Этот протокол описывает метод простой и удобный ярлык и визуализировать Живые хромосомы митотическая клеток Histone2B-GFP BacMam 2.0 label и система конфокальной микроскопии диск спиннинг.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Живые клетки изображений сегрегации хромосом в процессе митоза
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Хромосомы должны быть надежно и равномерно делятся на клетки дочи процессе митотического деления клетки. Верность хромосомных сегрегации управляется несколько механизмов, которые включают шпиндель контрольно-пропускного пункта Ассамблея (SAC). SAC является частью сложной обратной связи системы, которая отвечает за предотвращение клетки прогресса путем митоза если все хромосомных kinetochores придают шпинделя микротрубочек. Хромосомная отстающих и аномальные хромосомы сегрегация является показателем неблагополучных клеточного цикла управления контрольно-пропускных пунктов и может использоваться для измерения геномная стабильность делящихся клеток. Дерегулирование мешка может привести к трансформации нормальной клетки в злокачественных клеток путем накопления ошибок при хромосомных сегрегации. Осуществление SAC и формирование комплекса Кинетохор жестко регулируются взаимодействия между киназы и фосфатазы например фосфатазы Протеин 2A (PP2A). Этот протокол описывает изображений живой клетки отстает хромосом в мыши эмбриональных фибробластов, изолированные от мышей, которые были нокаут Субблок регулирования PP2A-B56γ. Этот метод преодолевает недостатки других клеточного цикла управления методы визуализации как проточной цитометрии или immunocytochemistry только обеспечивают моментальный снимок статуса цитокинез клетки, вместо динамического пространственно-временных визуализации хромосом в процессе митоза.
Введение
В следующий протокол мы описываем удобный метод для визуализации хромосомных сегрегации и митотического прогрессии во время клеточного цикла в эмбриональных фибробластов мыши с помощью гистона 2B-GFP, BacMam 2.0 маркировки и живых клеток.
Клеточный цикл контрольно-пропускных пунктах контролировать хромосома сегрегации и играют важную роль в поддержании генетических целостность клеток в 1,2,3. Накопление неправильного сегрегированных хромосом может привести к анеуплоидии, который является отличительной чертой наиболее твердые туморы
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты, проведенные в этих исследованиях были выполнены в соответствии с протоколами, утвержденных институциональный уход животных и использования Комитетом на объекте исследований продовольственной и лекарствами (FDA).
1. изоляция и культура мыши эмбриональных фибробластов (MEFs)
- Изолируйте мыши эмбриональных фибробластов (MEFs) от PP2A-B56γ-мышь штамм и дикого типа однопометники, стандартный протокол 7,8,9.
- ExpandMEFs для 3 проходов, заморозить и хранить до тех пор, пока необходимые для экспериментов
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
MEFs от дикого типа и PP2A-B56γ-мышей были посеяны в стакане крышки камеры 2-Ну и разрешено присоединить. На 2 день, MEFs были синхронизированы с помощью 0,1% FBS за 24 ч. День 3, MEFs в СМИ с 200 нг/мл Нокодазол и 30 КПП CL-HB regentwere инкубированы для 18 h 37° C и 5% CO2. День 4 клетки были образы с помощью системы Конфокальный микроскоп вращающийся диск (рис. 1). Live клеток была использована для визуализации судьбы отдельных ячеек,.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Клеточный цикл управления контрольно-пропускные пункты, которые обеспечивают точные хромосома сегрегации предотвратить анеуплоидии и ячейки преобразования 1,2,3. В настоящем исследовании, мы обнаружили, что инактивирование PP2A-B56γ привело к контрольной сборки ослабленной шпинделя. Живых клеток позволил нам наблюдать что хромосомных неправильного сегрегации во время митоза в PP2A-B56γ MEFs относился с Нокодазол
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить доктора Хунг го-Chiuan и д-р Bharatkumar Джоши за ценные замечания, которые улучшили рукопись.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | Gibco | 11320082 | |
| L-глутамин | Gibco | 25030081 | |
| раствор заменимых аминокислот MEM (100X) | Gibco | 11140050 | |
| пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл) | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco' s Фосфатный буферный раствор | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMSO | EMD Millipore | MX 1458-6 | |
| Криогенные флаконы | для хранения Fisherbrand | 10-500-28 | |
| Криогенные флаконы | Corning/costar | 431416 | |
| Колбы T75 | Cellstar | 658175 | |
| 2 хорошо камерные покровные стекла | Nunc | 155380PK | |
| Cellometer Vision Cell Profiler | Nexcelom Bioscience LLC | Cellometer Vision Trio | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher Scientific Inc. | C10594 | |
| Zeiss Cell Observer Вращающийся диск Конфокальный микроскоп система | Carl Zeiss Микроскопия | Zeiss Cell Observer SD | |
| Водяная баня | Thermoscientific | 280 series | |
| Инкубатор | Sanyo коммерческие решения | MCO-18AIC (UV) | |
| Класс II Шкаф биологической безопасности | The Baker Company | SterilGard | |
| Программное обеспечение Axiovision | Zeiss | Ver.4.8.2 | |
| программное обеспечение ImageJ Национальный | институт здравоохранения | Ver. 1.51r |
Ссылки
- Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression. Dev Cell. 39, 638-652 (2016).
- Etemad, B., Kops, G. J. Attachment issues: kinetochore transformations and s....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
