Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Долгосрочный клеток изображений для оценки судьбу клеток в ответ на паклитаксел

9.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57383

⸱

14 мая 2018 г.

 ,  , 
1Department of Pharmacology & Experimental Therapeutics, Boston University School of Medicine, 2Department of Medicine, Section of Hematology and Oncology, Boston University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Клеток обеспечивает большой объем информации на отдельные ячейки или целые группы населения, которые недостижима, фиксированные ячейки изображений в одиночку. Здесь жить клеточной изображений протоколы для оценки решения судьбы клеток после лечения с анти митотическая наркотиков паклитаксел описаны.

Аннотация

Клеток – это мощный метод, который может использоваться непосредственно визуализировать биологические явления в одиночных клетках более продолжительных периодов времени. За последнее десятилетие новые и новаторские технологии значительно расширили практичности клеток. Клетки теперь могут храниться в фокусе и непрерывно отображаемого в течение нескольких дней, пока поддерживается при 37 °C и 5% CO2 условий культуры клеток. Кроме того несколько полей зрения, представляющие различные экспериментальные условия могут быть приобретены одновременно, обеспечивая тем самым высок объём экспериментальных данных. Клеток обеспечивает значительное преимущество над-клеточной изображений, позволяя для прямой визуализации и височной количественный динамических сотовой событий. Клеток можно также определить различия в поведении одиночных камер, которые бы в противном случае были пропущены с использованием демографических анализов. Здесь мы описываем клеток изображений протоколы для оценки решения судьбы клеток после лечения с анти митотическая наркотиков паклитаксел. Мы демонстрируем, что методы, чтобы визуализировать ли mitotically арестован клетки умирают прямо из митоз или скольжения обратно в интерфазе. Мы также обсудим, как люминесцентные на основе ubiquitination клеточного цикла индикатор (FUCCI) система может использоваться для оценки доли межфазной клеток родился митотическая проскальзывания, которые способны повторного ввода клеточного цикла. Наконец мы описываем клеток изображений метод идентификации ядерная оболочка разрыв события.

Введение

Анти митотическая препараты давно используется в химиотерапевтического лечения различных видов твердых опухолей и часто показывают большую эффективность1,2,3. Механически, эти препараты нарушить нормальный митотическая прогрессии и содействовать митотическая арест в быстро размножающихся клеток рака. Однако судьба клеток в ответ на арест митотическая сильно варьируется: в то время как часть клеток проходит смерти клетки непосредственно из митоза, другие выйти из митоза и вернуться к межфазное как тетраплоидные клетки (процесс называется митотическая проскальзывания)4, 5,6,,78. Эти клетки межфазной можно выполнять апоптоза, проходят постоянное клеточного цикла арест или даже повторно войти клеточного цикла4,5,6,,78,9 ,10,11. Клетки, которые уклониться от митотическая клеточной смерти, попадают в интерфазе, только для того, чтобы повторно войти клеточного цикла, после удаления наркотиков, поэтому могут способствовать появление рака клеточных популяций. Кроме того клетки, что скольжения от митоз тетраплоидные, и tetraploidy, как известно, содействовать нестабильности хромосомы, что диски опухоли рецидив12,13,14,15. Определение факторов, определяющих судьбу клеток в ответ на анти митотическая медикаментозного лечения поэтому является критически важным для оптимизации текущей терапии.

В этом протоколе мы описываем методы непосредственно наблюдать и изучать судьбу клеток, которые подвергаются длительной митотическая арест в ответ на паклитаксел анти митотическая наркотиков. Паклитаксел является установленным терапевтических в клинике и оказался весьма эффективным во многих типах опухолей, в том числе груди, яичников и легких16,,1718,19, 20. паклитаксел, который является завод алкалоид, полученный из коры Тисового дерева, стабилизирует микротрубочек и таким образом предотвращает их dynamicity21,22. Хотя увлажняющий микротрубочек динамики, паклитаксел не влияет на клеточный цикл прогрессии от1 G до G2, препарат привести к постоянной активации во время митоза шпинделя Ассамблеи контрольно-пропускного пункта, препятствуя Кинетохор микротрубочек вложений (обзор в глубине здесь23,24)25. Как следствие начала анафазе предотвращается паклитаксел лечение клетки и приводит к продолжительной митотическая ареста.

Этот протокол будет сначала описаны подходы к идентификации митотическая клетки в клеток экспериментов и изображений. Митоз могут быть визуализированы в клетках адэрентных культуры ткани из-за двух биологические изменения заметны клеток. Во-первых хромосомы стать весьма конденсированных непосредственно перед ядерная оболочка пробоя. Хотя часто обнаруживаемых стандартных фазово контрастной микроскопии, конденсация хромосом могут быть более четко обнаруженные с помощью флуоресцентных Теги что лейбл хромосом (например дневно меченых гистоны). Во-вторых, митотическая клетки может быть идентифицирован драматических морфологические изменения, происходящие от клеток округления.

