Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Молекулярные томография флуоресценции для изображений в Vivo ксенотрасплантатов глиобластомы

8.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57448

⸱

26 апреля 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Ludwig Institute for Cancer Research, 2Moores Cancer Center, School of Medicine, University of California, San Diego, 3Department of Pathology, School of Medicine, University of California, San Diego, 4Department of Medicine, School of Medicine, University of California, San Diego

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Внутричерепных инъекций ортотопическая опухолевых клеток был использован в исследовании рака учиться биология опухоли мозга, прогрессии, эволюция и терапевтические реакции. Здесь мы представляем флуоресценции молекулярной томография ксенотрасплантатов опухоль, которая обеспечивает реального времени прижизненной визуализации и количественная оценка опухоль массы в доклинических глиобластома модели.

Аннотация

Tumorigenicity — это возможность раковых клеток сформировать опухоль массы. Широко используется подход, чтобы определить, если клетки онкогенной — путем инъекций иммунодефицитных мышей подкожно с раковые клетки и измерения массы опухоли после того, как она становится видна и ощутима. Инъекции ортотопическая раковых клеток цель представить ксенотрансплантата в микроокружения, который наиболее близко напоминает ткани происхождения опухоли изучается. Исследования рака мозга требует внутричерепных инъекции раковых клеток, чтобы позволить образования опухоли и анализа в уникальных микроокружения мозга. В естественных условиях изображений внутричерепных ксенотрасплантатов контролирует мгновенно масса опухоли orthotopically прижившимися мышей. Здесь мы приводим использование флуоресценции молекулярной томография (ДРМ) ксенотрасплантатов опухоль мозга. Раковые клетки сначала преобразованы с вблизи инфракрасного флуоресцентных белков и затем вводят в головном мозге мышей, с ослабленным иммунитетом. Животные, затем сканируются для получения количественной информации о опухоль массы течение длительного периода времени. Клетки предварительно маркировки позволяет экономически эффективной, воспроизводимые и надежной количественной оценки бремени опухоли в пределах каждой мыши. Мы устранить необходимость для инъекций изображений субстраты и таким образом сократить нагрузку на животных. Ограничение этого подхода представляет невозможность обнаружения очень малых масс; Однако она имеет лучшее разрешение для больших масс, чем другие методы. Он может применяться для оценки эффективности лечения наркомании или генетические изменения линий клеток глиомы и пациент, полученных образцов.

Введение

Рак является одной из ведущих причин смертей, связанных с болезнью, в людей в промышленно развитых странах. С чрезвычайно высокой погибших срочно необходимы новые методы лечения. Глиобластомы мультиформной (GBM) является чрезвычайно смертоносного тип рака мозга, состоящий из разнородных популяций мозга опухоль, стромы и иммунных клеток. Согласно реестра Центральный мозг опухоль из США частота первичных злокачественных и доброкачественных опухолей головного мозга составляет около 22 случаев на 100 000 живорождений. Ожидается, что примерно 11 000 новых случаев диагностируется в США в 2017 году1.

Доклинические исследования изучить вероятность наркотиков, процедуры или лечение эффективным до начала испытаний на людях. Одним из первых шагов лаборатории в доклинических исследованиях является идентификация потенциальных молекулярных целей на лечение с помощью раковые клетки, имплантированные в организме хозяина, определяется как человека ксенотрансплантата модели. В этом контексте внутричерепной мозга опухоль ксенотрансплантата модели с помощью пациент производные ксенотрасплантатов (PDXs) широко использовались для изучения биология опухоли мозга, прогрессии, эволюция и терапевтического ответа и совсем недавно для развития биомаркеров, наркотиков скрининг и персональной медицины2,3,4.

Один из наиболее доступных и неинвазивные в vivo imaging методы мониторинга внутричерепных ксенотрасплантатов является биолюминесценции изображений (BLI)5,6,,78. Однако некоторые ограничения BLI включают субстрата администрации и доступности, стабильность фермента, закалки и рассеяния во время визуализации приобретение9. Здесь мы приводим инфракрасный ДРМ как альтернативу визуализации метод мониторинга доклинические глиобластома модели. В этот метод, приобретение сигналов и количественной оценки интракраниально имплантированных PDXs, выражая ближней ИК-области флуоресцентный белок iRFP72010,11 (отныне называются FP720) или turboFP635 (отныне называются FP635), выполняется с ДРМ изображений системы. Используя технологию FMT, ортотопическая, опухоли могут быть мониторинг в естественных условиях до, во время или после лечения, неинвазивный, субстрат бесплатно и количественные образом для доклинических наблюдений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Использование экспериментальных исследований животных и инфекционных агентов, таких как человека передавать раковые клетки, требует предварительного одобрения программой институционального ухода за животными и институциональных биобезопасности Комитета. Этот протокол следует правилам ухода за животными в университете Калифорнии Сан-Диего (UCSD).

