Методическая статья

Оценка коллаген и эластин схемотехнические зависящих от давления в артериях живой, человеческий сопротивления по микроскопии флуоресцирования Label бесплатно

DOI:

10.3791/57451

⸱

9 апреля 2018 г.

 ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular and Renal Research, Institute of Molecular Medicine, University of Southern Denmark, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern Denmark, 3Department of Cardiac, Thoracic and Vascular Surgery, Odense University Hospital

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описать одновременное механическое тестирование и 3D-изображений артериальной стенки изолированных, жить артерий человеческого сопротивления и Фиджи и Ilastik анализа изображения для количественной оценки плотностей эластина и коллагена пространственной организации и объем. Мы обсуждаем использования этих данных в математических моделях артериальной стенки механики.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Патогенные вклад сопротивления артерии ремоделирования документирован в гипертоническая болезнь, диабет и метаболически синдрома. Исследования и разработка microstructurally почве математических моделей для понимания механические свойства человеческого сопротивления артерий в здоровье и болезни имеют потенциал для оказания помощи понимание как болезни и лечение влияет на человека микроциркуляцию. Развивать эти математические модели, важно расшифровать отношения между свойства Механические и микроархитектуры микрососудистой стены. В этой работе мы описываем метод ex vivo для пассивного механических испытаний и одновременное лейбл бесплатно трехмерных изображений микроархитектуры эластина и коллагена в артериальной стенки артерий изолированных человеческое сопротивление. Визуализации протокол может применяться к артерии сопротивления любых видов, представляющих интерес. Анализ изображений описаны для количественной оценки i) давление индуцированные изменения в внутренней упругой пластинки ветвления углов и прямолинейности adventitial коллагена, используя Фиджи и плотности тома ii) коллагена и эластина, определяются с помощью программного обеспечения Ilastik. Желательно все механические и Тепловизионные измерения выполняются на живой, перфузии артерий, однако, альтернативный подход с использованием стандартных видео микроскопия давления миография в сочетании с после фиксации изображений повторно под давлением судов обсудили. Этот альтернативный метод предоставляет пользователям с различными опциями для анализа подходов. Обсуждается включение механических и визуализации данных в математической модели механики артериальной стенки, и предлагается будущего развития и дополнения к протоколу.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Патогенных вклада и воздействия сопротивления артерии ремоделирования описаны в гипертоническая болезнь, диабет и метаболический синдром1,2,3,4,5. Расшифровка отношения между механические и микроархитектуры свойства стенку, Микроваскулярная имеет важное значение для разработки математических моделей этой ассоциации. Такие модели улучшат понимание процесса реконструкции и будет поддерживать развитие в silico модели полезен для тестирования фармакологических стратегии таргетинга болезни ремоделирования артериальной стенки.

Предыдущие исследования были сосредоточены в понимании того, как микроархитектура артериальной стенки относится к артериальной стенки механики, включив механические меры и микроархитектуры внеклеточного матрикса (ECM) выполняются почти исключительно на крупных , артерии упругой трубы от мышей или свиной6,,78,9,10,11. Изображений микроструктур стены обычно выполняется с помощью нелинейных оптических методов, воспользовавшись аутофлюоресценция эластина и второе поколение гармонических коллаген. Это позволяет пространственно-временных изображений двух основных компонентов внеклеточного матрикса, эластин и коллаген, без необходимости для окрашивания. Визуализации артериальной стенки в полной толщине является проблемой в больших каналом артерии из-за рассеяния света в средствах массовой информации толстые туника. Однако чтобы определить, как микроархитектура структурных компонентов артериальной стенки связаны наблюдаемое механических свойств, трехмерные информация должна быть получена в ходе механических испытаний. Для крупных артерий как человека аорты это требует биаксиальные оплетки монтажа, механические испытания и изображений регионов интерес в 1-2 см2 шт артериальной стенки7,9,10, 12. только часть стены могут быть образы и механически испытания.

Для мелких артерий любых видов (например, человеческий перикард13, легочной14 и подкожной15 артерий, крыса верхней брыжеечной артерии16,,1718, 19 , 20, cremaster мыши, брыжеечный, головного мозга, бедренных и сонных артерий21,22,23,24,25,26, 27) изображений всей толщины возможно и может сочетаться с механических испытаний. Это позволяет одновременной записи механических свойств и структурных договоренностей внутри стены. Однако прямой математическое моделирование взаимоотношений между наблюдаемыми изменениями в трехмерной структуры ECM и изменения механических свойств сопротивления артериальной стенки, в меру наших знаний только поступили после Недавно в человеческое сопротивление артерий13,15.

В этой работе описан метод ex vivo для пассивного механических испытаний и одновременное трехмерных изображений микроархитектуры эластина и коллагена в артериальной стенки артерий изолированных человеческое сопротивление. Визуализации протокол может применяться к артерии сопротивления любых видов, представляющих интерес. Анализ изображений описаны для получения мер внутреннего упругой пластинки ветвления углов и adventitial коллагена прямолинейность13 с помощью Фиджи28. Объем плотность коллагена и эластина, определяются с помощью программного обеспечения Ilastik29 , и наконец, обсуждается включение механических и визуализации данных в математических моделях артериальной стенки механики.

