Методическая статья

Препараты и протоколы для всей ячейки патч зажим записи Xenopus laevis тектальный нейронов

DOI:

10.3791/57465

⸱

15 марта 2018 г.

 ,  , 
1Department of Zoology and Physiology and Program in Neuroscience, University of Wyoming

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье мы обсуждаем три мозга препаратов, используемых для записи зажим клеточных патч для изучения retinotectal цепь Xenopus laevis головастиков. Каждый подготовки, с свои собственные конкретные преимущества, способствует экспериментальной уступчивость Xenopus головастика как модель для изучения функции нейронные цепи.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Xenopus головастика retinotectal цепи, состоит из клеток сетчатки ганглия (РГК) в глаза, какая форма синапсов непосредственно на нейронов в оптические tectum, является популярной моделью для изучения как нейронных цепей самостоятельно собрать. Способность выполнять целом ячейки записи зажим патч от тектальный нейронов и запись RGC-вызвала ответов, либо в естественных условиях или с помощью весь мозг подготовки, вызвала большой объем данных с высоким разрешением о механизмах, лежащих в основе нормальной и аномальные, схемы формирования и функции. Здесь мы опишем, как для выполнения в естественных условиях подготовка, оригинальные весь мозг, и более недавно разработала горизонтальный мозга ломтик подготовка для получения клеточных патч зажим записи от тектальный нейронов. Каждый препарат имеет уникальные экспериментальные преимущества. В естественных условиях подготовки позволяет запись прямого ответа тектальный нейронов визуальные раздражители, проецируется на глаз. Весь мозг подготовки позволяет RGC аксоны активироваться очень контролируемым образом, и подготовка срез горизонтальных мозга запись с на всех слоях tectum.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retinotectal схема является основным компонентом амфибия зрительной системы. Она состоит из РГК в глаза, которые проект их аксоны оптические tectum, где они образуют синаптических связей с тектальный постсинаптических нейронов. Схема retinotectal головастика Xenopus является популярной модели развития для изучения нейронные цепи формирования и функции. Существует множество атрибутов этот головастик retinotectal цепи, которые делают его мощным Экспериментальная модель1,2,3. Один из основных атрибутов и в центре внимания этой статьи, является способность выполнять клеточных патч зажим записи из тектальный нейронов, в естественных условиях или с помощью весь мозг подготовки. С буровой электрофизиологии, оснащен усилитель, который поддерживает записи режимов напряжения и тока зажим клеточных патч зажим записи позволяют электрофизиологии нейрон характеризуется высоким разрешением. В результате клеточных патч зажим записи от тектальный нейронов через основные этапы формирования retinotectal цепи представили подробное и всеобъемлющее понимание развития и пластичности встроенные4,5 , 6 , 7 и синаптическую8,9,10,11 свойства. Сочетание клеточных патч зажим тектальный нейрон записи, способствует способность выражать гены или морфолиновая интерес в этих нейронов12и метод для оценки управляемое поведение через установленных визуальных недопущение испытаний13 выявление связей между молекулами, цепи функции и поведение.

Важно отметить, что тип высокого разрешения, полученных из клеточных патч зажим записей данных возможен не с помощью новых изображений подходов, таких как генетические кальция индикатор GCaMP6, потому что хотя использование показателей кальция позволяет изображений кальция динамики через больших популяций нейронов одновременно, там нет прямого или очевидным способом что конкретных электрических параметров могут быть получены путем измерения флуоресценции Дельта в somata и нет никакого способа, чтобы напряжение зажим нейрон для измерения вольт амперных отношения. Очевидно эти два различных подхода, электрофизиологические записи и кальция изображений, обладают non перекроя сильные и генерировать различные типы данных. Таким образом наилучший подход зависит от конкретных экспериментальных вопрос решается.

Здесь мы описываем наш метод для получения клеточных патч зажим записи из нейронов оптические tectum головастика, с использованием в естественных условиях подготовка, весь мозг, и новые изменения весь мозг подготовки, которая была разработана в нашей лаборатории14 . В разделе представитель результаты мы демонстрируем экспериментальной преимущества каждого подготовки и различные виды данных, которые могут быть получены. Ограничения и сильные стороны различных препаратов, а также советы по устранению неполадок, включены в раздел "обсуждение".