1. Маркировка клеток глиобластомы с FP635 или FP720 конструкции

  1. Производить и очищают человека согласно протоколу, характеризуется Tiscornia и др. 12
  2. Культуры приблизительно 2.0 x 106 клеток от линии клеток глиомы человека с DMEM плюс 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) в 15-см блюдо; или культуры 2.0 x 106 человека глиобластома пациента производные (GBM-PDX) сферах с DMEM/F12 средний 1:1 с B27 дополнение плюс человеческого рекомбинантного эпидермального фактора роста (EGF; 20 нг/мл) и ФБП (10 нг/мл) в колбе T75.
  3. Сохранить все клетки при 37 ° C, 5% CO2и 100% относительной влажности.
  4. Разбить ячейки.
    1. Для клеток глиомы: удалить супернатант из пластин и добавление 3-5 мл трипсина 1 X клеток глиомы.
    2. Для GBM сфер: собирать клетки, закупорить клетки в 15 мл.
      1. Спин вниз GBM сферах на 200 x g 5 минут с помощью настольной центрифуги при комнатной температуре.
      2. Удалить супернатант и добавить 3-5 мл раствора отряд клеток.
    3. Инкубируйте все клетки при 37 ° C на 10-15 мин.
  5. Осторожно отделить клетки, закупорить вверх и вниз несколько раз (обеспечить завершение сферах и клеток глиомы отделить) и спином вниз на 200 x g за 5 мин.
  6. Удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки с 5 мл среды, закупорить вверх и вниз несколько раз. Трипановый синий исключения определите жизнеспособность клеток.
  7. Пластина 1.0 x 106 клеток-мишеней в 10 см блюдо с 5 мл среды, закупорить.
  8. Передают клетки с человека, выражая флуоресцентных белков на обилие инфекции (МВД) 5, как это описано в Tiscornia et al. 12 и Инкубируйте на 37 ° C.
  9. После 24 часов извлеките носитель из transduced клеток, добавить 5 мл свежих средних и проинкубируйте дополнительных 48 ч при 37 ° C.
  10. Отделить инфицированных клеток в одну ячейку подвеска как описано в шагах 1.4-1.6. Спин вниз клетки на 200 x g 5 мин и Ресуспензируйте в 500 мкл сортировки решение (фосфат амортизированное saline (PBS) с 1% FBS).
  11. Пипетка суспензию клеток в СУИМ трубы. Совместное пятно клеток в 1 мкл/мл 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) дигидрохлорида исключить мертвые клетки. Негативный контроль требуются для настройки потока цитометр ворота (не преобразованы клетки и клетки, не преобразованы / DAPI stained).
  12. Сортировать люминесцентные положительная/DAPI-отрицательная клетки в сортировка решение, как описано на басу и др. 13и собирать сортировки клеток в 15 мл Конические трубки.
  13. Спин вниз отсортированный клетки на 200 x g 5 минут, удалить супернатант и Ресуспензируйте в 5 мл питательной среды. Семя сортировки клеток в 10 см блюдо, закупорить. Инкубируйте при 37 ° C в течение 48-72 часов.
  14. Разверните узел сортировки клеток путем отделения клетки следующие шаги 1.4-1.6 и покрытие в множественные тарелки для экспериментов в естественных условиях .
    Примечание: Для более подробной информации о ячейке Сортировка водоподготовке и очистке, см. басу и др. 13

2. внутричерепная инъекции в иммунодефицитных мышей с меткой iRFP клеток глиобластомы

Примечание: Перед началом операции, убедитесь, что хирургическое обслуживание и инструменты являются чистыми для процедуры. Используйте иммунодефицитных Атинические ню (нюFoxn1) мужского или женского пола мышей, между 4-5 недель и 17-19 g для внутричерепных инъекции. Животные должны быть размещены по крайней мере 3 дней после прибытия и перед операцией.

