторая пара зажимов может быть установлена для позвоночника. В этом случае полезно исправить две пары зажимов для двух позвонков, прилегающих к целевой позвонка.
    3. Удалите paraspinous мышцы выше позвонков интерес. С помощью скальпеля, сделать параллельный разрез просто медиальнее сухожилий, которые параллельно позвоночному столбу, а также перпендикулярных разрезов, Ростральные и хвостового до целевой позвонка. Будьте осторожны, чтобы не отрезать слишком глубоко. Слеза/вырезать прочь мышцы с помощью rongeurs. При необходимости воспользуйтесь щипцы для удаления тканей, оставшиеся на позвонка или выше Дура в межпозвонкового пространства.
    4. В межпозвонкового пространства спинной кровеносный сосуд должен быть виден маркировки midline спинного мозга. Для односторонних инъекции выполните частичное ламинэктомии, сверлить отверстие в середине целевой стороны позвонка. Использование тонкой стоматологии, бурение аппарат с 0,5 мм сферические резец и сверлить особенно тщательно при приближении к спинного мозга. Удалите любые оставшиеся фрагменты костей с 26G среза иглы подвергать спинного мозга.
    5. С помощью 26G среза иглы, перфорации Дура в просверленное отверстие и в межпозвонкового пространства ростральной и каудально к целевой позвонка, все примерно 200 мкм сбоку спинной кровеносного сосуда. Спинномозговой жидкости должны спасаясь от отверстия и спинной мозг должен быть слегка выпуклый.
  8. Подготовки шприц инъекций
    Примечание: Шприц инъекции должны быть готовы непосредственно перед началом инъекций снижения риска засорения микропипеткой частиц пыли.
    1. Смонтируйте стеклянные капиллярные на микролитр шприц с помощью съемной иглой резьбовое комплект. Затяните гайку плотно, чтобы обеспечить плотный и безопасную посадку.
    2. Заполните шприц микролитр стерильной дистиллированной водой и начать нажав его вне с поршнем.
      Примечание: Если есть слишком много сопротивление таким образом, чтобы вода не легко прийти из кончика, микропипеткой вероятно блокируется и должны быть обменены.
    3. Смонтируйте шприца микроманипулятор, подключенных к электронным управлением microinjector. Будьте осторожны, чтобы не прикасаться с микропипеткой.
    4. С помощью microinjector, составить около 1 мкл воздуха для создания пузырь между водой и вирус.
    5. Тщательно место капельку 2,5 мкл раствора вирус на кусок парафина фильма, переместите кончик микропипеткой в капли, с помощью стереотаксической рамы и нарисовать его. Затем тщательно пресс обойтись до тех пор, пока немного раствора вирус выходит на вершине.
    6. Убрать шприц и с помощью пера, Марк микропипеткой со шкалой и отмечаем уровень вирус решения; Это будет способствовать мониторингу ли вливание идет как запланировано.
  9. Межпозвонковые инъекции
    1. Переместите кончик микропипеткой выше одно из отверстий в Дура, а затем вниз до тех пор, пока небольшая вмятина отмечается в Дура. Для инъекций спинного мозга Спинной рога, переместите вниз 500 мкм 100 мкм последовательными шагами (скорость 1 мм/сек) и затем 200 мкм до для механической стабилизации ткани.
      Примечание: Окончательный глубины наконечника в данном случае это 300 мкм, но могут быть адаптированы в зависимости от целевой области.
      1. Если ткань устойчива к проникновению, микропипеткой может ловить на Дура. В этом случае убрать и слегка пошевелить покрывают отверстие, или снова использовать иглы для перфорации Дура должным образом, прежде чем повторять попытку проникновения.
    2. Программа насос для целевой объем впрыска 300 nL скоростью инъекций 50 нл/мин и нажмите кнопку Пуск для начала инфузии.
    3. После завершения инъекций, проверьте масштаб снизился ли уровень вирус и оставить микропипеткой в место для дополнительных 3 мин разрешить давление, чтобы сбалансировать перед медленно втягивать шприца.
    4. Повторите шаг 2.9.1.-2.9.3. для других сайтов двух инъекций.
  10. Ушивание и восстановление
    1. Удаление спинного мозга зажимы и подушки ниже мыши.