Цель описания изображений и изображения анализ методов в сочетании с математическое моделирование заключается в предоставлении следователи системный подход для описания и понять наблюдаемые изменения давления индуцированной в ECM сопротивления артерий. Описан метод ориентирован в количественную оценку изменений в ECM в судно во время наддув, сравнивая структуру ECM в 20, 40 и 100 мм рт.ст.. Эти факторы были выбраны для определения структуры артериальной стенки на его более совместимым (20 mmHg), жесткая (100 мм рт.ст.) и промежуточное состояние (40 mmHg), соответственно. Однако любой процесс в сосудистой стенке артерий живой, включая изменения, индуцированных вазоактивных компонентов, гистерезис и потока, может быть определена количественно, в зависимости от гипотезы исследования вопрос следователя.

Особое внимание уделяется использование микроскопии флуоресцирования возбуждения двух фотонов (TPEM) в сочетании с myograph давления для изучения давления (или других) индуцированного изменения в ECM живой артерий. Во-первых потому что это позволяет одновременное приобретение общей трехмерной структуры артериальной стенки (диаметр и толщина стенки) наряду с трехмерной метки бесплатно приобретение высокого качества, подробные изображения коллагена и эластина схемотехнические как описано13 , воспользовавшись аутофлюоресценция эластина и коллагена второй гармоники поколения сигнала (SHG)30. Во-вторых TPEM позволяет, что допускается использование ближней ИК-области спектра возбуждения низкой энергии света, минимизации повреждений ткани и таким образом, повторяющихся изображений на точно таком же положении в сосудистой стенке, позволяющей повторить измерения анализ наблюдается изменения.

Использование альтернативного подхода с использованием конфокальная томография давления фиксированной артерий обсуждается позволяет пользователям без доступа к TPEM возможность использовать метод описан как хорошо. Информация о плотности структуры и объема ECM можно получать также из двумерный анализ тканей секционного в последовательный порт, например, как описано на31,32. Однако, ввиду отсутствия возможности для получения трехмерных структурную информацию над шкалой длина артерии, а также в ходе изменения условий, с помощью этого метода, это не рекомендуется использовать этот подход для расследования давления и лечения индуцированных трехмерной изменения в ECM.

Минимальным требованием для детектива, чтобы применить метод здесь описано является доступ к установке для катетеризации и герметизация артерий в сочетании с микроскопом конфокальный или два Фотон возбуждения флуоресценции. Установки, описанные в следующий протокол является заказ давления myograph с продольной силы датчика, построен, чтобы поместиться на пользовательские построен Перевернутый двух Фотон возбуждения флуоресценции микроскопа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После письменного согласия, как описано выше33осуществлялся сбор биопсий человека париетальной перикарда для использования в этой работе. Изучение человеческих тканей соблюдать принципы, изложенные в Хельсинкской декларации34 и был одобрен региональных комитетов по этике исследований здоровья для Южной Дании (S-20100044 и S-20140202) и Датского агентства по охране данных.

1. Собирайте ткани и артерии сопротивления изоляции (человека)

  1. Сбор образцов ткани интерес сразу же после иссечения во время хирургии. Передача ткани до 4 ° C HEPES буфер физиологический раствор соли (ОБД) сразу же после сбора и хранить его в ОБД.
    Примечание: Ткани человека собираются только после утверждения соответствующих институциональных и этические комитетам, а также письменного согласия пациентов. HBS композиция в мм: NaCl 144, хлористого калия 4,7, CaCl2 2.5, MgSO4 1.2, KH2PO4 1.2, 14,9 HEPES, глюкоза 5.5. Отрегулируйте рН 7,4 с NaOH и фильтровать решение хотя 0.2 мкм фильтром.
  2. Оставьте собраны ткани в стерильных HBS на 4 ° C на ночь, чтобы промыть анестетиков.
    Примечание: Любое воздействие на ночь хранения на судно целостности и функциональности должен проверяться по отдельным научно-исследовательской лаборатории.
  3. Тщательно изолируйте сопротивления размера артерии (диаметр просвета ± 200 мкм) с помощью пары пинцет острый кончик и микро Рассечение ножницами.
  4. Храните артерии на 4 ° C в ледяной HBS во время грунтовки изображений/барокамеры.

2. Прикрепите изолированных артерии в Myograph давления

  1. Смонтируйте на канюли Держатели стекла канюли с наконечник диаметром ~ 80 мкм. Расположите советы приблизительно 150 мкм выше нижней палаты стекла.
    Примечание: 45° согнутые кончик канюли может разрешить точное позиционирование судна над нижней стекла.
  2. Заполните входе и выходе трубы с ОБД с 1% BSA и подключиться к системе давления.
    Примечание: BSA включена для сохранения функции эндотелиальных клеток.
  3. Смонтируйте изолированных артерии, с использованием двух двойной узел швы в канюлю.
    Примечание: Knots могут быть подготовлены заранее и хранятся на Двойной Скотч, пока он не понадобится.
  4. Заполнить камеры с ОБД и два двойной knots на каждого стекла канюли.
    Примечание: При использовании отображения миогенных тонус артерий, HBS следует заменить кальция, которые БЕСПЛАТНО HBS дополненный 3 мкм EGTA и 3 мкм нитропруссида.
  5. Аккуратно возьмите артерии на одном конце, с помощью двух пар пинцет острый кончик. Открыть в просвет артерии и осторожно Вставьте канюлю. Fix на канюля с помощью двух knots.
  6. Применить давление 5 мм рт.ст, чтобы Осторожно промойте просвет с ОБДХ / 1% BSA.
  7. Иглу на другом конце артерии и закрепите его на канюли, используя два двойной knots.
  8. Передача myograph микроскопа и давление артерии 5 мм рт. (входное давление = давление на выходе), затем нагреть до 37 ° C за 30 мин.
  9. Дополнительно: Калибровка датчика продольной силы согласно инструкциям изготовителя (1 g = 9,81 mN).
    Примечание: Важно для калибровки датчика силы после Отопление как чувствительна к температуре.