  1. Подготовка клетки
    1. Урожай и разъединять флуоресцентные положительный глиомы клетки в одну ячейку подвеска (шаги 1.4-1.6) и Ресуспензируйте 0,5 или 1,0 x 106 клеток в 2-5 мкл PBS на инъекцию за животное. Пипетка суспензию клеток в 1,5 мл microcentrifuge трубки и место на льду.
  2. Подготовка анестезии и администрация
    1. Подготовка 200 мкл солевой раствор, содержащий кетамин (100 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) на 20 грамм веса тела мыши. Вес животных и рассчитать соответствующие дозу наркоза.
    2. Предоставить внутрибрюшинной инъекции анестезии и применить глазной мази в глаза, чтобы избежать обезвоживания. Для более подробной информации об этом шаге см Кэтлин и др. 14 место животное на площадку тепловой подогретым воды 37 ° c.
    3. Проверьте, что животные находятся под наркозом путем наблюдения за мыс щепотку ответ (педаль рефлекс), обычно в течение 5-10 мин.
  3. Внутричерепных инъекций
    1. Загрузить 5 мкл Гамильтон шприца (тупой кончик иглы) с суспензию клеток и горе в держатель зонда.
    2. Поместите указатель мыши в небольших животных стереотаксической рамы и исправить головку с помощью уха баров и резца адаптер после описанных детали Четин et al. 15
    3. Лечить голову с 70% этанола и Бетадин решения. Убедитесь, что хирургическое сайта является стерильной. Выполните среднего разрез с небольшой скальпелем и отдельные кожи и соединительной ткани.
    4. Поместите шприц Гамильтон на bregma точки с использованием микроманипулятор.
    5. Переместите зонд переднезаднем держатель 1,0 мм и 2.0 мм бокового от точки bregma. Марк эту позицию с карандашом.
    6. В этом месте тщательно сделайте отверстие в черепа ручной дрелью микромотор, применяя небольшое давление вниз до тех пор, пока кровеносные сосуды становятся видимыми. Не нарушать паутинной матер и мозг паренхимы.
    7. Ввести иглу в отверстие заусенцев и заранее 3,0 мм ниже поверхности сетчаточных.
    8. Настройка громкости (2-5 мкл) и скорость потока (1 мкл/мин) с использованием моторизованных стереотаксического инжектора впрыска или вручную выполнить инъекции.
    9. После инъекции удалите иглу постепенно по возрастанию 1,0 мм каждый 1 мин и очистить место инъекции с 70% этиловом спирте.
    10. Закройте кожи раны с хирургической скобы или делая хирургические нити (часто упоминается как швы) и увидеть Кэтлин и др. 14 для получения более подробной информации.
  4. Животных восстановления
    1. Передать животное воды теплопроводящая прокладка (37 ° C) и мониторинг температуры тела, частоты дыхания и пульса, до полного выздоровления. Администрировать анальгезии в стандартные протоколы.
      Примечание: Дополнительные сведения о процедуре стереотаксической хирургии и координаты, увидеть другие доклады по5,14,15.

3. ДРМ изображений

Примечание: По данным экспериментальных целях, iRFP тегами глиобластома, что клетки могут быть мониторинг в естественных условиях до, во время или после лечения. Для визуализации цели, анестезировать животных, используя камеру индукции изофлюрановая, поддерживать в изображений кассету во время сканирования и изображение в док-станции ДРМ томографа.

  1. Удаление животное из клетки и место в зале индукции изофлюрановая. Закрыть камеру и включите потока кислорода и испарителя до 3-5%.
  2. Мониторинг животных до тех пор, пока он полностью под наркозом, обычно в течение 1-2 мин бессознательного животных следует не реагировать на внешние раздражители.
  3. Удаление наркотизированных животных из камеры и положить животное в изображений кассету, во-первых, поместив голову адаптер следуют размещения животное вниз. Убедитесь, что голова расположен в центре кассеты.
  4. Поместите верхнюю крышку кассеты на вершине и затяните регулировочные ручки до 17 мм.
  5. Однажды, что животное является безопасным в изображений кассету, переходите к томографии, вставив кассету в внутренней док-станции по ДРМ томографа, где изофлюрановая закачивается держать животное под наркозом.
  6. Запустите программное обеспечение тепловизор и анализатор, дважды щелкнув значок программного обеспечения.
  7. В окне «Экспериментальная вкладке» выберите «База данных» и «Исследовательская группа».
  8. Перейдите в окно «Закладка» и выберите тему для изображения, нажав кнопку «Выбрать тему». Кроме того выберите лазерный канал на панели «Лазерный канал». Для FP635-меченых ячеек выберите «лазерный канал 635 нм» и для FP720-меченых ячеек, выберите «лазерного канала 680 нм».
  9. Получить изображение, выбрав параметр «Захват» в окне «Закладка». Затем отрегулируйте поля сканирования, нажав и перетащив поля сканирования в образ на определенное количество расположения источника, обычно в течение 20-25 источников на ипсилатеральной стороне.
  10. Установите флажок «Добавить в очередь реконструкции» и нажмите «Сканировать» в окне «Закладка».
  11. Дождитесь завершения сканирования и затем удалите изображений кассету из док-станции.
  12. Снимите верхнюю крышку кассеты и место животных обратно в клетке.
  13. Повторите шаги 3.1-3.12 для остальных животных.