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета штата Вайоминг. Все процедуры, включая электрофизиологических записи, осуществляется при комнатной температуре, примерно 23 ° C. Все описанные здесь методы оптимизированы для записи тектальный нейроны от головастиков между стадии развития 42 и 49, (постановка согласно Neiuwkoop и Фабер-15).

1. Подготовка в естественных условиях

  1. Анестезировать головастик.
    1. Место головастиков в небольшой Петри, содержащий решение Стейнберга с 0,01% MS-222 примерно 5 минут.
      Примечание: MS-222 ака «Tricaine» является общим рыб и земноводных анестезии. Головастики выращиваются в растворе Стейнберга в мм: 0.067 KCl, O 0,034 Ca (№3)2•4H2, 0,083 MgSO4•7H2O, 5,8 NaCl, 4.9 HEPES.
    2. Убедитесь, что головастика глубоко анестезированные (не отвечают и не плавание) перед переходом к шагу 2.
  2. Закрепите наркотизированных головастика погруженной силиконовые блок на полу рассекает запись блюдо.
    1. Используйте одноразовые передачи пипетки для перемещения анестезированные головастика блюдо рассечение/записи, содержащие внешние записи решение (115 мм NaCl, 2 мм хлористого калия, 3 мм CaCl2, 3 мм MgCl2, 5 мм HEPES, 1 мм глюкозы; скорректировать рН до 7,25 с помощью 10 N NaOH, осмолярность 255 мОсм).
      1. Для сведения к минимуму спонтанное мышцы дергается, добавьте блокатора рецепторов ацетилхолина, тубокурарин (100 мкм) для внешнего решения. (Как правило, это делается с помощью 200 мкл пипетки для 100 мкл запас тубокурарин 10 мм на 10 мл раствора внешних).
    2. Использование насекомых булавки, обеспечить головастика, спинной стороне вверх, погруженной блок силиконового эластомера (например Sylgard 184, таблица Материалов для деталей), который был приклеен к рассечения этаж блюдо.
      Примечание: Важно размещение контакты: разместить их на обе стороны мозга, достаточно хвостового избежать Пронзающий афферентных аксоны RGC проекта от глаз и проникают в мозг просто впереди оптические tectum (рис. 1А).
  3. Филе мозга вдоль средней линии.
    1. Для четкого представления мозга удалите кожа, мозг, делая поверхностный надрез вдоль средней линии, с помощью иглы стерильные 25-G.
    2. Филе мозга вдоль той же средней линии оси, вставляя иглу в нервной трубки и потянув аккуратно вверх (дорсально) такие, что спинная часть трубы аккуратно вырезать (разорвала) оставляя нетронутыми напольной плиты (рис. 1Б).
      Примечание: Важно, что напольной плиты нервной трубки оставить нетронутыми потому что афферентные сенсорные входы ввести tectum через напольной плиты.
  4. Удаление прозрачный желудочков мембраны, которая охватывает тектальный нейронов.
    1. Переместить запись блюдо Рог электрофизиологии и использовать наконечник пипетки сломленного стекла для удаления желудочков мембраны, обволакивающие тектальный нейрон органов ячейки. Разорвать кончик перетаскиванием его слегка через деликатную задачу стеклоочистителя.
    2. Винт пипеткой в пипетку держатель и опустите его вниз до оптических tectum через микроманипулятор.
    3. Используйте сломанной пипетку для пил желудочков мембраны от tectum.
      Примечание: Это не необходимо удалить мембрану из всего tectum; небольшое окно будет достаточно и обеспечивают доступ к большим количеством нейронов.
  5. Получите всю ячейку записи зажим патч.
    Примечание: Подход с этой точки вперед похож на проведение клеточных патч зажим записей из кусочков мозга мыши, как описано в Сегев, et al. 16 (Рис. 1C).
  6. Запишите ответы тектальный нейрон поля целиком вспышка света проецируется на сетчатке.
    1. Для проекта поля целиком вспышка света на сетчатку, разместите волоконно рядом с головастика глаз. На другом конце оптического волокна является светодиод соответствует переменный резистор, который позволяет для яркости света необходимо контролировать. Триггер светодиодный цифровой выход усилителя. Таким образом все поле, вспышки различной интенсивности света могут быть записаны (рис. 4A).