Этот протокол будет затем демонстрируется использование клеток изображений подходы для отслеживания судьбы клеток наблюдается длительное митотическая ареста. Арестован в митозе клетки проходят один из трех различных судьбы. Во-первых клетки могут пройти смерти клетки во время митоза. Это явление легко визуализируется на световой микроскопии, как умирающие клетки наблюдаются сжатия, пузырь, и/или разрыв. Во-вторых клетки могут выйти из митоза и вернуться обратно к межфазное без хромосома сегрегации или цитокинез, процесс называется митотическая проскальзывания. Decondensation хромосом и/или уплощение митотическая клеток легко идентифицирует этот процесс. Клетки, которые скольжения от митоз также часто отображения неправильная, дольчатая несколькими ядрами и часто гавани несколько микроядер5. В-третьих арестован в митозе клетки могут инициировать остановку анафазы и продолжите митоз после длительной задержки. Хотя редко при более высоких концентрациях наркотиков, это поведение предлагает что арестованных клетки могут удовлетворены шпинделя Ассамблеи контрольно-пропускной пункт, или контрольно-пропускном пункте Ассамблея шпинделя частично ослабленные или дефектных. Анафазе начала могут быть визуализированы на хромосоме сегрегации и последующие цитокинез с использованием клеток.

Будут также описаны клеток изображений методы, чтобы отслеживать судьбу клеток, которые уклониться от митотическая клеточной смерти, претерпевает митотическая проскальзывания. Клетки, которые проходят митотическая проскальзывания умереть в последующих интерфазе, вызвать прочный арест клеточного цикла1 G или повторно ввести клеточного цикла, начать новый раунд клеточного деления4. Будет описан подход с использованием системы FUCCI (флуоресцентные на основе ubiquitination клеточного цикла индикатор) чтобы определить долю клеток, которые повторно войти клеточного цикла, после митотическая проскальзывания. FUCCI позволяет для прямого визуализации перехода/s1G и может использоваться в сочетании с долгосрочным клеток изображений как in vitro и in vivo26,27. Система FUCCI использует два дневно обозначенные белков, усеченной формы hCdt1 (лицензирование хроматина и репликацию ДНК фактор 1) и hGeminin, уровни которых колеблются на основе позиции клеточного цикла. hCdt1 (сливается с красного флуоресцирующего белка) присутствует на высоком уровне во время фазы1 G, где действует лицензировать ДНК для репликации, но убиквитинированных на E3 убиквитин лигаза SCFSkp2 и деградированных этапах S/G/m2для предотвращения Повторная репликация ДНК26. Напротив, hGeminin (сливается с Зеленый флуоресцирующий белок), является ингибитором hCdt1, вершина которого уровни во время S/G2/м, но это убиквитинированных на E3 убиквитин лигаза APCCdh1 и деградации в конце, митоз и всей G1 26. Следовательно, FUCCI обеспечивает простой флуоресценции индикация фазы клеточного цикла, как клетки экспонат красной флуоресценцией во время G1 и зеленая Флуоресценция во время S/G2/м. FUCCI система является значительным шагом вперед над другие подходы (например Бромдезоксиуридин окрашивание) для идентификации пролиферативной клетки, потому что он не требует фиксации клетки и позволяет для одной ячейки изображений без необходимости использования дополнительных фармакологической лечение для синхронизации клеточных популяций. Хотя не обсуждаются в настоящем Протоколе, дополнительные датчики клеток также были разработаны для визуализации прогрессии клеточного цикла, включая helicase B датчик G128, ДНК лигаза RFP29 и30 датчиков PCDNA-GFP S-фазе, и последние FUCCI-4-датчик, который обнаруживает всех стадиях клеточного цикла31.

Наконец будут описаны клеток изображений способ обнаружить разрыв ядерная оболочка. Недавние исследования показали, что конверты ядерных клеток рака нестабильной и склонной к разрывным, тем самым позволяя содержимое нуклеоплазмы и цитоплазме перемешивают. Это явление называется ядерного разрыва, могут способствовать повреждение ДНК и стимуляции врожденный иммунный ответ32,33,34,,3536,37, 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44. Хотя первопричины ядерной разрыв по-прежнему неполно характеризуется, как известно, что деформаций в ядерной структуре коррелирует с увеличением числа ядерных разрыв42. Один известный эффект лечения паклитаксел это поколение поразительно аномальные ядерных структур после митоз; Таким образом метод с использованием клеток изображений для количественного определения ядерного разрыва будут описаны, а также изучает, если паклитаксел лечения увеличивает частоту событий ядерного разрыва. Ядерного разрыва могут быть обнаружены наблюдаемых утечки ядерной таргетингом флуоресцентного белка в цитоплазме (например димер тандеме повторить из ППП, сливается с ядерной локализации сигнал, TDRFP-NLS). Эта утечка отчетливо видна на глаз, что позволяет простой количественный разрыв событий.