4. анализ

  1. Тепловизор и анализатор программного обеспечения выберите окно «Анализ вкладки».
  2. Загрузка набора данных и предметом анализа, нажав кнопку «+» в панели «Выбор набора данных» окна «Анализ вкладки».
  3. После загрузки изображения в окне «Анализ вкладка» выполните региона интерес (ROI) анализа, выбрав значок эллипсоид, расположенный в верхнем левом углу окна «Анализ вкладки».
  4. Отрегулируйте порог до нуля в панели «статистические данные», щелкнув правой кнопкой мыши столбец «порог» в окне «Анализ вкладка».
  5. Общая стоимость в панели «Статистические данные» представляет сигнал от клеток глиобластомы люминесцентной меткой, имплантированных в мозг мыши.
  6. Повторите шаги с 4.2-4.4 для остальных животных. Загрузить или удалить новый предмет, нажав кнопку «+» или кнопку «−», соответственно, на панели «Выбор набора данных» окна «Анализ вкладки».
    Примечание: Дополнительные сведения о ДРМ изображений и программного обеспечения операции, см20.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Глиобластома клетки U87EGFRvIII (клетки U87 чрезмерно выражая EGF рецептор вариант III) были культивированный согласно шаг 1.2. Лентивирусы был подготовлен и очищенный согласно шагу 1.1. Вирусная концентрация определяется p24 анализа ELISA. Клетки были преобразованы с человека, перевозящих инфракрасный флуоресцентные белки согласно шаг 1.8. Плазмиды, кодирование FP72010,11 любезно предоставленных доктор в.в. Верхушей и FP635 векто...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Опухоль ксенотрасплантатов широко использовались в раковых исследований и разработан ряд устоявшихся методов обработки изображений: BLI; Магнитно-резонансная томография (МРТ); Позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ), компьютерная томография (КТ); ДРМ. Каждый из этих подходов поставляется с плюсы и минусы, но в конечном итоге дополняют друг друга с типом информации. Одним из наиболее часто используемых в vivo imaging технологии является BLI5,6,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют не конфликты интересов.

Благодарности

Мы благодарим д-р Фредерик Lang, MD Anderson Cancer Center для GBM-PDX-neurospheres. Эта работа была поддержана поражение GBM исследований совместное, филиал Национального мозга опухоль общества (Frank Furnari), R01-NS080939 (Frank Furnari), Джеймс S. McDonnell фонд (Frank Furnari); Хорхе Бенитес был поддержан награду от Американской ассоциации опухоли мозга (ABTA); Ciro Zanca частично поддерживается докторантура стипендий американский-итальянский фонд рака. Фрэнк Furnari получает зарплату и дополнительную поддержку от Института Людвига для исследований рака.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEM/Высокий уровень глюкозы HyClone/GESH30022.1
DMEM/F12 1:1 Gibco11320-082
FBSHyClone/GESH30071.03
АккутазаИнновационные клеточные технологииAT-104
ТрипсинHyClone/GESH30236.01
B27 ДобавкаGibco17504044
человеческий рекомбинантный EGF Stemcell Technologies2633
человеческий рекомбинантный FGFStemcell Technologies2634
DPBSCorning21-031-00
FACS tubesFalcon352235
DAPIThermoFisher Scientific62248
BlasticidinThermoFisher ScientificA1113903
стр. 24 ИФА Clontech632200
КсилазинAkornNDC 59399-110-20
КетаминZoetisNADA 043-403Контролируемое вещество
МазьDechronNDC 17033-211-38
Рассасывающийся шовный материалCpMedicalVQ392
5 мкл шприцHamilton26200-UКаталожный номер по продаже Sigma-Aldrich
Cell SorterSonySH8007
Мышь стереотаксическая рамка Stoelting51730
Моторизованный стереотаксический инжекторStoelting53311
Микромоторная ручная дрельForedomK1070
Подогреватель мыши Ken Scientific CorporationTP-22G
Система флуоресцентной томографии PerkinElmerFMT 2500 XL
TrueQuant Перкин Элмер 
Ультрацентрифуга Optima L-80 XPBeckman Coulter392049
Тарелка для тканевых культур 100 мм OlympusPlastics25-202
Тарелки для тканевых культур 150 мм OlympusPlastics25-203
Колбы для тканевых культур T75Corning430720U
50 мл конические пробиркиCorning430290
15 мл конические пробиркиOlympus Plastics28-101
Центрифуга Avanti J-20Beckman CoulterJ320XP-IM-5
Tube, полипропилен, тонкостенная, 5,0 млBeckman Coulter326819
Tube, тонкостенная, полипропилен, 38,5 мл, 25 x 89 ммBeckman Coulter326823
Athymic nude мышиCharles River LaboratoriesКод штамма  490 (Гомозиготный)Требуется предварительное одобрение Программы институционального ухода за животными и Институционального комитета по биобезопасности.    
Программное обеспечение для визуализации 7005319

