Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Изображение руководствуясь резекции глиобластома и внутричерепных имплантации терапевтического стволовых клеток посеян подмостей

7.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57452

⸱

16 июля 2018 г.

 ,  ,  , 
1Division of Pharmacoengineering and Molecular Pharmaceutics, UNC Eshelman School of Pharmacy, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina at Chapel Hill

В этой статье

Краткое содержание

Как для лечения глиобластома инвазивных обещают опухоли ищу терапевтических мезенхимальных стволовых клеток (Майкрософт) (MSCs). Оптимальное трансплантации включает поставку MSCs в полость резекции опухоли на леса. Здесь, доклинических методы для изучения MSC лечения глиобластома предоставляются включая: резекции опухоли изображение гидом; Имплантация MSC-посеян лесов; и послеоперационной терапии отслеживания.

Аннотация

Глиобластома (GBM), наиболее распространенных и агрессивной первичного мозга рак, носит продолжительность жизни составляет 12-15 месяцев. Короткой продолжительности жизни отчасти объясняется неспособностью текущего лечения, состоящий из хирургической резекции после лучевой и химиотерапии, для ликвидации очагов инвазивные опухоли. Лечение этих очагов может быть улучшена с tumoricidal человека мезенхимальных стволовых клеток (МСК). MSCs экспонат мощным опухоли тропизма и может быть сконструированы так, чтобы выразить терапевтических белков, которые убивают опухолевых клеток. Достижений в доклинических моделях показывают, что хирургическая резекция индуцирует преждевременной потери MSC и уменьшает терапевтической эффективности. Эффективность лечения MSC может быть улучшено путем посева MSCs на леске биологически poly(lactic acid) (НОАК). MSC доставки в полость хирургической резекции на леске PLA восстанавливает клетки удержания, настойчивость и опухоли убийства. Изучить последствия имплантации MSC-посеян PLA на GBM, необходима точная модель доклинических. Здесь мы предоставляем доклинических хирургический протокол для изображений руководствуясь опухоли резекция GBM иммунный дефицит мышей, следуют MSC-посеян эшафот имплантации. MSCs спроектированы с лентивирусные конструкции конститутивно выразить и выделяют терапевтических TNFα-связанных индуцировать апоптоз лиганда (TRAIL), а также Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) чтобы разрешить Флуоресцентные отслеживание. Аналогичным образом опухолевые клетки U87 разработаны для Экспресс mCherry и Светлячок Люцифераза, обеспечивая двойной флуоресцентный/светящиеся отслеживания. Хотя в настоящее время используется для исследования стволовых клеток при посредничестве доставки терапевтических средств, этот протокол может быть изменен исследовать влияние хирургической резекции на других GBM вмешательств.

Введение

Глиобластома (GBM) является наиболее распространенной формой рака первичного мозга у взрослых, с мрачной медиана выживаемости всего 12-15 месяцев1,2,3,4,5. Выживание существенно не улучшилась после 2005 года, когда текущие клинические стандарт максимальной хирургической резекции, следуют излучения и сопутствующих и адъювантной химиотерапии Темозоламид был принят6,7. Хотя эта процедура обеспечивает пациентов с временное облегчение симптомов, стандарт уход неизменно приводит к повторения инвазивного рака очагов уклониться от резекции и защищены от системной терапии гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Стратегии в интересах инвазивные опухоли очагов в обход BBB срочно необходимы для получения тяги против этой агрессивной и изнурительной болезни.

Средства доставки GBM вследствие их родной опухоли тропизм8,9как препарат обещают человека мезенхимальных стволовых клеток (МСК). MSCs обладают рецепторов для и мигрировать растворимых факторов, которые выделяют опухоли, включая стромальных клеток, полученных фактор 1α (SDF-1α), матрицы металлопротеиназы-1 (MMP-1) и Моноцит хемотаксического белка-1 (МКП-1) среди прочих10, 11 , 12 , 13. инженерные MSCs выразить и выделяют цитотоксические препараты позволяет им быть использованы в качестве средств доставки наркотиков опухоли самонаведения. Инженерии MSCs двигаться к инвазивной опухоли очагов и доставить терапевтических белков. Этот подход продемонстрировал осуществимость в различных доклинических GBM модели9,14. Однако подавляющее большинство из этих моделей не включают хирургическая резекция несмотря на клиническое значение этого компонента. Новые исследования с использованием новых моделей резекции показали, что опухоли хирургическое удаление уменьшает сохранение стволовых клеток, которые вводят непосредственно в хирургической полости15. Утрата жизнеспособности привело к сокращению эффективности, вероятно из-за снижением дозы и длительности наркотиков доставлены инвазивных опухолевых очагов.