3. провести эксперимент: Визуализация артериальной диаметра, толщины стенки и коллагена и эластина микроархитектуры, используя TPEM

  1. Быстро сканировать канюлированной артерии, под давлением до 5 мм рт.ст, с использованием 20 X цель (числовая апертура (NA) ≥ 0,8) и низкой мощности возбуждения свет для оценки судно диаметра и толщины стенки на 5 мм рт.ст..
    Примечание: Для Перевернутый Микроскопы, используйте объектив погружения воды; для вертикально Микроскопы используйте воду, окуная цели. Если цель не коррекции воротник исправить для Толщина крышки выскальзования, убедитесь, что матч используется крышка выскальзования с целью использования. Настройки программного обеспечения и описания могут варьироваться в зависимости от пользователя межфазных и микроскоп и используемого программного обеспечения.
    1. Установка оптического пути.
      1. Активировать Mai Tai два фотона лазерного и установите его в 820 Нм возбуждения света.
        Предупреждение: Во избежание какого-либо воздействия как видимые, так и невидимый лазерный свет.
      2. Собирайте выбросов одновременно в двух каналах. Сплит выбросов света между photomultipliers, с помощью 460 Нм длинный пас дихроичное зеркало и собирать выбросов с использованием 30-60 Нм широкий полосовых фильтров центрирована на 520 Нм (эластин) и 410 Нм (коллаген), соответственно.
    2. Включение непрерывного сканирования с 10 мкс лазерной выдержки времени/пиксель и 512 × 512 пикселей для 100% поле зрения.
    3. Вручную проверять через артерии, чтобы определить глубину, где наблюдается максимальный диаметр.
    4. Выбрать прямоугольный фрагмент, охватывающих широкий диаметр артерии и сканировать один кадр с пиксель размер ≤ 300 Нм/пиксель (рис. 2 c). Использовать в качестве силы света низкого возбуждения и время нахождения пиксель избежать photodamaging живой артерии.
      Примечание: Рекомендуется для получения прямоугольной формы, например., 100 × 1024 пикселей изображения, а не квадратичной изображения в этой позиции, чтобы сэкономить время и ограничить воздействие Фотон ткани (рис. 2 c).
    5. Сохраните изображение для последующего анализа.
  2. Определяет просвет диаметра и толщины стенки на максимальный диаметр артерии.
    1. Загрузите изображение в Фиджи.
    2. Установите масштаб, нажав главное меню | Анализировать | задать масштаб и введите мкм/pixel и пиксель соотношение (настоятельно рекомендуется держать пиксель соотношение 1:1).
    3. Выберите инструмент линия Фиджи и нарисуйте линию, соединяющую два внутренних упругой пластинки на каждой стороне просвета артерий и нажмите ctrl + M. Длина сообщения в Фиджи как по умолчанию в таблице результатов.
    4. Аналогичным образом привлечь больше линий для измерения толщины каждой стены и нажмите ctrl + M для измерения следующую разметку.
    5. Сохраните измерения.
  3. Коллаген и эластин микроархитектуры изображения на 5 мм рт.ст, сканируя весь толщина стенок артерий, получения стеков 3D изображения с хорошим качеством для регионов 1-3 интерес по длине артерии.
    1. Получите стеки изображений через всю стену артерии с помощью 60 X цель, NA ≥ 1, оптимизированный пикселей размеры и z интервалов.
      1. Рассчитать оптимальные условия изображения (пикселей размеры и интервалы z шаг) в соответствии с оптического пути, погружение средний и образец рефракционной индексов с использованием научной визуализации Найквиста объем калькулятор (https://svi.nl/NyquistCalculator).
        Примечание: Обратите внимание на разницу между оптимальный размер и z интервал против рекомендации в разделе 3.4. выше на использование максимальный размер пикселя.
    2. Используйте одинаковые параметры возбуждения и выбросов как выше (3.1.1.).
    3. Быстро сканировать стенке сосуда, как описано выше для определения толщины z-стека.
    4. Определить z стек начала и конца глубины, z шаг интервалов и плотность пикселей (рассчитывается в 3.3.1.1.) и выполнять z-scan. Сохраните в каждом канале отдельно.
      Примечание: Изображения должны быть достаточно небольшим, например 30 x 30 мкм или 50 × 50 мкм в зависимости от размера судна, чтобы избежать любое влияние кривизны в последующие изображения анализы.
  4. Определите артериальной диаметра, толщины стенки и эластина и коллагена микроархитектуры на оставшиеся давления протокола.
    1. Повторите 3.1-3.2 на давление 10 и 20 мм рт.ст., повторять 3.3 на давление 20 мм рт.ст..
    2. Повторите 3.1 и 3.2 на 40 мм рт.ст давление.
    3. Повторять 3.1-3.2 на давление 60, 80 и 100 мм рт.ст и повторять 3.3 на 100 мм рт.ст..
      Примечание: 3.1-3.3 можно повторить для всех давлений и комбинации давления (например серия/сочетание увеличения давления, а также снижение), в зависимости от гипотезы для проверки. Эозином в концентрации 0,3 - 1 мкм могут быть добавлены для повышения аутофлюоресценция эластина в случае Фотообесцвечивание. Фотообесцвечивание можно избежать, применяя как свет как можно более низкой мощности возбуждения.
    4. Замените свежие 37 ° C HBS буфер в myograph камере после каждого шага давления. Разрешить артерии адаптироваться за 5 мин до изображений после каждого изменения давления.
  5. Хранить стеков канала отдельно для анализа изображения.
  6. Проверить жизнеспособность артерии.
    1. Применить 10 мкм U46619 в зале myograph с последующим добавлением 10 мкм Брадикинин когда наблюдается стабильная сужения.
    2. Диаметр и толщина стенки запись, как описано выше в разделе 3.1 после применения каждого из соединений.
    3. Добавьте 3 мкм нитропруссида натрия, когда артерии не расширены полностью после добавления брадикинина и запись диаметра и толщины стенки.
      Примечание: В зависимости от фармакологических свойств артерии интерес (сосудистого русла и видов) другие сосудосуживающие и сосудорасширяющее (Эндотелий зависимые) соединения может использоваться.
  7. Дополнительно: Исправить под давлением артерии или продолжить с изображениями коллагена и эластина для тома плотности (шаг 7).
    1. Добавьте 4% формальдегида в 1 x фосфат амортизированное saline (PBS) при 37 ° C в течение 1 ч.
    2. Вымойте фиксированной артерии три раза в однократном ПБС и аккуратно сдвиньте артерии у канюли, касаясь только части артерии вне узлов. Не удалять узлы, использовать их для проведения артерии при передаче на хранение трубку.
    3. Магазин в 1 x PBS / 0,05% азид натрия при 4 ° C до изображений для других целей или плотности объем эластина и коллагена.
      Примечание: Фиксированная артерии могут быть сохранены для по крайней мере 3 месяца в 1 x PBS / 0,05% азид натрия при 4 ° C.