    2. Закройте рану в слои с прерванного швами, ушивание слои поверхностной ткани с рассасывающиеся швы и кожи с не рассасывающиеся швы. Примените дезинфицирующим йода на рана зашивается.
    3. Прекратить анестезии и оставить животное на мат тепла до тех пор, пока он восстанавливается до возвращения в свои дома клетке.
  11. Послеоперационный уход
    1. Мониторинг состояния здоровья животного на в день операции, на следующий день, а затем каждые 2-3 дня. Убедитесь, что животное имеет нормальной походкой, здоровый внешний вид (вес, глаза, меха и поведение), и что заживление.
    2. Продолжать болеутоляющее лечение (например, 0,1-0,2 мг/кг бупренорфин подкожно) в случае необходимости, три раза в день.

3. поведенческие и морфологического анализа

  1. Поведенческого анализа
    Примечание: Позволяют животных для размещения в соответствующие установки по крайней мере 30 минут до начала измерения, чтобы позволить им приспособиться к новой экспериментальной среде.
    1. фон Frey тест
      1. Поместите животных индивидуально в отдельных отсеков около 10 см x 10 см на полу металлическую сетку.
      2. Стимулировать подошвенной поверхности ипсилатеральные hindpaw к месту инъекции с динамический фон Frey накаливания. Обратите внимание на силу, в которой животное не покинет лапой стимул.
      3. Повторите пять раз и вычислить среднее вывода порога от шести измерениям для каждого животного.
    2. PIN-код укола тест
      1. Место животных на отдельных отсеков около 10 см x 10 см на полу металлическую сетку.
      2. Стимулировать подошвенной поверхности ипсилатеральные hindpaw для укола иглой притупляются 26-G без проникновения кожи. Оценка поведения как ноль (не реагирует) или один (реакция).
      3. Повторите 9 раз с интервалом в 3 минуты между стимуляцию и рассчитать процент отклика от 10 измерений для каждого животного.
    3. Инъекции DREADD-лиганд клозапин N-оксид (CNO)
      1. Растворяют CNO в диметилсульфоксида (ДМСО) для создания Стоковый раствор 0,2 мг/мкл, который может храниться при комнатной температуре.
      2. В день эксперимента, разбавить раствор стерильного 0,9% NaCl в 0.2 мкг/мкл и залить 10 мкл/г веса тела внутрибрюшинно. Придать контрольных животных с транспортного средства (0,2% ДМСО в 0,9% NaCl).
        Примечание: Согласно опыту, пик воздействие на поведение может быть ожидаемым 1-3 ч после инъекции, и эффекты должны полностью спадать после 24 ч. В случае активации нейронов glycinergic наблюдается поведения включают снижение реакции на боль и зуд. Поведения, вызванные DREADD-опосредованной активации нейронов будет зависеть от целевых подмножество нейронов спинного мозга.
    4. Инъекции Pruritogens вызвать зуд
      1. Растворяют pruritogens в 0,9% NaCl решения 8 мг/мл (хлорохин) или 10 мг/мл (гистамин). 2 ч после приема CNO, inject 10 мкл раствора pruritogen или транспортного средства, подкожно в подошвенной поверхности ипсилатеральные hindpaw для позвоночника укола. Кроме того придать pruritogen intradermally теленка, которая сбрил один день прежде чем уменьшить отрицательной поведения, вызванные бритья, сам.
    5. Видеозаписи для анализа спонтанной Nocifensive или Pruritogen индуцированной зуд поведения
      1. Поместите животных индивидуально в прозрачной отсеков (около 10 см в диаметре) с немного постельных принадлежностей от их соответствующих дома клетке на полу.
      2. Видеокассету для записи pruritogen индуцированного поведения животных за 5 мин до записи Спонтанная и 30 мин. Анализ видео off-line в закромах 5 мин.
    6. Боль и зуд поведения
      1. Наблюдать и отмечаем дрогнув, лизать и кусаться поведения.
        Примечание: Уклоняясь и лизать пострадавших сайта считается ответы на боль, тогда как кусаться ассоциируется с зуд.
      2. Анализировать видео на нормальной скорости, измерить время что мыши лизать или кусаться пострадавших сайта или измерения в замедленном движении для более четкое различие между лизать и кусаться рефлексов. Кроме того количество лизать/кусаться/дрогнув приступы.
  2. Морфологический анализ
    1. Морфологический анализ от одной до трех недель после инъекции вируса или в конце поведенческих эксперимента.