Чтобы повысить жизнеспособность стволовых клеток и доставки лекарств, MSCs может быть заполнена на леса до имплантации. В этом протоколе, биосовместимых и рассасывания electrospun nanofibrous poly(lactic acid) (НОАК) используется как леса для НОАК MSCs. шнуры и соответствует форме резекции полости после имплантации, которая максимизирует терапевтического охвата и минимизирует Расстояние MSCs должна путешествие достичь опухолевых клеток. MSCs остаются на эшафот во время имплантации и затем мигрируют от леса к опухолевых клеток после имплантации16,17. MSCs и цитостатических препаратов, которую они несут затем накапливаются в опухолевых очагов. Доставка цитотоксических препарата к опухоли требует MSC жизнеспособность и упорство, оба из которых являются способствует имплантации на леса.

В этой процедуре, лентивирусные векторы используются для стимулирования стабильных выражение флуоресцентные (в пробирке отслеживания) и биолюминесцентных (в естественных условиях отслеживания) маркеры рака и стволовых клеток линии. Линии человека GBM U87 заражен с mCherry и firefly Люцифераза (U87 mCh-Fl) и нетерапевтических MSCs с GFP и renilla Люцифераза (MSC GFP-Rluc). Терапевтические вариант MSCs Экспресс TNFα-связанные апоптоза, вызывая лиганда (MSC-TRAIL). ТРОПА, конститутивно выделяется белка, связывается с рядом смерти рецепторов на рак клеток и инициирует caspase опосредованной апоптоз18.

Здесь мы предоставляем протокол для доклинических изображения руководствуясь GBM хирургической резекции и имплантации MSC-посеян подмостей. В краткой Обнаженная мышей даны краниотомии позже следуют три дня Стереотаксическая ортотопическая инъекции U87 mCh-FL учредить первичной опухоли. Прижившимися опухоль растет в течение примерно одной недели. PLA подмостей являются семенами с MSCs 48 ч до операции резекции. Опухоль затем резецируется под руководством флуоресцентные, и леска загружается MSC имплантируется в полость резекции. Бремя и мыши выживания опухоли, затем постоперационно отслеживаются с биолюминесценции изображений (BLI). Хронология этих процедур приводится ниже (рис. 1).

figure-introduction-1
Рисунок 1: временная шкала процедур. Мышей первоначально получают черепной окна (день 0). После трех дней периода восстановления, являются опухоли имплантируются (день 3) и расти в течение примерно одной недели. Леса являются семенами с MSCs (8 день) два дня до начала процедуры резекции и имплантации опухоли (10 дней). Прогрессии опухоли и терапевтической эффективности оцениваются через изображений затем послеоперационный (день 10 +). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета Северной Каролины в Чапел-Хилл.

Примечание: Данная процедура выполняется на мышах с открытым краниотомии, как измененную версию протокола Mostany и Portera-Кайо19 которой удаляется костной ткани, который хирургическим путем, оставляя мозга доступным для создания и конечном итоге резекция опухолей GBM. После краниотомии опухоли устанавливаются через стереотаксической имплантации, как описано в Озава и Джеймс20. Мы имплантат 1 х 105 U87 mCh-Fl клетки по следующим координатам Стереотаксическая (в мм от bregma): (2.5, 0, -0.5).

1. клеточной культуры и эшафот подготовки

Примечание: Подмостей должны быть подготовлены 48 ч до имплантации в мышах. Следующие тома предоставляются на основе на эшафот. Умножьте количествах, необходимых для дополнительных лесов.