4. Расчет стресс штамм отношения и внутренние стены жесткости

  1. Пожалуйста, следуйте формул и этапы вычисления для расчета напряжений, штаммов и стены жесткости, как описано в Bloksgaard, м. и др. 13 и ссылки здесь.

5. изображения анализ - углы ветвления IEL (внутренние упругой пластинки)

  1. Открыть изображение стека в Фиджи. Перейти к файл | открыть изображение выбрать стека изображений.
    Примечание: Прогнозы в отношении интенсивности Макс 2-7 последовательных z-секций охватывающих IEL (1-2 мкм толщина) используются для определения углов волокна ветвления IEL эластина, используя инструмент «угол» в Фиджи28,35. Обратитесь к рис. 4A для иллюстрации.
  2. Перейти к изображение | стеки | z проект... выбрать изображения и «Макс интенсивности проекции».
  3. Сохраните Макс интенсивности проекции как TIFF.
  4. Выберите столько точек ветвления, волокна IEL как можно с помощью инструмента «угол» и систематически работать через образы. Нажмите ctrl + M для измерения каждого угла.
  5. Сохраните лист результаты Фиджи.

6. изображения анализ - Adventitial коллагена волнистости

  1. Открыть изображение стека в Фиджи. Перейти к файл | открыть изображение, чтобы выбрать изображение стека.
    Примечание: Макс прогнозы в отношении интенсивности 2-7 последовательных z-секций охватывающих коллаген право за пределами внешних упругой пластинки (УГОРЬ, толщина 1-4 мкм) используются для определения коллаген волнистость, используя плагин Фиджи NeuronJ36 , как описано в Rezakhaniha, R . и др. 37 (Рис. 4В).
  2. Задайте масштаб. Перейти к анализировать | задать масштаб ввести размеры в пикселах.
  3. Перейти к изображение | стеки | z проект... выбрать изображения для работы с и «Макс интенсивности проекции».
  4. Изменить тип изображения 8 Битт TIFF, нажав изображение | типа | 8 Битт и сохранить Макс интенсивности проекции как TIFF.
  5. Измерять прямолинейность волокна коллагена, с помощью плагина J нейрон Фиджи.
    1. Открыть NeuronJ плагин, нажав Фиджи | Плагины | Нейрон J.
    2. Откройте 8 бит TIFF в NeuronJ нажав загрузки изображения | Выберите файл.
    3. Нажмите кнопку Добавить Прорисии выберите волокон для анализа, нажав на начало и конец каждого волокна.
    4. Щелкните меру Прориси, выберите вершины измерений и отображения трассировки (Lf) в диалоговом окне.
  6. Рассчитать L0/Lf в excel (или аналогичный) и сохранить результаты.
    1. Скопируйте и вставьте Фиджи нейрон J Прориси и вершин вывод в excel (или аналогичный) и рассчитать L0 с помощью теоремы Пифагора от вершины измерений. Первая и последняя точки на линии указывают на позиции концы гипотенузы в 2D системе координат.
      Примечание: L0/Lf [длина end-to-end расслоение волокна коллагена через прямой линии (L0) / полная длина (Lf)] близко к 1 указывает почти прямо коллагеновых волокон.