      Примечание: Мы обнаружил eGFP выражение как только 48 ч после инъекции, но также обнаружили, что выражение значительно возрастает в течение ближайших дней и даже недель. Для ячеек с сильным репортер выражение одну неделю инкубации (от межпозвонковым инъекции до перфузии) может быть достаточно. Для ячеек с выражением слабых трансген, вирусы с слабой промоутеров или слабее флуорофоров, выражение больше времени может потребоваться обеспечить поддающихся обнаружению уровней.
    2. Фиксация ткани
      1. Perfuse каждый transcardially мыши, сначала с 20 мл раствора ледяной искусственных спинномозговой жидкости (ФАГО) (NaCl 125 мм, NaHCO3 NaH2PO4 1,25 мм, D-глюкозы 20 мм, KCl 2,5 мм и CaCl2 2 MgSO4 1 мм, 25 мм), затем с 100 мл из ледяной параформальдегида 4% (в 0,1 М натрия фосфат буфера, рН 7,4).
        Предупреждение: Параформальдегида токсичных и должны быть обработаны с осторожностью.
      2. Сразу же вскрыть поясничного отдела спинного мозга и пост исправить ткани на 2 ч с параформальдегида 4% на льду. Кратко мыть после фиксированных тканей с буфером фосфат натрия 0,1 М (рН 7,4) и затем инкубировать в 25%-ая сахароза растворе (0,1 М натрия фосфат буфера, рН 7,4) на ночь при 4 ° C.
      3. Вырезать ткань cryoprotected на 30 мкм на криостат и смонтировать разделы на скольжениях микроскопа.
    3. Иммунофлюоресценции пятнать
      1. После краткого моет в PBS, применять 300 мкл блокирования решения (10% нормальной осла сыворотки в 0,3% Тритон-PBS) на участках за 1 ч при комнатной температуре.
      2. Инкубируйте слайды с 300 мкл соответствующих сочетаний первичных антител в блокировании решение (см. Таблицу материалы) за ночь при 4 ° C. Вымойте секции 3 раза за 5 мин в PBS.
      3. Инкубируйте слайды с соответствующей комбинации вторичных антител в блокирующие решение за 1 час при комнатной температуре. Вымойте секции 3 раза за 5 мин в PBS.
      4. Кратко промойте слайды в ddH2O, а затем смонтировать с помощью флуоресцентных монтажа среднего coverslips.
      5. Приобрести флуоресцентного изображения с помощью Конфокальный микроскоп с 20 x 40 x цели.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для того чтобы проиллюстрировать уровни выражения, которые могут быть получены путем межпозвонковым инъекций rAAV, шифруя протеин маркер, мы сначала вводят AAV1. CAG.eGFP в поясничного отдела спинного мозга мышей дикого типа. На расстоянии примерно 1 мм друг от друга три инъекции производятся почти непрерывной инфекции поясничного отдела позвоночника сегментов L3, до L5 (рис. 1A-C). Инъекции вируса на глубине 300 мкм от поверхности позвоночни...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Межпозвонковые инъекции AAVs может стать мощной техникой в научно-исследовательской лаборатории, что позволяет анализ спинномозговой клеток с высоким временные и пространственные решения. Этот протокол позволяет трансдукции трех основных сегментов спинного мозга иннервируются сенсорных нейронов, расширяя их периферийных аксоны задних конечностей. Преобразователя трех сегментов производит надежных и воспроизводимых поведенческих данных. Он также позволяет тестирование сенсорные большую площадь, чем возможно после однократ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы благодарим Hanns Ulrich Zeilhofer за щедрую поддержку этой работы. Хендрик Wildner был поддержан Фондом Ольга Mayenfisch. Мы благодарим Кармен Бирхмайер за Lmx1b антител.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Equipment
micropipette puller: DMZ-Universal-Electrode-PullerZeitzNA
Анестезиологический блок: кислородный концентратор Oxymat3Анестезиологический блок WeinmannNA
: VIP 3000 Ветеринарный испарительMidmarkNA
Тепловой коврик: Mio Star Thermocare 100Migros
ЭлектробритваPhilipsBT9290
хирургический микроскоп (OPMI pico)ZeissNA
Стереотаксический аппарат для мелких животныхKopfNA
Neurostar StereoDrive (опционально)NeurostarNA
Модель 51690 Cunningham спинальный адаптерHarvard Apparatus72-4811
Шприцевой насос PHD Ultra с наномитомHarvard Apparatus70-3601