Этот протокол требует widefield эпифлуоресцентного микроскопа, который оснащен закодированные стадии и автофокусировки программного обеспечения. Закодированное этап позволяет точное автоматизированное движение для определенных координат X-Y, в то время как автофокусом программное обеспечение поддерживает клеток в центре внимания в течение периода обработки изображений. Кроме того, этот протокол требует оборудования для поддержания клеток при 37 ° C с увлажняется 5% CO2 атмосфера. Это может быть достигнуто, заключив весь Микроскоп в пределах температуры и атмосфера контролируемых корпус, или с помощью устройств этап топ, локально поддерживает температуру и окружающей среды. Цель фазово контрастной, используемые в настоящем Протоколе является план Флуор 10 x с числовой апертуры 0,30. Однако 20 X целей также являются достаточными для выявления как округлые митотическая и уплощенная межфазной клетки в одной фокальной плоскости. При фазово контрастной визуализации (как описано в этом методе), крышка может быть стекла или пластика. Если используется дифференциальной помехи микроскопия контраста (ОПК), крайне важно использовать стеклянную крышку для предотвращения деполяризации света.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол фокусируется на использование-трансформированных хромосомно стабильной сетчатки пигментированной эпителиальных (ПЭС-1) клетки линии и для визуализации клеток экспериментов. Однако этот протокол может быть адаптирована к любой адэрентных клеток линии до тех пор, пока клетки культуры условия корректируются в случае необходимости. Все процедуры должны придерживаться институциональных биобезопасности и этических руководящих принципов и правил.

1. Подготовка клетки для клеток

  1. Использовать свежей талой и начале прохождения ПЭС-1 клетки, выражая человеческие гистонов, которую H2B сливается с флуоресцентный белок (например H2B-GFP), либо FUCCI система (подробный протокол о том, как создать FUCCI-выражая клетки можно найти в справочных45) чтобы оценить митотическая клеток судьбы.
    1. Чтобы измерить частоту ядерного разрушения, используйте ПЭС-1 клетки, выражая H2B-GFP и тандем димер Красного флуоресцирующего белка, сливается в одной ядерной локализации сигнал (TDRFP-NLS).
      Примечание: Конструкции три зеленые флуоресцентных белков сливается в тандеме, чтобы сигнал одной ядерной локализации (GFP3- NLS) также были использованы для демонстрации разрыв (как ссылка42).
    2. Сохранить клетки на 10 см культуры ткани пластины в средне-и соответствующего роста. НПП-1 клетки поддерживаются в фенола Красного бесплатно, Дульбекко изменения смесь средне/питательных орел F-12 (DMEM:F12), дополнены 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 100 МЕ/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл.
  2. Аспирационная среднего из клеток, мыть ткань культуры блюдо с 10 мл стерильной, комнатной температуре фосфатный буфер (PBS), чтобы удалить оставшиеся среднего и затем аспирационная PBS.
    1. Добавить 2 мл 0,25% трипсина с Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) в клетки и инкубировать при 37 ° C на 3 мин, или до тех пор, пока большинство клеток отделены от пластины.
      Примечание: Не держите клетки в трипсина дольше, чем необходимо.
  3. Добавьте 10 мл полной среды для сбора trypsinized клетки с 10 мл серологические stripette и обойтись в 15 мл Конические трубки.
    1. Пелле клетки центрифугированием при 180 x g 3 мин при комнатной температуре.
  4. Аспирационная супернатанта, стараясь не нарушить Пелле и тщательно Ресуспензируйте гранулы в 10 мл свежей среды, нежно закупорить средних вверх и вниз в серологических stripette.
  5. Используйте Горяева или автоматизированных клеток подсчета машина для подсчета клеток46.
    1. Разбавьте ячейки в новой Конические трубки до 30000 клеток/мл полной среды.
    2. Пластина 30000 ПЭС-1 клеток (1 мл тома) на колодец 12-ну стекла дном (#1.5 толщина) imaging блюдо для достижения требуемых сотовой плотности на следующий день (30-50% притока).
      Примечание: Всегда обрабатывать пластину с перчатками и будьте осторожны, чтобы не задеть стекло дно.
  6. Позволяют клеткам расти в инкубатор культуры ткани 37 ° C, до тех пор, пока они полностью присоединить и придавить на пластину визуализации прозрачным дном. В то время как клетки можно прикрепить в качестве лишь 4 h, рекомендуется, что клетки не лечить препаратами и образы до следующего дня.
  7. Добавьте паклитаксел (растворяют в диметилсульфоксида (ДМСО)) желаемого окончательный концентрации в полного среднего и смесь тщательно.
    1. Подготовка полного среднего с равным объемом ДМСО только для использования в качестве элемента управления.
    2. Теплой среде, содержащей наркотиков или ДМСО до 37 ° C перед добавлением в клетки. Это позволит предотвратить дрейф фокуса вследствие изменения температур.
    3. Добавьте 1 мл среды, содержащие паклитаксел или только для отдельных скважин 12-ну изображений блюдо ДМСО.