7. изображения для коллагена и эластина объем плотности

  1. Помыть (фиксированная) артерии 1 x в PBS и выведение его на 15 минут в 1 микрон эозином в однократном ПБС в темноте. Для фиксированной артерий выполните этот шаг при комнатной температуре.
    Примечание: Эозина повышает эластина флуоресценции. Эозина будет пятно другие структуры, такие как коллаген и цитоплазмы клеток, если образец пятная решения длительное время. Если пятная других структур является слишком интенсивным, снизить концентрацию эозина до 0,3 мкм или повторить стирки.
  2. Вымойте артерии 3 x в однократном ПБС
    1. Для фиксированной артерий: смонтировать артерии для воображения.
      Предупреждение: Изображения сосудов под давлением не позволяют поиск любой геометрической количественной информации. Когда абсолютных количествах необходимы, они всегда должны быть получены на живой, под давлением артерий. Объем коэффициенты можно получить на артериях не под давлением с помощью этого метода.
      1. Место двух кусков двойной клейкой ленты 1-1,5 см друг от друга на стекле объекта. Двойной Скотч толщиной примерно 100 мкм. Примените один или несколько слоев ленты соответствует диаметр артерии монтируется.
      2. Место 10-20 мкл PBS на стекле посреди площади и поместите артерии в PBS падение.
        Примечание: Падение должна быть небольшой плоский как можно и избежать толкания артерии из позиции при монтаже крышку выскальзования.
      3. Место coverslip и нажмите на Двойной Скотч.
      4. Заполните емкость между coverslip и объект стекла с ПБС. Пополните его каждый час, чтобы избежать высыхания образца.
  3. Получение изображений стеки для коллагена и эластина объем плотности с помощью 20 X цель с NA > 1, чтобы охватить как большая часть артериальной стенки максимально сохраняя хорошее оптическое разрешение (Рисунок 2D, 2 G и 2 H).
    Примечание: Используйте цель погружения воды для отображения фиксированного артерий под coverslip и воды, окуная цель для визуализации жизненно важных артерий. Если цель не коррекции воротник исправить для Толщина крышки выскальзования, убедитесь в том, coverslip к цели. Предпочтительно используйте оптимальные пикселей размеры и z интервал. Вычислите эти используя Nyquist калькулятор (шаг 3.3.1.1.). Кроме того используйте минимальный пикселя размером 300 Нм и z интервал 1 мкм. Рекомендуется получить три изображения по длине артерии, чтобы позволить пользователю определить интра анализа изменчивости.
  4. Эластин изображения, используя 820 Нм возбуждения света и собирать выбросов с использованием 30-60 Нм широкий полосовой фильтр по центру в 520 Нм.
  5. Коллаген изображения, используя 990 Нм возбуждения свет избегать любых возбуждения эластина и других autofluorescent белков и собирать выбросов с использованием 10-30 Нм широкий полосовой фильтр центрирована на 495 нм.
  6. Сохранить стеки изображений от каждого канала отдельно в виде файлов TIFF

8. изображение анализ для извлечения эластина и коллагена объем плотности с помощью Ilastik