Hamilton 701 RN 10 μ l стеклянный микролитровый шприцHamilton7635-01
Hamilton Съемная игла (RN) компрессионный фитинг 1 ммHamilton55750-01
тонкая стоматологическая буровая установка: Osada success 40OsadaOS-40
сферический резак, 0,5 ммBusch12001005B
электронный анестезиометр фон ФреяIITC23905
гибкий фон Фрей волосыIITC#7
LSM710 Паскаль конфокальный микроскопZeissNA
× 20 План-апохроматный объективZeissNA
1.3 NA × 40 EC План-Neofluar масляный иммерсионный объективZeissNA
NameCompanyКаталожный номерКомментарии
>Surgical Tools
Ручка скальпеля #4, 13 смFine Science Tools10004-13
Экстра тонкие боннские ножницыFine Science Tools14084-08
Щипцы Адсона, 1 x 2 зуба, 12 смFine Science Tools11027-12
Ронжеры Фридмана-Пирсона, изогнутые, чашка 0,7 ммFine Science Tools16121-14
Щипцы для ламинэктомии Dumont #2Fine Science Tools11223-20
Иглодержатели Olsen-Hegar, зубчатые, длина зажима 8,5 ммFine Science Tools12002-12
Тонкие щипцы #5Fine Science Tools11254-20
Name>Company<strong>Номер в каталогеКомментарии
Расходные материалы и химикаты
стеклянный капилляр, наружный диаметр 1 ммWorld Precision InstrumentsTW 100-3
Шприцы (1, 5 и 20 мл)B. Braun(9166917V, 4606051V, 4606205V)
26G скошенная иглаB. Braun4665457
Стерильные лезвия скальпеляB. BraunBB523
Хирургические нити Safil Quick+ 4/0, рассасывающиесяB. BraunC1046220
Хирургические нити Premilene 5/0, нерассасывающиесяB. BraunC0932191
Стерильные PBS или физраствор (0.9%)NA
Этанол, 70% (дезинфицирующее средство)NA
Раствор йода (например, Браунол)B. Braun18380
Анестетики (например, Аттан изофлуран)Provet2222
AldasorberProvet333526
анальгетики (например, бупренорфин: темгезик)ИндивидуальныйGTIN: 7680419310018
Офтальмологический мазь (например, vita-pos)Pharma medicaGTIN: 4031626710635
Ватные палочки (например, из)ЭКО Hartmann1628100
Салфетки для лица (например, из)Uehlinger AG2015.10018
Superfrost plus предметные стекла для микроскопаThermoScientificJ1800AMNZ
NameCompany Каталожный номер>Комментарии
>мыши
C57BL/6J мыши (wildtype)Лаборатория ДжексонаRRID:IMSR_JAX:000664
мыши Rorbtm1.1(cre)Hze/J (RORβ Cre)Лаборатория ДжексонаRRID:IMSR_JAX:023526
Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J мыши (R26Tom)Лаборатория ДжексонаRRID: IMSR_JAX:007914
Name<>CompanyНомер в каталогеComments
Viral vectors
AAV1. КБ7. CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1. CAG.eGFP)Penn Vector CoreAV-1-PV1963
AAV1. CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1. CAG.flex.eGFP)Penn Vector CoreAV-1-ALL854
AAV1. CAG.flex.tdTomato.WPRE
.bGH (AAV1. CAG.flex.tdTomato)		Penn Vector CoreAV-1-ALL864
AAV1. EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1. EF1a.flex.DTA)Penn Vector CoreCustom production
AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi))Penn Vector CoreCustom production
Name<>CompanyНомер в каталогеComments
Plasmids
pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherryAddgene44361
pAAV.EF1α. flex.hChR2(H134R)-eYFPAddgene20298
Name<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии
Bacteria
MDS42ScarabGenomics
Stbl3ThermoScientificC737303
Название<strong>CompanyНомер в каталоге>Комментарии
Реагенты
EndoFree Plasmid Maxi KitQuiagen12362
NucleoBond PC 500Machery & Nagel740574
клозапин-N-оксид (CNO)Enzo Life SciencesBBL-NS105-0025
соль дифосфата хлорохинаSigmaC6628
гистаминSigmaH7125
DapiInvitrogenD3571
NameCompanyКаталожный номер<strong>Comments
Антитела (разбавление)
Rabbit anti-GFP (1:1000)Молекулярные зондыRRID:AB_221570
Rabbit anti-NeuN (1:3000)AbcamRRID:AB_10711153
Goat anti-Pax2 (1 : 200)R & D SystemsRRID:AB_10889828
Анти-Lmx1b у морской свинки (1: 10 000)Dr Carmen BirchmeierMuller et al. 2002
Кролик против GFAP (1 : 1000)DakoCytomationRRID:AB_10013382
Вторичные антитела, выращенные у осла (1:800)Jackson ImmunoResearch LaboratoriesNA
717614700000 0.8 NA Тонкостенныйstrongstrong

Ссылки

  1. Goulding, M., Bourane, S., Garcia-Campmany, L., Dalet, A., Koch, S. Inhibition downunder: an update from the spinal cord. Curr Opin Neurobiol. 26, 161-166 (2014).