2. Настройка микроскоп для клеток

  1. Очистите стекло дно изображений блюдо с оптическим очиститель для удаления любых отпечатки пальцев или пыль, которые могут помешать с изображениями. Используйте достаточно оптических намочить всю стеклянной поверхности.
  2. Поместите блюдо стекло дно на микроскопа в визуализации адаптер блюдо, снимите пластиковую крышку от блюдо и обложка блюдо с камерой сверху стекло. Убедитесь, что камера имеет клапан, чтобы обеспечить устойчивый поток воздуха, состоящий из 5% CO2.
    Примечание: Чтобы увлажнить 5% CO2, газ текла через трубки вставляется в корпус Ванна стерильной водой. Это позволяет для газа станет достижение равновесного уровня влажность до 95%.
  3. Начало/калибровки стадии закодированные с помощью программного обеспечения контроля в Микроскоп. Это обеспечит точные координаты X-Y и предотвращения смещения фокуса.
  4. Фокус на клетки с помощью фазово контрастной Оптика и выполнять Колер освещения (подробно описаны в справочных47) сфокусировать свет и обеспечить оптимальный контраст.
  5. Приобретение программного обеспечения используется для определения оптимальной экспозиции раз белый свет и все флуоресцентные каналы используются (воздействия, что дают 75% насыщения пикселей на камеру идеальны, условии, что это количество света, не токсичны для клеток).
    1. Используйте приобретения программного обеспечения, чтобы выбрать несколько, non перекроя поля зрения каждой скважины для воображения. Выбор изображений регионов, где клетки хорошо придерживаться стекло дно и между 50% и 70% притока. Избегайте районах скомканным клеток, как это затруднит последующего анализа.
      Примечание: Важно иметь неперекрывающийся поля зрения от каждой скважины, чтобы избежать отслеживания тех же ячейках дважды. Если клетки являются очень подвижные, это может быть необходимо приобрести несколько изображений, излучающая из центральной точки и строчки, которые их обратно вместе, чтобы сделать одно большое поле зрения.
  6. Активируйте функцию автофокусировки Микроскоп, чтобы убедиться, что все точки сохраняются в центре внимания в течение всего эксперимента.
  7. Оценить судьба митотическая ячейки, установите изображений программное обеспечение, чтобы собрать фото от каждого выбранного поля зрения каждые 10 мин до до 96 ч. невозмутимая митоз длится 20 – 40 мин, и таким образом 10 мин интервалами будет предоставлять достаточно выборки для определения, когда клетки делятся. Для определения ядерного разрыва, который является временным событием, получить изображения каждые 5 минут.
    Примечание: Убедитесь, что компьютер, вождение приобретения изображений программное обеспечение имеет автоматическое обновление, заставки и режимы экономии энергии отключены, как эти часто могут мешать захвата изображений в течение длительного экспериментов.
  8. Инициируйте изображений эксперимент. Периодически подтверждают, что получение изображения работает нормально в течение видео.

