В этой статье мы обсуждаем три мозга препаратов, используемых для записи зажим клеточных патч для изучения retinotectal цепь Xenopus laevis головастиков. Каждый подготовки, с свои собственные конкретные преимущества, способствует экспериментальной уступчивость Xenopus головастика как модель для изучения функции нейронные цепи.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Препараты и протоколы для всей ячейки патч зажим записи Xenopus laevis тектальный нейронов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Xenopus головастика retinotectal цепи, состоит из клеток сетчатки ганглия (РГК) в глаза, какая форма синапсов непосредственно на нейронов в оптические tectum, является популярной моделью для изучения как нейронных цепей самостоятельно собрать. Способность выполнять целом ячейки записи зажим патч от тектальный нейронов и запись RGC-вызвала ответов, либо в естественных условиях или с помощью весь мозг подготовки, вызвала большой объем данных с высоким разрешением о механизмах, лежащих в основе нормальной и аномальные, схемы формирования и функции. Здесь мы опишем, как для выполнения в естественных условиях подготовка, оригинальные весь мозг, и более недавно разработала горизонтальный мозга ломтик подготовка для получения клеточных патч зажим записи от тектальный нейронов. Каждый препарат имеет уникальные экспериментальные преимущества. В естественных условиях подготовки позволяет запись прямого ответа тектальный нейронов визуальные раздражители, проецируется на глаз. Весь мозг подготовки позволяет RGC аксоны активироваться очень контролируемым образом, и подготовка срез горизонтальных мозга запись с на всех слоях tectum.
Введение
Retinotectal схема является основным компонентом амфибия зрительной системы. Она состоит из РГК в глаза, которые проект их аксоны оптические tectum, где они образуют синаптических связей с тектальный постсинаптических нейронов. Схема retinotectal головастика Xenopus является популярной модели развития для изучения нейронные цепи формирования и функции. Существует множество атрибутов этот головастик retinotectal цепи, которые делают его мощным Экспериментальная модель1,2,3. Один из основных атрибутов и в центре внимания этой статьи, является способность выполнять клет....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета штата Вайоминг. Все процедуры, включая электрофизиологических записи, осуществляется при комнатной температуре, примерно 23 ° C. Все описанные здесь методы оптимизированы для записи тектальный нейроны от головастиков между стадии развития 42 и 49, (постановка согласно Neiuwkoop и Фабер-15).
1. Подготовка в естественных условиях
- Анестезировать головастик.
- Место головастиков в небольшой Петри, содержащий решение Стейнберга с 0,01% MS-222 примерно 5 минут.
Примечание: MS....
- Место головастиков в небольшой Петри, содержащий решение Стейнберга с 0,01% MS-222 примерно 5 минут.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для записи света вызвали ответы поля целиком вспышка света проецируется на сетчатке хотя полученный ответ записывается из отдельных нейронов тектальный (рис. 4A). Этот конкретный протокол предназначен для измерения реакции нейрона к свету включение («на «ответ) и затем выключается 15 s позднее, чтобы измерить «Off ответ.» Тектальный нейроны обычно демонстрируют надежных и выключать ответы (показано здесь в напряжение зажим режим, с нейроном з.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Все методы, описанные в этой работе оптимизированы для записи тектальный нейроны от головастиков между стадии развития 42 и 49, (постановка согласно Neiuwkoop и Фабер-15). На этапе 42, головастиков, достаточно большой и достаточно развитой так, что насекомое булавки могут быть размещены на обеих сторон мозга для записей в естественных условиях и для проведения вскрытия весь мозг. На ранних стадиях, когда головастиков по существу двумерной (т.е., плоский), описанные здесь подходы .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
При поддержке гранта NIH SBC COBRE 1P20GM121310-01.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Stemi Stereo 508 | Zeiss | 495009-0006-000 | Препарирующий микроскоп |
| MS-222 "Tricane" | Finquel | ARF5G | Амфибия Общий анестетик |
| Хлорид натрия (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Используется для приготовления раствора Стинберга и наружного раствора |
| Хлорид калия (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Используется для приготовления раствора Стинберга и наружного раствора |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-1KG | Используется для приготовления раствора Штенберга и наружного раствора |
| тетрахирата нитрата кальция (Ca(NO3) 4H2O) | Sigma-Aldrich | 237124-500G | Используется для приготовления раствора Stienberg |
| Сульфат магния (MgSO4) | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Используется для приготовления раствора Штейнберга |
| Хлорид кальция (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | Используется для приготовления раствора для внешней записи |
| Хлорид магния (MgCl2) | J.T. Baker | 2444-01 | Используется для приготовления раствора для внешней записи |
| D-глюкоза Безводный | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Используется для приготовления наружного записывающего раствора |
| Тубокурарина гидрохлорид пентагидрат | Sigma | T2379 | Антагонист никотиновых ацетилхолиновых рецепторов |
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0,1 мм диаметр нержавеющая сталь |
| Sylgard 184 Набор силиконовых эластомеров Dow | Corning | 761028 | Набор предварительно взвешенного мономера и отвердителя |
| Стерильный полистирол Чашка Петри - 60x15 мм | Fisher Scientific | AS4052 | Маленькие чашки Петри |
| Игла PrecisionGlide 25Gx5/8 (.0,5 мм x 16 мм) | BD | 305122 | иглы для шприца |
| 1 мл Скользящий наконечник Туберкулиновый шприц | BD | 309659 | Одноразовые, стерильные шприцы |
| Боросиликатное стекло для пипетки | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | Вытягивается до требуемых спецификаций с помощью машины для вытягивания пипеток |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | Изготавливает микропипетки для электрофизиологической регистрации |
| Kimwipes Салфетки Kimtech | Kimberly-Clark | 34120 | Delicate безворсовые дворники |
| для задач Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | Токовый зажим и зажим напряжения |
| Headstage MP-285 Моторизованный манипулятор с настольным контроллером | Sutter Instrument | MP-285/T | Управление для головы на электрофизиологической установке |
| Fiber-Coupled LED (зеленый) | Thorlabs | M530F2 | Оптоволоконный кабель в паре с зеленым светодиодом |
| Кластерный биполярный электрод (25&микро; m diameter) | FHC | 30207 | Биполярный стимулирующий электрод |
| ISO-Flex Stimulator | A.M.P.I. (Израиль) | Связаться с производителем | Гибкий изолятор стимулов |
| Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier | Molecular Devices | 2500-0157 | Усилитель для записи напряжения и тока |
| Digidata 1322A Дигитайзер | Molecular Devices | 2500-135 | Система сбора данных для регистрации электрофизиологии |
| Axio Examiner.A1 | Zeiss | 491404-0001-000 | Микроскоп для электрофизиологии |
| Micro-g Lab Table | TMC | 63-533 | Воздушный стол для электрофизиологического микроскопа |
| Inspiron 620 Персональный настольный компьютер с Windows 7 64-разрядный | Dell | D06D001 | Компьютер с запущенным электрофизиологическим программным обеспечением |
| c2400 ПЗС-камера | Hamamatsu | 70826-5 | Устройство с зарядовой связью камера для электрофизиологической визуализации |
| 7 часов Super Platinum Нержавеющие бритвенные лезвия | Gillette | CMM01049 | Лезвия для бритв из нержавеющей стали с платиновым покрытием |
| Трансферные пипетки | Fisher Scientific | 13-711-7M | Одноразовые полиэтиленовые трансферные пипетки |
Ссылки
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
- Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
- Liu....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
