Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Протокол для передачи микроРНК в взрослого костного мозга-производные гемопоэтических стволовых клеток для включения клеточной инженерии, в сочетании с магнитной ориентации

6.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57474

⸱

18 июня 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty, Rostock University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол иллюстрирует безопасной и эффективной процедурой изменять CD133+ гемопоэтических стволовых клеток. Представленные-вирусных, магнитные на основе polyplex подход может обеспечить основу для оптимизации терапевтического стволовых клеток эффекты, а также для контроля управляемых ячейки продукта через магнитно-резонансной томографии.

Аннотация

Хотя CD133+ предоставлять высокий потенциал в области регенеративной медицины доказали гемопоэтических стволовых клеток (СК), их низкой отсева после инъекции в поврежденных тканей, а также уровень смертности наблюдается массовый клеток приводят к очень ограниченные терапевтические эффекты. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы стремились создать-вирусной основе протокол для подходящих клеточной инженерии до их администрации. Модификация человеческого CD133+ выражая СКС с помощью магнитных polyplexes микроРНК (мир) загружен была рассмотрена эффективность поглощения и безопасности, а также ориентации потенциал клеток. Опираясь на наш протокол, мы можем достичь высокой мир поглощения ставки 80 – 90%, а CD133+ свойств стволовых клеток остаются в силе. Кроме того эти измененные клетки предлагают возможность магнитной ориентации. Мы опишем здесь безопасно и весьма эффективной процедуры для модификации CD133+ СКС. Мы ожидаем этот подход для обеспечения стандартной технологии для оптимизации эффекты терапевтического стволовых клеток и для мониторинга управляемых ячейки продукта через магнитно-резонансная томография (МРТ).

Введение

CD133+ СКС представляют гетерогенных стволовых и прогениторных клеток населения с многообещающим потенциалом для регенеративной медицины. Потенциальных2,1,их hematopoietic, эндотелия и миогенных дифференциация3 позволяет CD133+ клеток, например, вносить неоваскуляризация процессов посредством дифференциации формирование новых судов и активация pro ангиогенных сигнализации паракринными механизмов4,5,6,7.

Несмотря на их высокий потенциал продемонстрирован в более чем 30 утвержденных клинических испытаний (ClinicalTrails.gov) их терапевтический результат находится в стадии обсуждения спорных4. Действительно клиническое применение ГКС сдерживается низкой удержания в органе интерес и массивные первоначальная клеточная смерть5,8,9. Дополнительные проектирование CD133+ СКС предварительного трансплантации может помочь преодолеть эти проблемы.

Одной из предпосылок эффективного клеточной терапии будет сокращение массивные первоначальной клеточной смерти для повышения приживления терапевтического соответствующих клеток10. Текущие исследования продемонстрировали огромные ячейки потери 90 – 99% в высоко перфузии органов, таких как мозг и сердце в первые 1-2 ч, независимо от типа пересаженные клетки или приложения трасса11,12,13 ,14,,1516,17,18,19,,2021. SC маркировки с помощью магнитных наночастиц (MNPs) позволяет инновационных неинвазивных стратегия к клеткам-мишеням на сайт интерес22,23,24,25,26 и одновременно позволяет ячейки мониторинга с использованием МРТ27 и магнитных частиц, изображений (MPI). Наиболее эффективным в vivo исследований применение намагниченной клеток, ориентация используемой ячейки хранения после местной администрации вместо указания ячейки после внутривенного введения23,24,28 . Таким образом наша группа разработана система доставки, состоящая из суперпарамагнетическим оксида железа наночастиц29. С этой техникой, CD133+ СКС и эндотелиальных клеток человека пупочную вену (HUVECs) эффективно могут быть направлены, как продемонстрировано в vitro попытки30,31.

Еще одно препятствие для SC терапии является враждебной среде воспалительных пораженной ткани после трансплантации, который способствует первоначальная клеточная смерть32. В дополнение к несколько предварительного кондиционирования исследований применение терапевтических соответствующих Мирс был протестированных33; успешно продемонстрировала, что анти apoptotic Мирс подавлять апоптоз в пробирке и повысить клетки приживления в vivo33. Эти малые молекулы, состоящие из 20-25 нуклеотидов, играют решающую роль в качестве посттранскрипционного модуляторы messenger РНК (мРНК) и таким образом влияет на судьбу и поведение стволовых клеток34. Кроме того введение экзогенного Мирс избежать нежелательных стабильной интеграции в принимающей генома34.

Нынешние попытки для эффективного внедрения нуклеиновых кислот (NAs) в первичных СКС главным образом основаны на рекомбинантных вирусов8,35. Несмотря на высокий трансфекции эффективность манипулирования рекомбинантной вирус представляет главным препятствием для перевода скамейке в постели, например, экспрессии генов неконтролируемой, патогенности, иммуногенность и инсерционному мутагенезу35 ,36. Таким образом-вирусных систем доставки, например на основе полимера конструкции имеют решающее значение для разработки. Среди тех polyethylenimine (PEI) представляет действительный развозной, предлагая преимущества для Мирс, например NA конденсации для защиты от деградации, сотовой, поглощаемого и внутриклеточных релиз через от англ бежать3837,. Кроме того мир Пей комплексы продемонстрировал высокую биосовместимость в клинических испытаниях39. Таким образом, наша система доставки состоит из биотинилированным разветвленной 25 кДа PEI привязан к31,с покрытием стрептавидина MNP-ядро30,40.