3. видео анализ, чтобы определить судьбу клеток в ответ на паклитаксел

  1. Убедитесь, что образ клетки здоровы на протяжении эксперимента изображений. Управления клетках, обработанных с ДМСО должно быть жизнеспособным и активно пролиферирующих.
    Примечание: Если клетки проявляют признаки стресса, не quantitate видео и вместо этого сосредоточиться на оптимизации изображений условия48. Признаки изображений стресса включают блеббинг/смерти клетки, клетки, которые не придают/распространения на плите и клетки, которые показывают низкий Митотический индекс и/или длительного митоз. Возможные источники стресса включают колебания температуры или CO2 уровнях внутри тепловизионные камеры или Фототоксичность48.
  2. При визуализации всего поля зрения с 10 X или 20 X цель, сотни отдельных ячеек могут присутствовать. Таким образом чтобы помочь с количественный, разделите поле зрения на меньшие квадраты с использованием имеющихся программных средств. Оценка клетки в течение каждого квадранта отдельно (как описано в шагах 3.3.1–3.6.2).
  3. При анализе видео, отслеживать каждую ячейку в объединенное представление с помощью фазово контрастной или флуоресцентных изображений. Используйте инструменты анализа программного обеспечения для создания объединенное представление.
    1. Начиная с начала видео, определить единый межфазной ячейки и отслеживать его прогресс через с помощью оптики фазы клеточного цикла. Чтобы отслеживать одну ячейку, наблюдать ячейки от кадра к кадру на глаз. Определить межфазной клеток из-за их уплощенных морфологии (как начисленных, фазово контрастной) и их отсутствие конденсации ДНК (по оценкам H2B-GFP) (рис. 1A).
  4. Определение ячеек введите митоз наблюдением клетки округления (с использованием фазово контрастной оптика) или хромосома конденсации (с помощью H2B-GFP) (рис. 1A-C). Обе ячейки округления и хромосомы конденсации визуализируются легко на глаз.
    1. Аннотируйте время, когда ячейка переходит в митозе. Далее, отслеживания ячейки, пока достигнет своей судьбы (анафазе как шаг 3.5, смерть клетки от митоз как шаг 3.6.1 или митотическая проскальзывания как шаг 3.6.2).
  5. Клетки управления следует эффективно согласовать их хромосом и введите остановку анафазы в течение 1 ч (рис. 1 d). Визуализируйте анафазе, фазово контрастной оптики, как клетка начинает пинча на две или через визуализацию перемещение к полюсам хромосом, помечены H2B-GFP (Рисунок 1A). Аннотируйте время, когда клетка подвергается анафазе.
  6. Напротив клетках, обработанных с паклитаксел останется округлые с конденсированных хромосом на несколько часов (3-40 h) (рис. 1B-D).
    1. Определите mitotically арестован клетки, которые проходят смерти клетки.
      Примечание: Клетки, которые умирают во время митоза визуализируются при фазово контрастной микроскопии, как клетки будут пузырь, сжать, или разрушения (Рисунок 1B). Если изображение H2B-GFP, хромосомы будет также фрагмент во время смерти клетки.
    2. Определите mitotically арестован клетки, которые проходят клеток проскальзывания.
      Примечание: Клетки, которые проходят митотическая проскальзывания наблюдаются при фазово контрастной микроскопии, как они обратно расплющить в интерфазе и decondense хромосомы без прохождения анафазе (рис. 1 c). Клетки, которые проходят митотическая проскальзывания порождают большие тетраплоидные клетки, которые часто многоядерные (рис. 1 c).
  7. Продолжить отслеживание клетки от оригинального поля зрения. После того, как отслеживаются все поле зрения, перейти к отдельным поле зрения, приобретенных из того же хорошо и продолжить отслеживание клетки.

4. видео анализ, чтобы определить судьбу клеток после митотическая проскальзывания

  1. Оценивать судьбы клетки после митотическая проскальзывания (как описано в шаге 3.6.2) с использованием клеток ПЭС-1, выражая FUCCI системы. В дополнение к фазово контрастной визуализации, это необходимо приобрести красной флуоресценцией (индикативный G1 фазы) и зеленая флуоресценция (индикативный S/G2/м) изображения).
    1. Трек клетки НПП FUCCI-1, как описано в шаге 3.3 через 3.7.
      1. Чтобы убедиться, что FUCCI система работает правильно, проверьте, что управления клетки альтернативное выражение красный и зеленый флуоресцентных белков надлежащим образом от анализа клеток визуализации данных. Клетки управления следует переход от выставке полностью ядерной красной флуоресценцией на выставке полностью ядерной зеленый флуоресценции в интерфазе как клетки прогресс от G1 в S-фазе. Клетки следует продолжать экспонируется зеленый флуоресценции всей завершения митоз. Сразу же после митоз клетки должны еще раз демонстрируют полностью красной флуоресценции в интерфазе.
        Примечание: в то время как существуют методы для количественного определения ППП и GFP интенсивностью флюоресценции из FUCCI системы в одиночных клетках с использованием флуоресцентных следы49, это часто не как изменение цвета флуоресценции является надежной и видимые глазом.
  2. Определить ячейки, арестован в митозе, используя фазово контрастной микроскопии и отслеживать их до тех пор, пока они проходят митотическая проскальзывания, как описано в разделе 3.4 и 3.6.2. Клетки, которые скольжения из митоза и обратно в интерфазе будет меняться от экспонируется зеленой флуоресценцией во время митоза в красной флуоресценцией во время фазы1 G (рисунок 2A- C).
    1. Отслеживайте эти поскользнулся клеток с использованием фазово контрастной и epifluorescent томографии на глаз оценить их судьбу клеток (Рисунок 2D).
      1. Определение ячеек введите клеточного цикла. Эти клетки определяются красно зеленый изменения флюоресценции выражение с использованием системы FUCCI, которая указывает, G1/s перехода (рисунок 2A).
      2. Определение ячеек, которые проходят арест клеточного цикла1 G. Эти клетки определяются выражением красной флуоресценцией, которая сохраняется для > 24 h (рис. 2B).
      3. Определение ячеек, которые умирают в интерфазе. Эти клетки определяются клетки разрыв/блеббинг/сжатие с использованием фазово контрастной визуализации (рис. 2 c).