  1. Преобразовать TIFF стеки изображений для HDF5 с помощью Фиджи28,35 , нажав кнопку выбрать файл | Сохранить как... Hdf5.
  2. Создайте две папки файла данных на жесткий диск компьютера, один для эластина, один для коллагена стеки изображений, соответственно. Скопируйте соответствующие стеки в соответствующую папку.
  3. Создайте два новых проектов Ilastik в Ilastik программного обеспечения, один из эластина, один для коллагена, соответственно.
    1. Открыть Ilastik | Создайте новый проект | Классификация пикселей | новый проект | Добавление данных и выберите изображение папки, созданной на шаге 8.2.
      Примечание: Следуйте инструкциям мастера Ilastik.
  4. Импорт одного стека 3D изображений для обучения программного обеспечения.
    1. Выберите ввода данных апплет | основной рабочей области | Необработанные данные вкладки | Добавить новый... | Добавление отдельного изображения и выбрать нужный образ данных
  5. Выбор соответствующих функций в программное обеспечение.
    1. Открытые Выбор компонентов апплет | Выберите функцию который открывает новое диалоговое окно. Подробнее смотрите Рисунок 5A .
  6. Добавьте по крайней мере две метки, используя кнопку Добавить метку под аплетом обучения.
    Примечание: Каждая метка будет соответствовать к типу объекта, который необходимо выделить. В этой работе, три метки используются для эластина: эластина самой, яркие пятна (чтобы быть исключены) и фона (чтобы быть исключены).
  7. Нарисуйте этикетки на вершине стека изображений в формате raw, используя кисть, стиле Аннотация инструмент.
    1. Выберите соответствующую метку: щелкните инструмент кисть и начать рисование.
  8. Запрос Ilastik для анализа стека изображений и искать схожие черты, щелкнув Включить Live Update.
  9. Тщательно проверьте карту прогнозирования (рис. 5 d).
    Примечание: Процесс от изображения raw полный Прогноз карте показано на рисунке 5. Ilastik использует прогнозирования карту для разделения изображения укладывают согласно какой лейбл пиксел, скорее всего, быть связанными (рис. 5 d).
  10. Примените пороговое значение.
    1. Выберите порог апплет, выбрать соответствующий метод ввода метки, гладкой, порог и размер параметров фильтра и наконец нажмите кнопку Применить.
      Примечание: Это сегрегирует аналогичным образом помечены частей изображения в отдельные объекты. Тесно связанных ткани, такие как эластин и коллаген не нужно быть разделены, поэтому применяется порог 0,4 (значение по умолчанию — 0,5). Рисунок 5E и 5F иллюстрируют результат применения порогового значения.
  11. Повторите обучение Ilastik до тех пор, пока результат удовлетворительным (только эластин, коллаген соответственно признается для соответствующих анализов).
    1. Часто переключаться между подготовкой и сегментации (и иногда также Бинаризация) апплеты во время этого процесса. Пример эффекта переобучения Ilastik показан на рисунке 6.
  12. Пакет анализа аналогичные данные изображения: выберите Выбор входа пакетного предсказание и добавить соответствующие файлы.
    Примечание: Ilastik вывода представляет собой совокупность псевдо - 1 бит стеки 3D изображений (изображения маски) с 0 (ноль) обозначает отсутствие эластина (или коллагена) и 1 (один), обозначающий наличие настоящего договора (фактический разрядность 8-бит).
  13. Проверьте результаты для каждого стека изображений, визуально сравнивая изображения маски и файлы изображений в формате raw.
  14. Оптимизация Ilastik маска (шаги 8.4-8,9) и повторно анализировать любые стеки изображений с неудовлетворительными результатами.
  15. Расчет плотности объем эластина и коллагена от Ilastik изображения маски с использованием MATLAB
    1. Откройте MATLAB.
    2. Выберите папку с ilastik изображение маски в MATLAB «текущая папка» окно.
    3. Скопируйте сценарий MATLAB от дополнительного файла 1 в MATLAB редактор и сохраните код как volumeCalculator.m в папке MATLAB на жестком диске компьютера.
    4. Введите в строки скрипта пикселей размеры и высота пикселей
      pixelSize = 0.1230000 * 0.1230000; % мкм * микрон
      значение свойства pixelHeight = 0,9; % мкм
    5. Сохраните сценарий.
    6. Перейдите в окно команд MATLAB и введите «volumeCalculator (' данные пути ')» для загрузки сценария.
    7. Нажмите клавишу ВВОД. Каждое изображение-маску теперь подведены и умноженное на объем (известных) пикселей/voxel (физические размеры пиксела, умноженное на резолюции по оси z). Выход из MATLAB является общий объем эластина и коллагена в стеке каждого изображения.
  16. Сохраните результаты.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

По плану давления myograph для обработки изображений, используемых в этой работе показана на рисунке 1. Особое внимание на дизайн myograph было уделено i) в камеру с небольшой объем (2 mL) и ii), возможность для позиционирования канюли близко к и параллельно с нижней стекла (рис. 1B). В нижней части камеры вписывается 50 × 24 мм #1.5 стекло coverslip (сменный). Регулятор давления был построен из стандартных стеклянная бутылка 1 Л...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа представляет собой наше предложение стандартизированных, комбинированные изображений и давления миография подхода, ценные для одновременной оценки механических свойств сопротивления артерий и связанные с давлением изменения в структуре артериальной стены в диапазоне давления от 0 до 100 мм рт.ст. Представленный подход был разработан с использованием пользовательских построен оборудования, однако, может использоваться любой myograph давления, который помещается на двух Фотон возбуждения флуоресценции микроскопа...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят изображений центра молекулярной биомедицинских датского на факультет естественных наук, Университет Южной Дании, за использование лабораторий и микроскопы. Кристоффер Rosenstand и Мельхиор Ulla признаны за отличную техническую помощь с давлением миография и изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Инструменты для науки15401-12
Инструменты для науки11251-23
NikonSMZ800N
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Дания.761028для вскрытия
Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark1.63, 2.13, 210mm
Smiths medical Intl, UK
Ethicon Ethilon11-0
Custom builtDK патент номер 201200167, Университет Южной Дании, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt
Mettler toledo
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Дания.B3259
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Дания.А7030
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Дания.C5670
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Дания.G7021
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Дания.E3889
Merck Millipore, Hellerup, Дания1.00496.9010Фосфат буферизированный (pH 6.9) 4% раствор формальдегида 
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Дания.H3784
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Дания.P9666
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Дания.P5655
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Дания.M2643
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Дания.S2002
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Дания.S5886
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Дания.S5761
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Дания.1.06462
Gibco, ThermoFisher Scientific10010015
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Дания.PHR1423
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Дания.Z370525
  Tocris Bioscience, Бристоль, Великобритания538944
NikonCustom Built
Spectra Physics, Маунтин-Вью, Калифорния
NikonCFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27
NikonCFI Plan Fluor 20XMI (мультииммерсионный) NA 0.75
Hamamatsu, Ballerup, ДанияH7422P-40
AHF analysentechnik AG (Tü bingen, Германия).ChromaET 460 нм длиннопроходный дихроичный
AHF analysentechnik AG (Tü bingen, Германия).Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter
AHF analysentechnik AG (Tü bingen, Германия).Chroma ET402/15X 
Толщина покровного стекла Scotch TM должна соответствовать используемому объективу на микроскопе (#1 или #1.5), в качестве альтернативы установите регулировочное кольцо в соответствии с покровным стеклом