2. весь мозг подготовки

  1. Выполните шаги от 1.1 до 1.3.
    Примечание: Нет необходимости для тубокурарин внешние решения для этой подготовки.
  2. Изолируйте мозга.
    1. Использование иглы 25-G разорвать задний мозг (рисA).
    2. Чтобы изолировать весь мозг от головастика, осторожно запустите иглы под мозга, в хвостовой в ростральной направлении разорвать все боковые и брюшной соединительной ткани и нервных волокон.
  3. Закрепите мозга к блоку силиконового эластомера.
    1. После полностью освобожден, безопасные мозга к блоку кремния эластомер, поместив один через один из обонятельные луковицы и другой контактные через задний мозг (рис. 2B). Это оптимальная настройка для записи от тектальный нейронов.
  4. Переместите блюдо, содержащий закрепленного весь мозг подготовки от рассечения сферы Рог электрофизиологии. Удаление желудочков мембраны с помощью пипетки сломленного стекла как описано в шаге 1.4.
  5. Место биполярный электрод стимулирования на зрительных нервов (где участки аксона от каждого глаза крест на среднего мозга) напрямую активировать аксоны RGC.
    1. Место биполярный электрод стимулирования ростральной и почти рядом, большой средней желудочка. Зрительных нервов расположен сразу ростральной большого среднего желудочек (рис. 2B).
      1. Аккуратно опустите стимулирующих электродов вниз на зрительных нервов, таким образом, что небольшая вмятина образуется в тканях. Биполярный электрод управляется импульсный стимулятор, который позволяет сила стимуляции, чтобы точно контролировать.
  6. Выполните всю ячейку записи патч зажим (рис. 2C), как описано в Сегев, et al. 16

3. горизонтальный мозга ломтик подготовка

  1. Выполните шаги 2.1-2.3.
  2. Используйте лезвие бритвы для акцизных наиболее боковой четвертой (которые в естественных условиях соответствует наиболее спинной четвертый) одной стороны одной оптической tectum. Этот отруб делается параллельно плоскости ростральной хвостового как показано на рисунке 3A.
  3. Повторно прикрепить мозга в сторону силиконового эластомера с ломтиками стороной вверх (так, что somata и Нейропиль могут быть непосредственно доступны для записи) и поверхности желудочков головного мозга, стоящие вдали от силиконового эластомера блока (рис. 3 B) (так что биполярного электрода может быть размещен на зрительных нервов).
  4. Выполните клеточных патч зажим или местных поданной потенциальных запись (рис. 3C), как описано в Сегев, et al. 16

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для записи света вызвали ответы поля целиком вспышка света проецируется на сетчатке хотя полученный ответ записывается из отдельных нейронов тектальный (рис. 4A). Этот конкретный протокол предназначен для измерения реакции нейрона к свету включение («на «ответ) и затем выключается 15 s позднее, чтобы измерить «Off ответ.» Тектальный нейроны обычно демонстрируют надежных и выключать ответы (показано здесь в напряжение зажим режим, с нейроном з...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все методы, описанные в этой работе оптимизированы для записи тектальный нейроны от головастиков между стадии развития 42 и 49, (постановка согласно Neiuwkoop и Фабер-15). На этапе 42, головастиков, достаточно большой и достаточно развитой так, что насекомое булавки могут быть размещены на обеих сторон мозга для записей в естественных условиях и для проведения вскрытия весь мозг. На ранних стадиях, когда головастиков по существу двумерной (т.е., плоский), описанные здесь подходы ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