5. видео анализ для определения частоты ядерная оболочка разрыв

  1. Использование ПЭС-1 клетки, выражая H2B-GFP и TDRFP-NLS оценить ядерная оболочка разрыв. В дополнение к фазово контрастной визуализации, приобрести красной флуоресценцией (TRITC) и зеленая флуоресценция (FITC) изображения. Приобрести изображения каждые 5 минут, чтобы визуализировать разрыв.
    Примечание: Очень важно для создания клеточных линий, в которых TDRFP-NLS эффективно импортированы в ядре с минимальными цитоплазматических флуоресценции.
  2. Изображение клетки, как описано в шаге 3.3 через 3.4. TDRFP-NLS флуоресценции сигнал и H2B-GFP совместно необходимо локализовать в интерфазе. После митоз (как визуализированное клеткой округления с помощью этапа Оптика и/или хромосома конденсации, H2B-GFP), ядерная оболочка будет ломаться и TDRFP-NLS сигнал станет цитоплазмы (рис. 3A). После митоз ядерная оболочка будет реформировать в клетках дочь и TDRFP-NLS сигнал станет ядерной.
  3. Отслеживать клетки дочи на протяжении последующих интерфаза клеток. Определите события ядерного разрыва путем наблюдения переходных взрыв ядерной локализации TDRFP-NLS в окружающих цитоплазму. В течение нескольких минут ядерная оболочка будет восстановлен и TDRFP-NLS будет relocalized в ядро (рис. 3A).
    Примечание: Часто, ядерной ДНК, как визуализированное H2B-GFP, будут рассматриваться выступать за пределами сайта разрыв как небольшой пузырь.
  4. Оценка часть ядра, которые проходят событие разрыв в интерфазе. Оценка этой фракции, подсчитать количество ячеек, которые проходят разрыв событий за общее количество клеток считано.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Используя протокол, описанных выше, ПЭС-1 клетки, выражая H2B-ГФП были относиться с анти митотическая или транспортного средства управления (ДМСО) и анализируемой клеток. Анализ показал, что 100% контроля митотическая ПЭС-1 клеток инициировал остановку анафазы в среднем 22 мин после ввода митоз (Рисунок 1A, 1 D). Напротив ПЭС-1 клетки лечат паклитаксел выставлены глубокие митотическая арест, продолжая несколько часов (рис...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Наиболее важным аспектом долгосрочной клеток изображений является обеспечение здоровья изображаемого ячейки. Важно, что клетки подвергаться минимальным посторонних экологических раздражители, такие нестандартные условия относительно температуры, влажности или CO2 уровней. Также важно ограничить фотоповреждения от освещения люминесцентных возбуждения, как изображений стресс, как известно, влияют на поведение ячейки50. Ограничение фотоповреждения можно добиться несколькими способами, как ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

AFB, МАВ и NJG хотели бы поблагодарить Райан Quinton для комментариев на рукописи и Адриан Салическая для конструкции TDRFP-NLS. AFB и МАВ финансируются NIGMS биомолекулярных фармакологии обучения Грант 5T32GM008541. NJG является членом Шамин и Ашраф Даходе груди Рак научно-исследовательских лабораторий и поддерживается NIH грантов GM117150 и CA-154531, Карин Грюнебаум фонд, Смит семьи награды программа, программа ученых Searle и меланома исследований Альянс.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
фенол не содержит красных, DMEM:F12 mediaHycloneSH3027202
10% фетальной бычьей сыворотки (FBS)Gibco10438026
100 МЕ/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина.Gibco15070063
PBSGibco10010049
0,25% трипсина/ЭДТАGemini50-753-3104
12-луночная чашка для визуализации со стеклянным дномCellvisP12-1,5H-N
PaclitaxelTSZ ChemRS036
Диметилсульфоксид (ДМСО)SigmaNC0215085
окружающей среды КамераIn Vivo Scientific
5% CO2AirZ03NI7432000201
15 мл Конические пробиркиFisherbrand05-539-12
10 см Планшеты для культуры тканей из полистиролаFalcon08772E
10 мл Одноразовая серологическая пипеткаFisherbrand4488
5804R 15 ампер ЦентрифугаEppendorf97007-370
1000 микролитров ПипеткаGilsonPipetman Classic
20 микролитров ПипеткаGilsonPipetman Classic
p1000 Наконечники для пипетокSharpp1126
p20 Наконечники для пипетокSharpP1121
RPE-1 CellsATCCCRL-4000
Инкубатор Galaxy 170SEppendorfCO17011005
Пипетка МальчикIntegra156401
ГемацитометрFisher Scientific0267110
Nikon Ti-E-PFS Инвертированный микроскоп для визуализации живых клетокMicro Video Instruments, Inc.
Предыдущая система X-Y Stage и светодиодный осветитель белого светаMicro Video Instruments, Inc.500-H117P1N4
Предыдущий контроллер Proscan 3 XYZ с кодировщикамиMicro Video Instruments, Inc.500-H31XYZE
Andor Digital CameraMicro Video Instruments, Inc.D10NLC
Nikon NIS Elements AR SoftwareMicro Video Instruments, Inc.
Светодиодный осветитель SOLA для флуоресцентныхмикровидеоприборов, Inc.Климатическая камера SOLA-E
InVivo с контролем потока CO2Micro Video Instruments, Inc.Ti-IVS-100
Ti-ND6-PFS Моторизованный револьвер с идеальным фокусомMicro Video Instruments, Inc.
Система Ti-C Револьверная башняMicro Video Instruments, Inc.
Линзовый блок Ti-C lwd lwd для системной конденсаторной турелиMicro Video Instruments, Inc.
Te-C LWD Ph1 ModuleMicro Video Instruments, Inc.
CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mmMicro Video Instruments, Inc.
CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM ObjectiveMicro Video Instruments, Inc.
MEA53100MQS31000MEP59391MEL51000MEL56200MEH41100MRH10101MRH48230