В этой рукописи, мы представляем всеобъемлющий протокол описания (i) ручной изоляции CD133+ SC от пожертвование костного мозга человека (БМ) с детальной характеристикой SC продукта и (ii эффективный и нежный трансфекции стратегия магнитно вирусный на полимерной основе системы доставки для генной инженерии CD133+ СКС с помощью Мирс. CD133+ СКС изолированы и магнитным обогащенный от человека грудинного пунктаты BM с помощью поверхности на основе антител магнитные активированный ячейку Сортировка (ПДК) системы. После этого жизнеспособность клеток, а также чистоту клетки анализируются с помощью проточной цитометрии. Впоследствии, готовятся мир/PEI/MNP комплексы и CD133+ СКС являются transfected. анализируются 18 h после трансфекции, эффективность поглощения и влияние трансфекции SC маркер выражения и клеток жизнеспособности. Кроме того оценки внутриклеточного распределения трансфекции комплексных соединений выполняется с помощью четырехцветную маркировки и структурированного освещения микроскопии (SIM).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Грудины человека BM для изоляции клеток был получен от информированных доноров, которые дали свое письменное согласие использовать свои образцы для исследований согласно Хельсинкской декларации. Этический Комитет университета г. Росток одобрил представленные исследования (рег. № A 2010 23, продлен в 2015 году).

1. Подготовка клетки

Примечание: Используйте гепарина натрия (BM 250 МЕ/мл) для предотвращения свертывания для экспертизы BM.