  1. Нарежьте PLA подмостей резекции полости размера (примерно 2 мм х 2 мм). Строительные леса можно вырезать вручную с помощью ножниц или использование Дырокол для повторяемости.
  2. Стерилизуйте, погружая в 70% этанол 15 мин, затем, погружая в PBS. Место леску в Дульбекко изменение орла среднего (DMEM) содержащий 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1% пенициллин стрептомицина при подготовке клетки для посева.
  3. Поднимите культивировали MSCs, используя 0,05% трипсина (3-5 мл на колбу T75). Инкубировать при 37 ° C за 5 мин убедитесь, что клетки сняли, а затем добавить 7-10 мл DMEM Фляга для инактивации трипсина.
  4. Передавать содержимое колбы 15 мл пластиковых пробирок. Подсчет количества ячеек с помощью Горяева. Пелле 5 x 105 MSCs для каждого леса через центрифугированием на 100 g x 5 мин.
  5. Аспирационная покинуть супернатант и Ресуспензируйте MSCs в 5 мкл DMEM за 5 x 105 клеток.
  6. Подготовьте подмости для посева, погладив их насухо.
    1. Удаление леску от DMEM погружения с щипцами и временно разместить его на крышке 6-ну пластины. Поднимите эшафот крышку, оставив позади капельки избыточного DMEM.
    2. Место эшафот обратно на крышку снова в новой, сухом месте. Повторить 3 - 5 раз, а затем место частично сушеные леску в новом 6-ну пластины для посева. Повторите для каждого леса.
      Примечание: Частично сушеные леску обеспечивает оптимальное ячейки результаты посева. Если леска слишком мокрая, клетки будет соскальзывать эшафот и придерживаться хорошо пластины ниже. Если леска слишком сухой, капли не охватит весь эшафот, что приводит к плохой начальной ячейки распределения.
  7. С помощью пипетки, аккуратно перемешайте флакона стволовых клеток для гомогенизации подвеска как некоторые клетки могут поселились в нижней.
  8. Медленно Пипетка 2,5 мкл свежезаваренным смешанные MSC подвеска непосредственно на эшафот, создавая небольшие капельки над верхней части леса.
  9. Добавьте 300 мкл DMEM края каждой скважины. Это позволит предотвратить быстрое испарение капли ячейки. Инкубируйте при 37 ° C в течение 30 мин, позволяя клетки, чтобы прикрепить к эшафоту.
  10. Пинцетом аккуратно Переверните подмости в хорошо пластины. Подвеска MSC мкл свежезаваренным смешанных семян 2,5 (это приводит к в общей сложности 5 x 105 клеток посеян на эшафот). Инкубируйте при 37 ° C в течение 30 мин, позволяя клетки, чтобы прикрепить к эшафоту.
  11. Покрывают леса в среде DMEM, добавив 2 мл для каждой скважины 6-ну пластины. Аккуратно поднимите подмостей позволяют СМИ течь под ними. Инкубируйте при 37 ° C в этом состоянии в течение 48 ч до операции имплантации.
  12. Проверьте подмости после 24 ч и добавить/изменить СМИ, если наблюдается избыток испарения или обесцвеченные СМИ из-за дисбаланса рН.

2. Руководствуясь флуоресценции резекции и леска имплантации

Примечание: Стерилизуйте все инструменты до инициализации операции. Администрировать профилактическое анальгезии, изложенные в вашем институциональных протокол IACUC.

  1. Стереотаксическая рама место на сцене флуоресценции, рассекает стереомикроскопом.
  2. Анестезировать мыши при вдыхании изофлюрановая в камере индукции. После наркоза, безопасные мыши в Стереотаксическая рама с непрерывной ингаляционной анестезии снабжения через носовой конус адаптер изофлюрановая. Поддержание температуры тела с грелкой или зонд.
    Примечание: 4-5% изофлюрановая подходит для индукции и 2-3% подходит для обслуживания, но это должны быть адаптированы и наблюдение для каждой мыши.
  3. Применить глазной мази в глаза для предотвращения высыхания роговицы. Стерилизуйте разрез сайт волосистой части головы с серии три алкоголя и три Бетадин салфетки.
  4. Выполните мыс щепотку рефлекс тест на каждой конечности и подтвердите отрицательный ответ для обеспечения надлежащего анестезии. Обеспечить устойчивый частота дыхания на приблизительно 55-65 вдохов/мин.
  5. С помощью щипцов, щепотка и осторожно поднимите головы. Сделайте срединной линейной ростральной хвостового разрез с Ножницы хирургические. Орошения на разрез сайт с PBS и удаление подкожного жира с аппликатором отзыв хлопок в круговое движение, чистки зубов. Организовать кожи, таким образом, что ранее установленные черепной окно полностью видимой.
  6. Аккуратно прокол Дура просто внутренних границ окна черепа с помощью иглы 18-G. Повторяйте, пока разрез полностью прослеживает интерьер окна.
  7. Удалите Дура, пилинг его прочь с помощью тонкой щипцы, выявление основной паренхимы и опухоли.
  8. Найдите U87 mCh-Fl опухоли путем отключения номер огни и стереомикроскопом флуоресценции режиме. Подготовьте для резекции, загрузив кончик Пипетка 1-200 мкл в конце трубы вакуумного насоса.
  9. Включите вакуумный насос. Иссечения опухоли, нежно аспирационных флуоресцентные ткани до тех пор, пока сигнал не остается. Выключите вакуумный насос и отказаться от кончика пипетки. Поверните флуоресценции покинуть и огни обратно на номер.
    Примечание: Для остановки кровотечения, орошают с холодной PBS и применить постоянное давление с аппликатором отзыв хлопок. В более тяжелых случаях резекция полости может также временно упакован с агентом системы гемостаза до тех пор, как он удаляется после того, как кровотечение остановилось последовал другой PBS орошения.
  10. Непосредственно перед имплантацией медленно погрузите MSC-посеян PLA леску в PBS для удаления нежелательных средства массовой информации и связанных с ним компонентов. Имплантат эшафот в полость резекции. При необходимости добавьте 1 мкл фибриногена (67-106 мг/мл) следуют 1 мкл тромбина (400-625 ед/мл) для обеспечения леска на месте.
  11. С Дура удалены и кости лоскут из окна черепной уже отбрасываются, уплотнение раны просто путем закрытия кожи и применения хирургических клея. Удаление животное из ингаляционные анестетики и позволяют восстановить на поверхность с подогревом.
  12. После амбулаторного, возвращение мышь к клетке. Администрировать обезболивающее на IACUC-утвержденного графика. Повторите процедуру для каждой мыши.