Ссылки

  1. van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 76 (6), 1101-1112 (2015).
  2. Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death Dis. 3, e411(2012).
  3. Jackson, J. R., Patrick, D. R., Dar, M. M., Huang, P. S. Targeted anti-mitotic therapies: can we improve on tubulin agents? Nat Rev Cancer. 7 (2), 107-117 (2007).
  4. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J Cell Sci. 122 (Pt 15), 2579-2585 (2009).
  5. Rieder, C. L., Maiato, H. Stuck in division or passing through: what happens when cells cannot satisfy the spindle assembly checkpoint. Dev Cell. 7 (5), 637-651 (2004).
  6. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14 (2), 111-122 (2008).
  7. Huang, H. C., Mitchison, T. J., Shi, J. Stochastic competition between mechanistically independent slippage and death pathways determines cell fate during mitotic arrest. PLoS One. 5 (12), e15724(2010).
  8. Shi, J., Orth, J. D., Mitchison, T. Cell type variation in responses to antimitotic drugs that target microtubules and kinesin-5. Cancer Res. 68 (9), 3269-3276 (2008).
  9. Ganem, N. J., Pellman, D. Limiting the proliferation of polyploid cells. Cell. 131 (3), 437-440 (2007).
  10. Ganem, N. J., Storchova, Z., Pellman, D. Tetraploidy, aneuploidy and cancer. Curr Opin Genet Dev. 17 (2), 157-162 (2007).
  11. Ganem, N. J., Pellman, D. Linking abnormal mitosis to the acquisition of DNA damage. J Cell Biol. 199 (6), 871-881 (2012).
  12. Sotillo, R., Schvartzman, J. M., Socci, N. D., Benezra, R. Mad2-induced chromosome instability leads to lung tumour relapse after oncogene withdrawal. Nature. 464 (7287), 436-440 (2010).
  13. Sotillo, R., et al. Mad2 overexpression promotes aneuploidy and tumorigenesis in mice. Cancer Cell. 11 (1), 9-23 (2007).
  14. Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).
  15. Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4 (8), e6564(2009).
  16. McGuire, W. P., et al. Cyclophosphamide and Cisplatin Compared with Paclitaxel and Cisplatin in Patients with Stage III and Stage IV Ovarian Cancer. New England Journal of Medicine. 334 (1), 1-6 (1996).
  17. McGuire, W. P., et al. Taxol: a unique antineoplastic agent with significant activity in advanced ovarian epithelial neoplasms. Ann Intern Med. 111 (4), 273-279 (1989).
  18. Ettinger, D. S. Taxol in the treatment of lung cancer. J Natl Cancer Inst Monogr. (15), 177-179 (1993).
  19. Weaver, B. A. How Taxol/paclitaxel kills cancer cells. Mol Biol Cell. 25 (18), 2677-2681 (2014).
  20. Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat Rev Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
  21. Wall, M. E., Wani, M. C. Camptothecin and Taxol: Discovery to Clinic-Thirteenth Bruce F. Cain Memorial Award Lecture. Cancer Research. 55 (4), 753-760 (1995).
  22. Schiff, P. B., Horwitz, S. B. Taxol stabilizes microtubules in mouse fibroblast cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (3), 1561-1565 (1980).
  23. Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Curr Biol. 22 (22), R966-R980 (2012).
  24. Musacchio, A. The Molecular Biology of Spindle Assembly Checkpoint Signaling Dynamics. Curr Biol. 25 (20), R1002-R1018 (2015).
  25. Uetake, Y., et al. Cell cycle progression and de novo centriole assembly after centrosomal removal in untransformed human cells. J Cell Biol. 176 (2), 173-182 (2007).
  26. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
  27. Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).
  28. Gu, J., et al. Cell cycle-dependent regulation of a human DNA helicase that localizes in DNA damage foci. Mol Biol Cell. 15 (7), 3320-3332 (2004).
  29. Easwaran, H. P., Leonhardt, H., Cardoso, M. C. Cell cycle markers for live cell analyses. Cell Cycle. 4 (3), 453-455 (2005).
  30. Hahn, A. T., Jones, J. T., Meyer, T. Quantitative analysis of cell cycle phase durations and PC12 differentiation using fluorescent biosensors. Cell Cycle. 8 (7), 1044-1052 (2009).
  31. Bajar, B. T., et al. Fluorescent indicators for simultaneous reporting of all four cell cycle phases. Nat Methods. 13 (12), 993-996 (2016).