  1. CD133+ SC изоляции
    1. Подготовка необходимых решений
      1. Подготовка-фосфатный буфер (PBS) / Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) фондовый раствор (2 мм), смешивая 996 мл 1 x PBS с 4 мл ЭДТА (0,5 М). Энергично mix решение и фильтрата, с помощью фильтра 0.45 мкм. Хранить при комнатной температуре (RT).
      2. Подготовка MACS буфера путем смешивания 995 мл 2 мм PBS/ЭДТА с 5 g бычьим сывороточным альбумином (БСА). Энергично mix решение и фильтрата, с помощью фильтра 0.45 мкм. Хранить при 4 ° C.
      3. Подготовьте раствор коллагеназы B (40 мг/мл) путем разбавления 500 мг коллагеназы B (от Clostridium histolyticum) в 12,5 мл ФСБ. Энергично mix решение, сделать аликвоты 350 мкл и хранить при температуре от-20 ° C.
      4. Подготовить дезоксирибонуклеаза (DNAse) я фондовых раствора (10 мг/мл) путем разбавления 100 мг DNase I (из поджелудочной железы крупного рогатого скота) в 10 мл ФСБ. Энергично mix решение, сделать аликвоты 350 мкл и хранить при температуре от-20 ° C.
    2. Ферментативный пищеварения человека BM
      1. Предварительно теплой человеческой лимфоцитов средне RT и размораживать ферментов (1 Алиготе каждый коллагеназы B и DNAse 20 мл BM).
      2. Собирать BM от шприцев в 50 мл Конические трубки и осторожно перемешать. Отменить любые существующие тромбы.
        Примечание: Передача 200 мкл неразбавленном BM в 1,5 мл трубку для анализа гранулярных последующих потоков. Хранить при 4 ° C до использования.
      3. Передача 10 мл BM в новой 50 мл Конические трубки, добавить 6 мл PBS/ЭДТА (2 мм), 20 мл среднего человека лимфоцитов, 175 мкл коллагеназы B (40 мг/мл) и 175 мкл DNAse I (10 мг/мл). Аккуратно mix решение и Инкубируйте 30 мин на RT на шейкер. Повторите для остальных BM образца.
    3. Плотность градиентного центрифугирования
      1. Премьер 50 мл трубки плотность градиентного центрифугирования, применяя 15 мл человека лимфоцитов, разделение среднего в 50 мл трубки. Центрифуга на 1000 x g 30 s.
      2. Тщательно слой 35 мл разбавленной BM верхней части трубки фильтр градиентного центрифугирования плотности и центрифуги на 445 x g 35 мин на RT.
        Примечание: Параметры центрифуги являются низкое ускорение (3) и без тормозов (1).
      3. Осторожно извлеките трубку из центрифуги без встряхивания. Тщательно слейте ~ 20 мл из верхней четкие решения без касатьться облачный слой непосредственно поверх фильтр.
      4. Тщательно перевести облачный слой (который непосредственно поверх фильтр и содержит мононуклеарных клеток (МНК)) в новой 50 мл Конические трубки и заполнить с PBS/ЭДТА в окончательный объем 50 мл.
        Примечание: Объедините все МНК из одного пациента образца BM в одной новой трубы.
      5. Граф МНК путем перевода 10 мкл суспензии клеток 50 мл в 1,5 мл трубку. 10 мкл 3% уксусной кислоты с метиленовым синим. Осторожно смешать и применять 10 мкл в Счетной палате. Рассчитайте количество МНК.
      6. Центрифуга MNC подвеска на 300 x g 10 мин отбросить супернатант.
        Примечание: Во время центрифугирования, охладьте центрифуг от комнатной до 4 ° C.
    4. Магнитные выбор CD133+ СКС с использованием человеческого CD133 антитела связаны суперпарамагнетическим железа декстран частиц
      Примечание: Во время этого шага, работа на льду. Хранилище решений до использования при 4 ° C. Магазин макинтоши постоянного магнита, разделения столбцов и разделительный фильтр при 4 ° C.
      1. Выберите размер столбца. Для < 1.2 x 108 МНК, использование MS столбцов и для > 1.2 x 108 МНК, использовать столбцы LS (см. Таблицу материалы).
      2. Подготовить магнитных отбора для 1 x 108 всего мобильный номер, тщательно Ресуспензируйте МНК в 300 мкл буфера Маки (4 ° C). Добавьте 100 мкл FcR блокировки реагента (4 ° C) и 100 мкл CD133 антитела связаны суперпарамагнетическим железа декстран частиц (4 ° C).
      3. Аккуратно перемешать суспензию клеток и Инкубируйте 30 мин при 4 ° C. Осторожно встряхните суспензию клеток во время инкубации (x 2 – 3).
      4. Добавить 2 мл буфера Маки (4 ° C) в общей сложности 1 x 108 МНК. Осторожно перемешать суспензию клеток и центрифуги на 300 x g 10 мин при 4 ° C.
      5. Установите вверх Макинтоши магнитный держатель и прикрепить MACS постоянного магнита. Установите столбце MACS и применить разделительный фильтр на вершине.