3. послеоперационные изображений

  1. С помощью шприца 28-G инсулина, придать мышей с D-Люциферин (внутрибрюшинного 150 мг/кг).
  2. Подождите 10 минут. Это позволит люциферин циркулировать по всему телу и реагировать с выражая Люцифераза раковых клеток в головном мозге, чтобы получить пик выражение.
  3. Под изофлюрановая наркозом (как упоминалось ранее) изображение мышей в биолюминесценции изображений (BLI) системы для визуализации опухоли. Различаются воздействия раз как необходимые (от секунд до минут) в зависимости от размера опухоли.
  4. Повторите процедуру визуализации, как необходимо определить Кинетика роста опухоли. Продолжать следить за здоровьем животных.
    Примечание: Терапевтический MSCs будет конститутивно Экспресс тропа, убивает раковые клетки и подавления общего роста опухоли. Imaging каждые 2-5 дней предоставляет достаточную частоту для этой цели.
  5. Когда будут выполнены заранее конечные точки, изложенные в протоколе IACUC, пожертвовать мышей, transcardial перфузии и собирать тканей для анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

U87 опухолевые клетки были спроектированы для Экспресс mCherry и Светлячок Люцифераза (U87 mCh-Fl) до инъекции и позволить изображения руководствуясь резекции и биолюминесценции, отслеживание (рисунок 2A-C). Стволовые клетки были аналогичным образом спроектированы с диагностики GFP-Rluc (MSC-GFP) или терапевтических GFP-судебное разбирательство (MSC-TRAIL) и посеян на PLA подмости для подтверждения прикреплению и размножению (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Операция обычно может быть завершена в течение 30 мин на мышь, учитывая, что максимально повысить точность и избежать ловушки времени учитываются следующие моменты. Во-первых убедитесь, что мышь правильно позиционируется в стереотаксического инструмента до начала процедуры. Нежелательные движения головы будет ограничивать хирургической точностью краниотомии, расположение опухоли имплантация и степень резекции опухоли. До резекции полностью удалите часть Дура, охватывающих опухоли. Жесткие, волокнистых Дура твердеет как о...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

DRS. листов, Bagó и Hingtgen имеют справедливости в Falcon терапии, кто лицензию аспекты стволовых клеток и строительные технологии от UNC Chapel Hill.

Благодарности

Авторы признают редакционный вклад от д-р Кэтрин Pietrosimone. Подмости PLA были изготовлены д-р Элизабет Loboa лаборатории в университете штата Северная Каролина. Эта работа была поддержана Lineberger КООН всеобъемлющем онкологический центр университета онкологический научный фонд и поступательные КООН и клинических наук Институт (KL2TR001109, UL1TR001111).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Стереотаксический инструмент Just for mouseStoelting51730Поддерживает устойчивое положение головы во время операции
Флуоресцентный препарирующий стереомикроскопLeicaM165 FC Позволяет визуализировать опухоль в режиме реального времени во время резекции
Моторизованная интегрированная система стереотаксических инжекторов (ISI)Stoelting53315Позволяет точно вводить объем и скорость инъекции опухолевых клеток
Тканевый клейVetbond 3M1469Сугикальный клей для закрытия кожной раны
Искусственные слезыAkorn664268Предотвращает высыхание глаз во время операции
Спиртовые препараты WebcolCovidien6818Стерилизует место разреза
Хирургический скраб с бетадиномPurdue Fredick Company6761815117Стерилизация места разреза
Аппликаторы с ватным наконечникомFisherbrand23-400-115Хирургический инструмент
Аспирационная система E-vacArgosEV310Вакуумный насос, используемый для резекции опухоли
Фибриноген и тромбин, извлеченные из полученного TISSEELBaxterДля временного закрепления каркаса в резекционной полости
IVIS Kinetic in vivo оптическая система визуализацииCaliper Life ScienceБиолюминесцентный тепловизор
D-люциферин соль калияPerkinElmer122799Средство визуализации in vivo