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Briones, A. M., Arribas, S. M., Salaices, M. Role of extracellular matrix in vascular remodeling of hypertension. Curr Opin Nephrol Hy. 19 (2), 187-194 (2010).
  2. Heagerty, A. M., Heerkens, E. H., Izzard, A. S. Small artery structure and function in hypertension. J Cell Mol Med. 14 (5), 1037-1043 (2010).
  3. van den Akker, J., Schoorl, M. J., Bakker, E. N., Vanbavel, E. Small artery remodeling: current concepts and questions. J Vasc Res. 47 (3), 183-202 (2010).
  4. Rizzoni, D., Agabiti-Rosei, E. Structural abnormalities of small resistance arteries in essential hypertension. Intern Emerg Med. 7 (3), 205-212 (2012).
  5. Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: mechanisms and treatment. Hypertension. 59 (2), 367-374 (2012).
  6. Fonck, E., et al. Effect of elastin degradation on carotid wall mechanics as assessed by a constituent-based biomechanical model. Am J Physiol-Heart C. 292 (6), H2754-H2763 (2007).
  7. Chow, M. J., Turcotte, R., Lin, C. P., Zhang, Y. Arterial extracellular matrix: a mechanobiological study of the contributions and interactions of elastin and collagen. Biophys J. 106 (12), 2684-2692 (2014).
  8. Chen, H., et al. Biaxial deformation of collagen and elastin fibers in coronary adventitia. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1683-1693 (2013).
  9. Schriefl, A. J., Schmidt, T., Balzani, D., Sommer, G., Holzapfel, G. A. Selective enzymatic removal of elastin and collagen from human abdominal aortas: uniaxial mechanical response and constitutive modeling. Acta Biomater. 17, 125-136 (2015).
  10. Zeinali-Davarani, S., Wang, Y., Chow, M. J., Turcotte, R., Zhang, Y. Contribution of collagen fiber undulation to regional biomechanical properties along porcine thoracic aorta. J Biomech Eng. 137 (5), 051001(2015).
  11. Mattson, J. M., Turcotte, R., Zhang, Y. Glycosaminoglycans contribute to extracellular matrix fiber recruitment and arterial wall mechanics. Biomech Model Mechan. 16 (1), 213-225 (2017).
  12. Schriefl, A. J., Zeindlinger, G., Pierce, D. M., Regitnig, P., Holzapfel, G. A. Determination of the layer-specific distributed collagen fibre orientations in human thoracic and abdominal aortas and common iliac arteries. J R Soc Interface. 9 (71), 1275-1286 (2012).
  13. Bloksgaard, M., et al. Imaging and modeling of acute pressure-induced changes of collagen and elastin microarchitectures in pig and human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. , (2017).
  14. Dora, K. A., et al. Isolated Human Pulmonary Artery Structure and Function Pre- and Post-Cardiopulmonary Bypass Surgery. J Am Heart Assoc. 5 (2), (2016).
  15. Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
  16. Roque, F. R., et al. Aerobic exercise reduces oxidative stress and improves vascular changes of small mesenteric and coronary arteries in hypertension. Brit J Pharmacol. 168 (3), 686-703 (2013).
  17. Briones, A. M., et al. Alterations in structure and mechanics of resistance arteries from ouabain-induced hypertensive rats. Am J Physiol-Heart C. 291 (1), H193-H201 (2006).
  18. Briones, A. M., et al. Role of elastin in spontaneously hypertensive rat small mesenteric artery remodelling. J Physiol. 552 (Pt 1), 185-195 (2003).
  19. Arribas, S. M., et al. Confocal myography for the study of hypertensive vascular remodelling. Clin Hemorheol Micro. 37 (1-2), 205-210 (2007).
  20. Gonzalez, J. M., et al. Postnatal alterations in elastic fiber organization precede resistance artery narrowing in SHR. Am J Physiol-Heart C. 291 (2), H804-H812 (2006).
  21. Spronck, B., Megens, R. T., Reesink, K. D., Delhaas, T. A method for three-dimensional quantification of vascular smooth muscle orientation: application in viable murine carotid arteries. Biomech Model Mechan. 15 (2), 419-432 (2015).
  22. Megens, R. T., et al. In vivo high-resolution structural imaging of large arteries in small rodents using two-photon laser scanning microscopy. J Biomed Opt. 15 (1), 011108(2010).
  23. Megens, R. T., oude Egbrink, M. G., Merkx, M., Slaaf, D. W., van Zandvoort, M. A. Two-photon microscopy on vital carotid arteries: imaging the relationship between collagen and inflammatory cells in atherosclerotic plaques. J Biomed Opt. 13 (4), 044022(2008).
  24. Bender, S. B., et al. Regional variation in arterial stiffening and dysfunction in Western diet-induced obesity. Am J Physiol-Heart C. 309 (4), H574-H582 (2015).
  25. Clifford, P. S., et al. Spatial distribution and mechanical function of elastin in resistance arteries: a role in bearing longitudinal stress. Arterioscler Thromb. 31 (12), 2889-2896 (2011).