      6. Сбалансировать первый столбец MACS MS/LS и разделительный фильтр с 0,5 мл (МС) или 3 мл (LS) буфера Маки (4 ° C).
        Примечание: Никогда не позволяйте MACS колонки просохнуть после уравновешивания.
      7. Отменить супернатант и Ресуспензируйте полученные гранулы в 500 мкл буфера Маки (4 ° C) сумма 1 x 108 ячейке. Применить суспензию клеток в разделительный фильтр.
      8. Мойте фильтр столбцов и разделительный MACS, три раза для каждого мытья с использованием 0,5 мл (МС) или 3 мл (LS) MACS буфера (4 ° C).
        Примечание: Во время третьей стирки шага, установите второй столбец МАКОВ в MACS постоянного магнита и сбалансировать второй столбец MACS MS/LS с 0,5 мл (МС) или 3 мл (LS) MACS буфера (4 ° C).
      9. Выбросите разделительный фильтр.
      10. Элюировать клетки фракции непосредственно на второй столбец МАКОВ: добавить 1 мл (МС) или 5 мл (LS) MACS буфера (4 ° C) в первый столбец MACS и удалите столбец Маки из МАКОВ постоянного магнита. Немедленно передать первый столбец MACS выше втором столбце MACS и нажмите суспензию клеток через колонку MACS, используя предоставленный поршень.
      11. Промойте колонку MACS три раза, используя для каждого мытья 0,5 мл (МС) или MACS 3 мл (LS) буфера (4 ° C).
      12. Элюировать фракция ячейки в столбце, добавив 1 мл (МС) или 5 мл (LS) MACS буфера (4 ° C) на второй столбец MACS и удаление столбца Маки из MACS постоянного магнита. Немедленно передавать второй столбец MACS выше 1,5 мл трубки (МС) или 15 мл конические трубы (LS) и нажимаем суспензию клеток через колонку MACS, используя предоставленный поршень.
      13. Центрифуга на 300 x g 10 мин при 4 ° C. Тщательно удалить супернатант и Ресуспензируйте полученные гранулы в 100 мкл буфера Маки (4 ° C).
      14. Граф CD133+ клетки: передача 6 мкл суспензии клеток в 1,5 мл трубку. Добавьте 6 мкл Трипановый синий раствор (0,4%). Осторожно смешать и применять 10 мкл в Счетной палате. Рассчитать количество CD133+ клеток.
      15. Хранить CD133+ клеток на льду до посева.
  2. Характеристика свежевыделенных CD133+ СКС
    Примечание: Следующая работа должна осуществляться в комнате защищены от яркого света (тусклое освещение только). Держите трубы, буферов и антител на льду, если не указано иное.
    1. Подготовка SCs для анализа потока гранулярных
      1. Использование двух выборок (каждый 10 мкл) BM аликвоты и один образец свежевыделенных CD133+ СКС (минимум, 1 x 10-4 клетки) для анализа. Передача клетки в 1,5 мл трубку. 10 мкл FcR блокирование реагента и заполнить с MACS буфера (4 ° C) объемом 33 мкл.
      2. Добавьте следующие антител на внутренней стороне соответствующих трубки (см. таблицу 1): анти CD34-флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC) (клон: AC136), анти CD133/2-фикоэритрин (PE) (клон: 293C 3), изотипа управления мыши IgG 2b-PE, анти CD45-аллофикоцианин (APC)-H7 (клон: 2D 1) и 7-aminoactinomycin (АВА). После того, как были добавлены все антитела, встряхните вниз стороне антитела трубки. Аккуратно перемешать раствор (конечный объем 50 мкл) и проинкубируйте втечение 10 мин при 4 ° C.
      3. Добавьте 1 mL 1 x буфера lysis эритроцитов (РБК), осторожно смешать подвеска и инкубировать на льду 10 мин центрифуги подвеска на 300 x g 10 мин при 4 ° C.
      4. Отменить супернатант и Ресуспензируйте полученные гранулы в 100 мкл PBS (4 ° C). Хранить на льду до гранулярных анализ потока.
    2. Гранулярных анализ CD133 потока+ СКС
      1. Для изучения жизнеспособности клеток и чистоту CD133+ SC, использовать адаптированные международного общества Hematotherapy и инженерных трансплантата (ISHAGE) потока цитометрии стробирования стратегии41 (см. представительным изображением на рис. 1). Используйте следующий порядок:
        Шаг 1: выбор популяции клеток (рис. 1A)
        Шаг 2: выбор CD45+ клеток (Рисунок 1B)
        Шаг 3: выбор жизнеспособных CD45+ клеток (рис. 1 c)
        Шаг 4: выбор жизнеспособных CD45+/CD34+ клеток (рис. 1 d)
        Шаг 5: выбор жизнеспособных CD45+/CD34+/CD133+ клеток (Рисунок 1E)
        Запуск потока цитометр (см. Таблицу материалы) согласно инструкциям производителя.
      2. Вычислите жизнеспособность клеток и чистоты, с помощью следующих уравнений:

figure-protocol-1   Уравнение 1

figure-protocol-2   Уравнение 2

  1. Клеточные культуры свежевыделенных CD133+ СКС
    1. Аликвота 100 x рекомбинантного человеческого цитокина дополнения в 100 мкл аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C. Оттепель один 100 x Алиготе до средней подготовки.
    2. Подготовьте CD133+ SC питательной среды, сыворотка бесплатно гемопоэтических клеток расширения средних дополнена рекомбинантного человеческого цитокина дополнение (окончательный 1 x) и 1% пенициллина/стрептомицина.
    3. Семена 5 х 104 свежезаваренным изолированные CD133+ СКС для transfection в 24-ну плита с 500 мкл питательной среды. Инкубируйте клетки при 37 ° C, 5% CO2 и 20% O2.
      Примечание: Семян 5 х 104 свежезаваренным изолированные CD133+ СКС как элемент управления для анализа гранулярных потока.

2. Подготовка Transfection комплексов

Примечание: Во время этого шага, держать всю работу пространства рибонуклеазы (РНКазы)-бесплатно, с помощью РНКазы обеззараживания решения и использовать только бесплатные РНКазы расходный материал.

  1. Подготовка мир
    Примечание: Следующая работа должна осуществляться в комнате защищены от яркого света (тусклое освещение только).
    Примечание: для мир образец: использование цианиновые 3 краска помечены прекурсоров мир и мир немеченого прекурсоров.
    1. Чтобы подготовить мир Стоковый раствор (50 мкм), развести нужное количество мир в соответствующий объем свободной от нуклеиназы воды (например, разбавляют 5 нмоль мир в 100 мкл воды). Осторожно смешать раствор, аликвота мир фондовой (5 мкл) и хранить ниже-20 ° C.
  2. Подготовка ПЭЙ
    1. Подготовьте следующие стандартные протоколы и Примечание PEI запасов концентрации31,42 PEI.
  3. Подготовка MNP
    1. Подготовить следующие стандартные протоколы MNPs и отмечаем MNP запасов концентрации31,42.
  4. Подготовка мир/PEI комплексов
    1. Подготовить 5% раствора глюкозы путем разбавления D-(+)-глюкозы в нуклеиназы свободной воды. Аккуратно перемешать раствор, аликвота фондовой (1,5 мл) и хранить при 4 ° C.
      Примечание: Следующая работа должна осуществляться в комнате защищены от яркого света (тусклое освещение только).
    2. Используйте 20 пмоль мир за хорошо 24-ну пластины30. Разбавьте мир в 5% растворе глюкозы в конечной концентрации 0,25 мир пмоль/мкл.
    3. Рассчитать количество PEI требуется на основе мир сумма (20 пмоль, шаг 2.3.1) и оптимального азота (PEI) для фосфат (всего мир) соотношение (N/P), основанный на ОПЭ запасов концентрации (шаг 2.2.1; здесь, использовался коэффициент 7,5)30. Разбавьте PEI в равное количество 5% раствора глюкозы на основе уравнения:
      figure-protocol-3
      которая перестраивает для
      figure-protocol-4    Уравнение 3
      где объем PEI в мкл и [PEI] находится в мм, и N/P (оптимизирован для этого протокола) — 0,75. 0,12 является коэффициент пересчета для мир.
    4. Добавьте предварительно разбавленного PEI в предварительно разбавленного мир и вихрь 30 s.
    5. Инкубировать комплекс для 30 мин на RT. PEI мир
  5. Подготовка мир/PEI/MNP комплексов
    Примечание: Следующая работа должна осуществляться в комнате защищены от яркого света (тусклое освещение только).
    1. При инкубации мир/PEI комплексов, подготовить MNPs, sonicating MNPs для 20 минут 35 кГц sonicating водяной бане на RT, чтобы убедиться, что частицы во взвешенном состоянии и не группировать.
    2. Рассчитайте количество необходимых MNPs (железа 3 мкг/мл) на основании MNP Стоковый раствор (шаг 2.3.1).
    3. Добавить sonicated MNPs в мир/PEI комплексы и вихревые для 30 s. инкубировать мир/PEI/MNP комплексы для 30 мин на RT.
  6. Подготовка трансфекции комплексов для четырехцветной маркировки с помощью SIM
    Примечание: Использование неподписанных прекурсоров мир.
    1. Ярлык мир с 5 цианиновые краска с помощью маркировки краска мир цианиновые 5 комплекта (см. Таблицу материалы) следуя инструкциям производителя. Измерять концентрацию окончательный мир, используя перечисленные спектрофотометр (см. Таблицу материалы) в соответствии с предварительной установки, предоставляемых производителем (нуклеиновой кислоты, РНК-40). Алиготе, которую мир (5 мкл) и хранить при температуре-80 ° C Защита от света.
    2. Ярлык Пей с ярко зеленая Флуоресценция краситель, с использованием соответствующего белка маркировки комплекта (см. Таблицу материалы) следуя инструкциям производителя. Определение концентрации выпускных PEI, с помощью Нингидрин пробу (шаг 2.2.1). Алиготе Пей (в объеме рассчитывается на основе уравнения 3) и хранить при 4 ° C, защищать от света.
    3. Метка MNPs с красителя родамин конъюгированных биотина, с использованием коэффициента 1:1,000 w/w, краситель для ПФЛ. Mix красителя родамин и MNPs параллельно подготовке мир/PEI комплекс формирования и инкубировать решение для 30 мин в темноте. Непосредственно используйте метками MNPs.