  32. Gekara, N. O. DNA damage-induced immune response: Micronuclei provide key platform. J Cell Biol. 216 (10), 2999-3001 (2017).
  33. Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nat Rev Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
  34. Crasta, K., et al. DNA breaks and chromosome pulverization from errors in mitosis. Nature. 482 (7383), 53-58 (2012).
  35. Hatch, E. M., Fischer, A. H., Deerinck, T. J., Hetzer, M. W. Catastrophic nuclear envelope collapse in cancer cell micronuclei. Cell. 154 (1), 47-60 (2013).
  36. Maciejowski, J., Li, Y., Bosco, N., Campbell, P. J., de Lange, T. Chromothripsis and Kataegis Induced by Telomere Crisis. Cell. 163 (7), 1641-1654 (2015).
  37. Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522 (7555), 179-184 (2015).
  38. Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
  39. Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352 (6283), 359-362 (2016).
  40. Bernhard, W., Granboulan, N. THE FINE STRUCTURE OF THE CANCER CELL NUCLEUS. Exp Cell Res. 24 (Suppl 9), 19-53 (1963).
  41. de Noronha, C. M., et al. Dynamic disruptions in nuclear envelope architecture and integrity induced by HIV-1 Vpr. Science. 294 (5544), 1105-1108 (2001).
  42. Vargas, J. D., Hatch, E. M., Anderson, D. J., Hetzer, M. W. Transient nuclear envelope rupturing during interphase in human cancer cells. Nucleus. 3 (1), 88-100 (2012).
  43. Sieprath, T., Darwiche, R., De Vos, W. H. Lamins as mediators of oxidative stress. Biochem Biophys Res Commun. 421 (4), 635-639 (2012).
  44. Mitchison, T. J., Pineda, J., Shi, J., Florian, S. Is inflammatory micronucleation the key to a successful anti-mitotic cancer drug? Open Biol. 7 (11), (2017).
  45. Shenk, E. M., Ganem, N. J. Generation and Purification of Tetraploid Cells. Methods Mol Biol. 1413, 393-401 (2016).
  46. Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. J Vis Exp. (115), (2016).
  47. Salmon, E. D., Canman, J. C. Proper alignment and adjustment of the light microscope. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 4 Unit 4 1 (2001).
  48. Cole, R. Live-cell imaging. Cell Adh Migr. 8 (5), 452-459 (2014).
  49. Burke, R. T., Orth, J. D. Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics. J Vis Exp. (111), (2016).
  50. Douthwright, S., Sluder, G. Live Cell Imaging: Assessing the Phototoxicity of 488 and 546 nm Light and Methods to Alleviate it. J Cell Physiol. 232 (9), 2461-2468 (2017).
  51. Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
  52. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nat Biotechnol. 34 (11), 1137-1144 (2016).
  53. Jones, T. R., et al. Scoring diverse cellular morphologies in image-based screens with iterative feedback and machine learning. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (6), 1826-1831 (2009).
  54. Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nat Cell Biol. 5 (3), 255-260 (2003).
  55. Bekker-Jensen, S., Lukas, C., Melander, F., Bartek, J., Lukas, J. Dynamic assembly and sustained retention of 53BP1 at the sites of DNA damage are controlled by Mdc1/NFBD1. J Cell Biol. 170 (2), 201-211 (2005).
  56. Loewer, A., Batchelor, E., Gaglia, G., Lahav, G. Basal dynamics of p53 reveal transcriptionally attenuated pulses in cycling cells. Cell. 142 (1), 89-100 (2010).
  57. Lekshmi, A., et al. A quantitative real-time approach for discriminating apoptosis and necrosis. Cell Death Discovery. 3, 16101(2017).
  58. Jullien, D., Vagnarelli, P., Earnshaw, W. C., Adachi, Y. Kinetochore localisation of the DNA damage response component 53BP1 during mitosis. J Cell Sci. 115 (Pt 1), 71-79 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Лечение паклитакселомоценка судьбы клетокмитотический слиппейджразрыв ядерной оболочкисистема FUCCIмаркировка H2B-GFPфазово-контрастная микроскопиядолгосрочная визуализацияанализ единичных клеток
Долгосрочный клеток изображений для оценки судьбу клеток в ответ на паклитаксел
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.