При поддержке гранта NIH SBC COBRE 1P20GM121310-01.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Stemi Stereo 508Zeiss495009-0006-000 Препарирующий микроскоп
MS-222 "Tricane"FinquelARF5GАмфибия Общий анестетик
Хлорид натрия (NaCl)Fisher ScientificS271-3Используется для приготовления раствора Стинберга и наружного раствора
Хлорид калия (KCl)Fisher ScientificP217-500Используется для приготовления раствора Стинберга и наружного раствора
HEPESSigma-AldrichH3375-1KGИспользуется для приготовления раствора Штенберга и наружного раствора
тетрахирата нитрата кальция (Ca(NO3) 4H2O)Sigma-Aldrich237124-500GИспользуется для приготовления раствора Stienberg   
Сульфат магния (MgSO4)Mallinckrodt Chemicals6066-04Используется для приготовления раствора Штейнберга
Хлорид кальция (CaCl2)Sigma-AldrichC5080-500GИспользуется для приготовления раствора для внешней записи
Хлорид магния (MgCl2)J.T. Baker2444-01Используется для приготовления раствора для внешней записи
D-глюкоза БезводныйMallinckrodt Chemicals6066-04Используется для приготовления наружного записывающего раствора
Тубокурарина гидрохлорид пентагидратSigmaT2379Антагонист никотиновых ацетилхолиновых рецепторов
Insect PinsFine Science Tools26002-100,1 мм диаметр нержавеющая сталь
Sylgard 184 Набор силиконовых эластомеров DowCorning761028Набор предварительно взвешенного мономера и отвердителя
Стерильный полистирол Чашка Петри - 60x15 ммFisher ScientificAS4052Маленькие чашки Петри
Игла PrecisionGlide 25Gx5/8 (.0,5 мм x 16 мм)BD305122иглы для шприца
1 мл Скользящий наконечник Туберкулиновый шприц BD309659Одноразовые, стерильные шприцы
Боросиликатное стекло для пипеткиSutter InstrumentBF150-86-10HPВытягивается до требуемых спецификаций с помощью машины для вытягивания пипеток
Flaming/Brown Micropipette PullerSutter InstrumentsP-97Изготавливает микропипетки для электрофизиологической регистрации
Kimwipes Салфетки KimtechKimberly-Clark34120Delicate безворсовые дворники
для задач Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7BMolecular Devices1-CV-7BТоковый зажим и зажим напряжения
Headstage MP-285 Моторизованный манипулятор с настольным контроллеромSutter InstrumentMP-285/TУправление для головы на электрофизиологической установке
Fiber-Coupled LED (зеленый)ThorlabsM530F2Оптоволоконный кабель в паре с зеленым светодиодом
Кластерный биполярный электрод (25&микро; m diameter)FHC30207Биполярный стимулирующий электрод
ISO-Flex StimulatorA.M.P.I. (Израиль) Связаться с производителемГибкий изолятор стимулов
Axon Instruments 700B Multipatch AmplifierMolecular Devices2500-0157Усилитель для записи напряжения и тока 
Digidata 1322A ДигитайзерMolecular Devices2500-135Система сбора данных для регистрации электрофизиологии
Axio Examiner.A1Zeiss491404-0001-000 Микроскоп для электрофизиологии
Micro-g Lab TableTMC63-533Воздушный стол для электрофизиологического микроскопа
Inspiron 620 Персональный настольный компьютер с Windows 7 64-разрядныйDellD06D001Компьютер с запущенным электрофизиологическим программным обеспечением
c2400 ПЗС-камераHamamatsu70826-5Устройство с зарядовой связью камера для электрофизиологической визуализации
7 часов Super Platinum Нержавеющие бритвенные лезвияGilletteCMM01049Лезвия для бритв из нержавеющей стали с платиновым покрытием
Трансферные пипеткиFisher Scientific13-711-7MОдноразовые полиэтиленовые трансферные пипетки

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
  2. Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
  3. Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit. Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).
  4. Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole. J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).
  5. Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit. J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).
  6. Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity. Elife. 4, 11351(2015).
  7. Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo. Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).
  8. Wu, G., Malinow, R. Cline H.T. of a central glutamatergic synapse. Science. , 972-976 (1996).
  9. Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism. Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).
  10. Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development. Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).
  11. Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
  12. Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), e705(2008).
  13. Dong, W., et al. Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum. J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
  14. Hamodi, A. S., Pratt, K. G. The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum. J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).
  15. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland. New York. (1994).
  16. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J. Vis. Exp. (112), e54024(2016).
  17. Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure. Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).
  18. Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles. Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).
  19. Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function. Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).
  20. Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles. J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in vivo

Похожие статьи