3. transfection CD133+ СКС

Примечание: Во время этого шага, держать всю работу пространства рибонуклеазы (РНКазы)-бесплатно, с помощью РНКазы обеззараживания решения и использовать только бесплатные РНКазы расходный материал
Примечание: Следующая работа должна осуществляться в комнате защищены от яркого света (тусклое освещение только).

  1. Добавьте подготовленный комплекс Мирна/PEI/MNP каплям непосредственно в соответствующие колодец, содержащие свежевыделенных CD133+ СКС в культурной среде.
  2. Смешайте нежно покачиваясь пластину и обратно. Инкубируйте клетки для 18 ч при 37 ° C, 5% CO2 и 20% O2.

4. анализ мир Transfection

  1. Изучение эффективности поглощения мир и цитотоксичность трансфекции комплексов
    Примечание: для мир образец: используйте цианиновые 3 краска помечены мир прекурсоров для оценки поглощения и не transfected CD133+ СКС для потока цитометрии управления ворот.
    Примечание: Следующая работа должна осуществляться в комнате защищены от яркого света (тусклое освещение только).
    Примечание: Держите трубы, буферов и антител на льду, если не указано иное.
    1. Подготовьте параформальдегида Стоковый раствор (ПФА, 4%), разбавляя 4 g ПФА в 100 мл PBS и Отопление решение до 80 ° C. Энергично mix решение и отрегулируйте значение рН 7.3. Аликвота PFA складе (1,5 мл) и хранить при температуре от-20 ° C.
    2. 18 ч после трансфекции, собирать каждую лунку в отдельном 1,5 мл трубки. Мыть каждый раз хорошо с 500 мкл PBS и передачи этой суспензии клеток же трубку.
    3. Центрифуга на 300 x g 10 мин при 4 ° C. Отменить супернатант и Ресуспензируйте полученные гранулы в 100 мкл буфера MACS 4 ° C.
    4. 0.5 мкл реактивной краситель Амин различие между живые и мертвые клетки, осторожно смешать подвеска и проинкубируйте втечение 10 мин при 4 ° C. Добавить 1 мл PBS (4 ° C) и центрифуги на 300 x g 10 мин при 4 ° C.
    5. Отменить супернатанта, Ресуспензируйте полученные гранулы в 100 мкл PBS, 33 мкл PFA (4%) и хранить на льду или на 4 ° C до гранулярных анализ потока.
    6. Организовать стробирования стратегия по словам представителя изображение на рисунке 2. Выполнение примеров на проточный цитометр (см. Таблицу материалы) согласно инструкциям производителя.
  2. Характеристика мир transfected CD133+ СКС
    Примечание: Используемые мир немеченого прекурсоров, а также не transfected CD133+ СКС для потока цитометрии управления ворот.
    1. Собирать каждый хорошо в отдельном 1,5 мл трубку и центрифуги на 300 x g 10 мин при 4 ° C.
    2. Использование стробирования стратегии, как описано в шаге 1.2.
  3. Экспертиза внутриклеточного распределения трансфекции комплексов SIM
    1. Подготовить комплексы и transfect клетки, как описано в раздел 2 и раздел 3.
    2. 18 ч после трансфекции, собирать каждую лунку в отдельном 1,5 мл трубки. Мыть каждый раз хорошо с 500 мкл PBS и передачи мыть в хорошо соответствующих трубку. Центрифуга на 300 x g 10 мин при 4 ° C.
    3. Отменить супернатант Ресуспензируйте полученные гранулы в 1 мл 2% плода бычьим сывороточным (ФБС) в PBS, осторожно смешать подвеска и центрифуги на 300 x g 10 мин при 4 ° C.
    4. Отменить супернатанта, Ресуспензируйте полученные гранулы в 100 мкл PBS и мкл 33 PFA (4%) за 20 мин.
    5. Перевести суспензию клеток в новой пластины 24-культура, содержащие стерильные стеклянные coverslips и центрифуги на 300 x g 10 мин при 4 ° C.
    6. Отменить супернатант и 500 мкл PBS. Осторожно встряхнуть пластину и отбросить PBS.
    7. Поместите подготовленные coverslips на микроскопических слайдов, используя водный монтажа средних сохранения флуоресценции и высушите их на RT для по крайней мере 1 час.
    8. Получение изображений с помощью 100 X нефти погружения цель. Параметры SIM: 405, 488, 561 и 633 нм лазерные линии возбуждения и z стеки с 16-разрядной глубиной 3 углом, 3 фазы, с среднем 4, сетки на лазерной линии: 23 мкм – 405, 34 мкм – 488, 42 µm – 561, 51 мкм – 633.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Представленные протокол описывает ручной изоляции и магнитного обогащения человеческого CD133 BM-производные+ СКС с последующей вирус независимых ячейки инженерной стратегии, как неинвазивных технологий в пробирке клеток манипуляции и в VIVO инструментом контроля.