Ссылки

  1. Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS Statistical Report: Primary Brain and Other Central Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2009-2013. Neuro-Oncology. 18 (suppl_5), v1-v75 (2016).
  2. Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
  3. Stewart, E. L., et al. Clinical Utility of Patient-Derived Xenografts to Determine Biomarkers of Prognosis and Map Resistance Pathways in EGFR-Mutant Lung Adenocarcinoma. Journal of Clinical Oncology. 33 (22), 2472-2480 (2015).
  4. Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nat Med. 21 (11), 1318-1325 (2015).
  5. Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), e1986(2010).
  6. Kondo, A., et al. An experimental brainstem tumor model using in vivo bioluminescence imaging in rat. Child's Nervous System. 25 (5), 527-533 (2009).
  7. Nyati, S., Young, G., Ross, B. D., Rehemtulla, A. ATM Kinase: Methods and Protocols. Kozlov, S. V. , Springer. New York. 97-111 (2017).
  8. Kondo, A., et al. Longitudinal assessment of regional directed delivery in a rodent malignant glioma model. J Neurosurg Pediatr. 4 (6), 592-598 (2009).
  9. Badr, C. E. Bioluminescent Imaging: Methods and Protocols. Badr, C. E. , Humana Press. 1-18 (2014).
  10. Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat Meth. 10 (8), 751-754 (2013).
  11. Filonov, G. S., et al. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat Biotech. 29 (8), 757-761 (2011).
  12. Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protocols. 1 (1), 241-245 (2006).
  13. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546(2010).
  14. Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. (47), (2011).
  15. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2007).
  16. Benitez, J. A., et al. PTEN regulates glioblastoma oncogenesis through chromatin-associated complexes of DAXX and histone H3.3. Nature Communications. 8, 15223(2017).
  17. Kirschner, S., et al. Imaging of Orthotopic Glioblastoma Xenografts in Mice Using a Clinical CT Scanner: Comparison with Micro-CT and Histology. PLOS ONE. 11 (11), e0165994(2016).
  18. Mannheim, J. G., et al. Standardization of Small Animal Imaging-Current Status and Future Prospects. Molecular Imaging and Biology. , (2017).
  19. Engblom, C., et al. Osteoblasts remotely supply lung tumors with cancer-promoting SiglecFhigh neutrophils. Science. 358 (6367), (2017).
  20. Lauber, D. T., et al. State of the art in vivo imaging techniques for laboratory animals. Laboratory Animals. 51 (5), 465-478 (2017).
  21. Zanca, C., et al. Glioblastoma cellular cross-talk converges on NF-κB to attenuate EGFR inhibitor sensitivity. Genes & Development. 31 (12), 1212-1227 (2017).
  22. Villa, G. R., et al. An LXR-Cholesterol Axis Creates a Metabolic Co-Dependency for Brain Cancers. Cancer Cell. 30 (5), 683-693 (2016).
  23. Liu, F., et al. EGFR Mutation Promotes Glioblastoma through Epigenome and Transcription Factor Network Remodeling. Molecular Cell. 60 (2), 307-318 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Трансдукция клетоксортировка методом проточной цитометриивнутричерепная инъекциямониторинг опухолибелки ближнего инфракрасного диапазонаиммунодефицитные мышитестирование эффективности препаратов
Молекулярные томография флуоресценции для изображений в Vivo ксенотрасплантатов глиобластомы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.