  26. Martinez-Revelles, S., et al. Lysyl Oxidase Induces Vascular Oxidative Stress and Contributes to Arterial Stiffness and Abnormal Elastin Structure in Hypertension: Role of p38MAPK. Antioxid Redox Sign. 27 (7), 379-397 (2017).
  27. Foote, C. A., et al. Arterial Stiffening in Western Diet-Fed Mice Is Associated with Increased Vascular Elastin, Transforming Growth Factor-beta, and Plasma Neuraminidase. Front Physiol. 7, 285(2016).
  28. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  29. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive Learning and Segmentation Toolkit. 2011 8th Ieee International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro, , 230-233 (2011).
  30. Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
  31. Intengan, H. D., Deng, L. Y., Li, J. S., Schiffrin, E. L. Mechanics and composition of human subcutaneous resistance arteries in essential hypertension. Hypertension. 33 (1 Pt 2), 569-574 (1999).
  32. Saatchi, S., et al. Three-dimensional microstructural changes in murine abdominal aortic aneurysms quantified using immunofluorescent array tomography. J Histochem Cytochem. 60 (2), 97-109 (2012).
  33. Bloksgaard, M., et al. Elastin Organization in Pig and Cardiovascular Disease Patients' Pericardial Resistance Arteries. J Vasc Res. 52 (1), 1-11 (2015).
  34. World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects. JAMA. 310 (20), 2191-2194 (2013).
  35. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  36. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
  37. Rezakhaniha, R., et al. Experimental investigation of collagen waviness and orientation in the arterial adventitia using confocal laser scanning microscopy. Biomech Model Mechan. 11 (3-4), 461-473 (2012).
  38. Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058(2014).
  39. Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
  40. Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
  41. Megens, R. T., et al. Imaging collagen in intact viable healthy and atherosclerotic arteries using fluorescently labeled CNA35 and two-photon laser scanning microscopy. Mol Imaging. 6 (4), 247-260 (2007).
  42. Staiculescu, M. C., et al. Prolonged vasoconstriction of resistance arteries involves vascular smooth muscle actin polymerization leading to inward remodelling. Cardiovasc Res. 98 (3), 428-436 (2013).
  43. Fung, Y. C., Sobin, S. S. The retained elasticity of elastin under fixation agents. J Biomech Eng. 103 (2), 121-122 (1981).
  44. Fung, Y. C. Biomechanics : mechanical properties of living tissues. , 2nd, Springer-Verlag. (1993).
  45. Bakker, E. N., et al. Heterogeneity in arterial remodeling among sublines of spontaneously hypertensive rats. PLoS One. 9 (9), e1107998(2014).
  46. VanBavel, E., Siersma, P., Spaan, J. A. Elasticity of passive blood vessels: a new concept. Am J Physiol-Heart C. 285 (5), H1986-H2000 (2003).
  47. Chen, H., et al. Microstructural constitutive model of active coronary media. Biomaterials. 34 (31), 7575-7583 (2013).
  48. Saez, P., Garcia, A., Pena, E., Gasser, T. C., Martinez, M. A. Microstructural quantification of collagen fiber orientations and its integration in constitutive modeling of the porcine carotid artery. Acta Biomater. 33, 183-193 (2016).
  49. Bellini, C., Ferruzzi, J., Roccabianca, S., Di Martino, E. S., Humphrey, J. D. A microstructurally motivated model of arterial wall mechanics with mechanobiological implications. Ann Biomed Eng. 42 (3), 488-502 (2014).
  50. Schriefl, A. J., Wolinski, H., Regitnig, P., Kohlwein, S. D., Holzapfel, G. A. An automated approach for three-dimensional quantification of fibrillar structures in optically cleared soft biological tissues. J R Soc Interface. 10 (80), 20120760(2013).
  51. Weisbecker, H., Unterberger, M. J., Holzapfel, G. A. Constitutive modelling of arteries considering fibre recruitment and three-dimensional fibre distribution. J R Soc Interface. 12 (105), 20150111(2015).
  52. Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based biomechanics of coronary arteries in health and disease. J Biomech. 49 (12), 2548-2559 (2016).
  53. Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based constitutive model of coronary artery with active smooth muscle contraction. Sci Rep. 7 (1), 9339(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Collagen Elastin MicroarchitectureResistance Artery MechanicsLabel free Fluorescence MicroscopyTwo photon Excitation ImagingElastin AutofluorescenceCollagen Second Harmonic GenerationFiji Image AnalysisIlastik Software AnalysisPressure induced Vascular ChangesExtracellular Matrix Quantification

Похожие статьи