Эта технология трехступенчатой изоляции позволяет разделение МНК из предварительно переваривается грудинного BM через плотность градиентно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В последние годы, CD133+ СКС появились как перспективный популяции клеток для терапии на базе СК, о чем свидетельствуют несколько фазы I, II и III клинических испытаний43,,4445,46, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 ,<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют никакого конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана федеральным министерством образования и научных исследований Германии (FKZ 0312138A и FKZ 316159), государство Мекленбург-Западная Померания с структурных фондов ЕС (ПФ/IVWM-B34-0030/10 и ESF/IVBM-B35-0010/12) и DFG (DA1296/2-1), Немецкий кардиологический фонд (F/01/12), BMBF (VIP + 00240) и влажный фундамент. Кроме того F.H. и вечера поддерживаются FORUN программа по Ростке университета медицинский центр (889001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
7-AADBD Biosciences559925
уксусной кислотой с метиленовым синимстволовыми клетками Технологии70603%
анти-CD133/2-PE (клон: 293C3)Miltenyi Biotec GmbH130-090-853
анти-CD34-FITC (клон: AC136)Miltenyi Biotec GmbH130-081-001
анти-CD45-APC-H7 (клон: 2D1)BD Biosciences
краситель родамин; Atto 565 краситель конъюгированный с биотиномATTO-TEC GmbHAD 565-71
BD FACS LSRII проточный цитометрBD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2BD Biosciences
BSASigma-Aldrich GmbHA7906
CD133 антитела суперпарамагнитные частицы декстрана железа; CD133 MicroBead KitMiltenyi Biotec GmbH130-097-049
коллагеназа BRoche Diagnostics GmbH11088831001
счетная камераPaul Marienfeld GmbH & Co. KG
Cyanine 3 меченый прекурсор miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1AmbionAM17120
Cyanine 5 Dye miR label kit; Cy5 краситель Label IT miRNA Labeling KitMirus BioMIR 9650
DNAse IRoche Diagnostics GmbH10104159001(100 U/mL)
ELYRA PS.1 LSM 780 конфокальный микроскопCarl Zeiss Jena GmbH
FcR Blocking Reagent, человекMiltenyi Biotec GmbH130-059-901
ярко-зеленый набор для мечения белка; Oregon Green 488 Набор для маркировки белкаThermo Fisher ScientificO10241
водная монтажная среда; ФлюорощитSigma-Aldrich GmbHF6182
центрифужная трубка с градиентом плотности; Leukosep Centrifuge TubeGreiner Bio-One89048-932
Магнитный держатель MACS; MACS MultiStandMiltenyi Biotec GmbH130-042-303
Фильтр предварительной сепарации MACSMiltenyi Biotec GmbH130-041-40730 &; m
Разделительная колонна MACS (MS/LS)Miltenyi Biotec GmbH130-042-201 / 130-042-401
Постоянный магнит MACS; Сепаратор MACSMiltenyi Biotec GmbH130-042-302
Millex-HV PVDF ФильтрMerckSLHV013SL0,45 μ m
мышь IgG 2b-PEMiltenyi Biotec GmbH130-092-215
аминовый реактивный краситель; Near-IR LIVE/DEAD Исправляемый набор для окрашивания мертвых клетокThermo Fisher ScientificL10119
среда для разделения лимфоцитов человека; PancollPan Biotech GmbHP04-60500плотность: 1,077 г/мл
PBSPan Biotech GmbHP04-53500без Ca и Mg
PEISigma-Aldrich GmbH408727разветвленный; 25 кДа
пенициллин/стрептомицинThermo Fisher Scientific15140122100 ед/мл, 100 мкм; г/мл
ПФАMerck Schuchardt OHG1040051000
немеченый предшественник miR; Pre-miR miРНК Предшественник Negative Control #1AmbionAM17110
RBC лизис буферeBioscience00-4333-57
РНКаза раствор для обеззараживания; РНКазеZapThermo Fisher ScientificAM9780
среда лимфоцитов человека; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mediumPan Biotech GmbHP04-16500
рекомбинантная добавка цитокинов человека; StemSpan CC100Stemcell Technologies2690
бессывороточная среда для размножения гемопоэтических клеток; StemSpan H3000Технологии стволовых клеток9800
Стрептавидин MagneSphere Парамагнитные частицыPromega CorporationZ5481
Трипановый синий растворSigma-Aldrich GmbHT81540,4 %
UltraPure EDTAThermo Fisher Scientific155750200,5 М; pH 8,0
ZEN2011 программное обеспечениеCarl Zeiss Jena GmbH
NanoDrop 1000 СпектрофотометрThermo Fisher Scientific
Sonorex RK 100 SH ультразвуковая водяная баняBandelin электронныйУльтразвуковая номинальная мощность: 80 Вт; Частота ультразвука: 35 кГц
560178