  2. Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nat Rev Neurosci. 11 (12), 823-836 (2010).
  3. Sandkuhler, J. Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia. Physiol Rev. 89 (2), 707-758 (2009).
  4. Zeilhofer, H. U., Wildner, H., Yevenes, G. E. Fast synaptic inhibition in spinal sensory processing and pain control. Physiol Rev. 92 (1), 193-235 (2012).
  5. Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).
  6. Cui, L., et al. Identification of Early RET+ Deep Dorsal Spinal Cord Interneurons in Gating Pain. Neuron. 91 (6), 1413(2016).
  7. Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).
  8. Francois, A., et al. A Brainstem-Spinal Cord Inhibitory Circuit for Mechanical Pain Modulation by GABA and Enkephalins. Neuron. 93 (4), 822-839 (2017).
  9. Peirs, C., et al. Dorsal Horn Circuits for Persistent Mechanical Pain. Neuron. 87 (4), 797-812 (2015).
  10. Petitjean, H., et al. Dorsal Horn Parvalbumin Neurons Are Gate-Keepers of Touch-Evoked Pain after Nerve Injury. Cell Rep. 13 (6), 1246-1257 (2015).
  11. Zhang, Y., et al. Identifying local and descending inputs for primary sensory neurons. J Clin Invest. 125 (10), 3782-3794 (2015).
  12. Haenraets, K., et al. Spinal nociceptive circuit analysis with recombinant adeno-associated viruses: the impact of serotypes and promoters. J Neurochem. , (2017).
  13. Abraira, V. E., et al. The Cellular and Synaptic Architecture of the Mechanosensory Dorsal Horn. Cell. 168 (1-2), 295-310 (2017).
  14. Wildner, H., et al. Genome-wide expression analysis of Ptf1a- and Ascl1-deficient mice reveals new markers for distinct dorsal horn interneuron populations contributing to nociceptive reflex plasticity. J Neurosci. 33 (17), 7299-7307 (2013).
  15. Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. J Vis Exp. (73), e50313(2013).
  16. Kohro, Y., et al. A new minimally-invasive method for microinjection into the mouse spinal dorsal horn. Sci Rep. 5, 14306(2015).
  17. Bourane, S., et al. Gate control of mechanical itch by a subpopulation of spinal cord interneurons. Science. 350 (6260), 550-554 (2015).
  18. Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160 (3), 503-515 (2015).
  19. Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).
  20. Gutierrez-Mecinas, M., et al. Preprotachykinin A is expressed by a distinct population of excitatory neurons in the mouse superficial spinal dorsal horn including cells that respond to noxious and pruritic stimuli. Pain. 158 (3), 440-456 (2017).
  21. Awatramani, R., Soriano, P., Rodriguez, C., Mai, J. J., Dymecki, S. M. Cryptic boundaries in roof plate and choroid plexus identified by intersectional gene activation. Nat Genet. 35 (1), 70-75 (2003).
  22. Kim, J. C., et al. Linking genetically defined neurons to behavior through a broadly applicable silencing allele. Neuron. 63 (3), 305-315 (2009).
  23. Kim, J. C., Dymecki, S. M. Genetic fate-mapping approaches: new means to explore the embryonic origins of the cochlear nucleus. Methods Mol Biol. 493, 65-85 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CreGlyT2 Cre

Похожие статьи