Ссылки

  1. Adamson, C., et al. Glioblastoma multiforme: a review of where we have been and where we are going. Expert opinion on investigational drugs. 18 (8), 1061-1083 (2009).
  2. Asthagiri, A. R., Pouratian, N., Sherman, J., Ahmed, G., Shaffrey, M. E. Advances in Brain Tumor Surgery. Neurologic Clinics. 25 (4), 975-1003 (2007).
  3. Affronti, M., et al. Overall survival of newly diagnosed glioblastoma patients receiving carmustine wafers followed by radiation and concurrent temozolomide plus rotational multiagent chemotherapy. Cancer. 115 (15), 3501-3511 (2009).
  4. Erpolat, O., Akmansu, M., Goksel, F., Bora, H., Yaman, E., Büyükberber, S. Outcome of newly diagnosed glioblastoma patients treated by radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide: a long-term analysis. Tumori. 95 (2), 191-197 (2009).
  5. Minniti, G., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma in elderly patients. Journal of Neuro-Oncology. 88 (1), 97-103 (2008).
  6. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. The New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  7. Delgado-López, P., Corrales-García, E. Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities. Clinical and Translational Oncology. 18 (11), 1062-1071 (2016).
  8. Wu, X., et al. In vivo tracking of superparamagnetic iron oxide nanoparticle-labeled mesenchymal stem cell tropism to malignant gliomas using magnetic resonance imaging. Laboratory investigation. Journal of Neurosurgery. 108 (2), 320-329 (2008).
  9. Nakamizo, A., et al. Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the treatment of gliomas. Cancer Research. 65 (8), 3307-3318 (2005).
  10. Xu, F., Shi, J., Yu, B., Ni, W., Wu, X., Gu, Z. Chemokines mediate mesenchymal stem cell migration toward gliomas in vitro. Oncology Reports. 23 (6), 1561-1567 (2010).
  11. Park, S., et al. CXCR4-transfected human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells exhibit enhanced migratory capacity toward gliomas. International Journal of Oncology. 38 (1), 97-103 (2011).
  12. Ho, I., et al. Matrix Metalloproteinase 1 Is Necessary for the Migration of Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Toward Human Glioma. STEM CELLS. 27 (6), 1366-1375 (2009).
  13. Bexell, D., Svensson, A., Bengzon, J. Stem cell-based therapy for malignant glioma. Cancer Treatment Reviews. 39 (4), (2012).
  14. Nouri, F., Wang, X., Hatefi, A. Genetically engineered theranostic mesenchymal stem cells for the evaluation of the anticancer efficacy of enzyme/prodrug systems. Journal of Controlled Release. 200, 179-187 (2015).
  15. Kauer, T., Figueiredo, J. -L., Hingtgen, S., Shah, K. Encapsulated therapeutic stem cells implanted in the tumor resection cavity induce cell death in gliomas. Nature Neuroscience. 15 (2), 197-204 (2011).
  16. Bagó, J., Pegna, G., Okolie, O., Hingtgen, S. Fibrin matrices enhance the transplant and efficacy of cytotoxic stem cell therapy for post-surgical cancer. Biomaterials. 84, 42-53 (2016).
  17. Bagó, J., Pegna, G., Okolie, O., Mohiti-Asli, M., Loboa, E., Hingtgen, S. Electrospun nanofibrous scaffolds increase the efficacy of stem cell-mediated therapy of surgically resected glioblastoma. Biomaterials. 90, 116-125 (2016).
  18. Loebinger, M., Eddaoudi, A., Davies, D., Janes, S. Mesenchymal Stem Cell Delivery of TRAIL Can Eliminate Metastatic Cancer. Cancer Research. 69 (10), 4134-4142 (2009).
  19. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J. Vis. Exp. (12), e680(2008).
  20. Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), e1986(2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Резекция глиобластомытерапия стволовыми клеткамиимплантация скаффолдапосев МСКопухолевый тропизмфлуоресцентный трекингхирургический протоколдоклиническая модельтерапевтическая доставканавигация по изображениям
Изображение руководствуясь резекции глиобластома и внутричерепных имплантации терапевтического стволовых клеток посеян подмостей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.