Ссылки

  1. Meregalli, M., Farini, A., Belicchi, M., Torrente, Y. CD133(+) cells isolated from various sources and their role in future clinical perspectives. Expert opinion on biological therapy. 10 (11), 1521-1528 (2010).
  2. Lee, S., Yoon, Y. -S. Revisiting cardiovascular regeneration with bone marrow-derived angiogenic and vasculogenic cells. British journal of pharmacology. 169 (2), 290-303 (2013).
  3. Beksac, M., Preffer, F. Is it time to revisit our current hematopoietic progenitor cell quantification methods in the clinic? Bone marrow transplantation. 47 (11), 1391-1396 (2012).
  4. Bongiovanni, D., et al. The CD133+ cell as advanced medicinal product for myocardial and limb ischemia. Stem cells and development. 23 (20), 2403-2421 (2014).
  5. Wang, X., et al. The Clinical Status of Stem Cell Therapy for Ischemic Cardiomyopathy. Stem cells international. 2015, 135023(2015).
  6. Ma, N., et al. Intramyocardial delivery of human CD133+ cells in a SCID mouse cryoinjury model: Bone marrow vs. cord blood-derived cells. Cardiovascular research. 71 (1), 158-169 (2006).
  7. Rafii, S., Lyden, D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nature medicine. 9 (6), 702-712 (2003).
  8. Wang, D., Gao, G. State-of-the-art human gene therapy: part I. Gene delivery technologies. Discovery medicine. 18 (97), 67-77 (2014).
  9. Sart, S., Ma, T., Li, Y. Preconditioning stem cells for in vivo delivery. BioResearch open access. 3 (4), 137-149 (2014).
  10. Liu, J., et al. Early stem cell engraftment predicts late cardiac functional recovery: preclinical insights from molecular imaging. Circulation. Cardiovascular imaging. 5 (4), 481-490 (2012).
  11. Lang, C., et al. In vivo comparison of the acute retention of stem cell derivatives and fibroblasts after intramyocardial transplantation in the mouse model. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 41 (12), 2325-2336 (2014).
  12. Goussetis, E., et al. Intracoronary infusion of CD133+ and CD133-CD34+ selected autologous bone marrow progenitor cells in patients with chronic ischemic cardiomyopathy: cell isolation, adherence to the infarcted area, and body distribution. Stem cells. 24 (10), Dayton, Ohio. 2279-2283 (2006).
  13. Caveliers, V., et al. In vivo visualization of 111In labeled CD133+ peripheral blood stem cells after intracoronary administration in patients with chronic ischemic heart disease. Q J Nucl Med Mol Imaging. 51 (1), 61-66 (2007).
  14. Terrovitis, J. V., Smith, R. R., Marbán, E. Assessment and optimization of cell engraftment after transplantation into the heart. Circulation research. 106 (3), 479-494 (2010).
  15. Rosado-de-Castro, P. H., et al. Biodistribution of bone marrow mononuclear cells after intra-arterial or intravenous transplantation in subacute stroke patients. Regenerative medicine. 8 (2), 145-155 (2013).
  16. Kang, W. J., Kang, H. -J., Kim, H. -S., Chung, J. -K., Lee, M. C., Lee, D. S. Tissue distribution of 18F-FDG-labeled peripheral hematopoietic stem cells after intracoronary administration in patients with myocardial infarction. Journal of nuclear medicine official publication, Society of Nuclear Medicine. 47 (8), 1295-1301 (2006).
  17. Blocklet, D., et al. Myocardial homing of nonmobilized peripheral-blood CD34+ cells after intracoronary injection. Stem cells. 24 (2), Dayton, Ohio. 333-336 (2006).
  18. Penicka, M., et al. One-day kinetics of myocardial engraftment after intracoronary injection of bone marrow mononuclear cells in patients with acute and chronic myocardial infarction. Heart (British Cardiac Society). 93 (7), 837-841 (2007).
  19. Schächinger, V., et al. Pilot trial on determinants of progenitor cell recruitment to the infarcted human myocardium. Circulation. 118 (14), 1425-1432 (2008).
  20. Dedobbeleer, C., et al. Myocardial homing and coronary endothelial function after autologous blood CD34+ progenitor cells intracoronary injection in the chronic phase of myocardial infarction. Journal of cardiovascular pharmacology. 53 (6), 480-485 (2009).
  21. Musialek, P., et al. Randomized transcoronary delivery of CD34(+) cells with perfusion versus stop-flow method in patients with recent myocardial infarction: Early cardiac retention of (m)Tc-labeled cells activity. Journal of nuclear cardiology official publication of the American Society of Nuclear Cardiology. 18 (1), 104-116 (2011).
  22. Kyrtatos, P. G., et al. Magnetic tagging increases delivery of circulating progenitors in vascular injury. JACC. Cardiovascular interventions. 2 (8), 794-802 (2009).
  23. Vandergriff, A. C., et al. Magnetic targeting of cardiosphere-derived stem cells with ferumoxytol nanoparticles for treating rats with myocardial infarction. Biomaterials. 35 (30), 8528-8539 (2014).
  24. Huang, Z., et al. Magnetic targeting enhances retrograde cell retention in a rat model of myocardial infarction. Stem cell research & therapy. 4 (6), 149(2013).
  25. Yanai, A., et al. Focused magnetic stem cell targeting to the retina using superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Cell transplantation. 21 (6), 1137-1148 (2012).
  26. Arbab, A. S., Jordan, E. K., Wilson, L. B., Yocum, G. T., Lewis, B. K., Frank, J. A. In vivo trafficking and targeted delivery of magnetically labeled stem cells. Human gene therapy. 15 (4), 351-360 (2004).
  27. Cores, J., Caranasos, T. G., Cheng, K. Magnetically Targeted Stem Cell Delivery for Regenerative Medicine. Journal of functional biomaterials. 6 (3), 526-546 (2015).
  28. Cheng, K., et al. Magnetic enhancement of cell retention, engraftment, and functional benefit after intracoronary delivery of cardiac-derived stem cells in a rat model of ischemia/reperfusion. Cell transplant. 21 (6), 1121-1135 (2012).
  29. Li, W., et al. Enhanced thoracic gene delivery by magnetic nanobead-mediated vector. The journal of gene medicine. 10 (8), 897-909 (2008).
  30. Müller, P., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem cells international. 2016, 7152761(2016).
  31. Voronina, N., et al. Non-viral magnetic engineering of endothelial cells with microRNA and plasmid-DNA-An optimized targeting approach. Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. , (2016).
  32. Noort, W. A., et al. Mesenchymal stromal cells to treat cardiovascular disease: strategies to improve survival and therapeutic results. Panminerva Med. 52 (1), 27-40 (2010).
  33. Jakob, P., Landmesser, U. Role of microRNAs in stem/progenitor cells and cardiovascular repair. Cardiovascular Research. 93 (4), 614-622 (2012).
  34. Sen, C. K. MicroRNAs as new maestro conducting the expanding symphony orchestra of regenerative and reparative medicine. Physiological genomics. 43 (10), 517-520 (2011).
  35. Papapetrou, E. P., Zoumbos, N. C., Athanassiadou, A. Genetic modification of hematopoietic stem cells with nonviral systems: past progress and future prospects. Gene therapy. 12, Suppl 1. S118-S130 (2005).
  36. Chira, S., et al. Progresses towards safe and efficient gene therapy vectors. Oncotarget. 6 (31), 30675-30703 (2015).
  37. Hobel, S., Aigner, A. Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo. Wiley interdisciplinary reviews. Nanomedicine and nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).
  38. Villate-Beitia, I., Puras, G., Zarate, J., Agirre, M., Ojeda, E., Pedraz, J. L. First Insights into Non-invasive Administration Routes for Non-viral Gene Therapy. Gene Therapy - Principles and Challenges. Hashad, D. , (2015).
  39. Cubillos-Ruiz, J. R., Sempere, L. F., Conejo-Garcia, J. R. Good things come in small packages: Therapeutic anti-tumor immunity induced by microRNA nanoparticles. Oncoimmunology. 1 (6), 968-970 (2012).
  40. Schade, A., et al. Magnetic nanoparticle based nonviral microRNA delivery into freshly isolated CD105(+) hMSCs. Stem Cells Int. 2014, 197154(2014).
  41. Sutherland, D. R., Anderson, L., Keeney, M., Nayar, R., Chin-Yee, I. The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry. International society of hematotherapy and graft engineering. Journal of hematotherapy. 5 (3), 213-226 (1996).
  42. Voronina, N., et al. Preparation and in vitro characterization of magnetized mir-modified endothelial cells. Journal of visualized experiments. (123), (2017).
  43. Stamm, C., et al. Intramyocardial delivery of CD133+ bone marrow cells and coronary artery bypass grafting for chronic ischemic heart disease:Safety and efficacy studies. The journal of thoracic and cardiovascular surgery. 133 (3), 717-725 (2007).
  44. King, A., et al. REpeated AutoLogous Infusions of STem cells In Cirrhosis (REALISTIC): A multicentre, phase II, open-label, randomised controlled trial of repeated autologous infusions of granulocyte colony-stimulating factor (GCSF) mobilised CD133+ bone marrow stem cells in patients with cirrhosis. A study protocol for a randomised controlled trial. BMJ open. 5 (3), e007700(2015).
  45. Martinez, H. R., et al. Stem cell transplantation in amyotrophic lateral sclerosis patients: methodological approach, safety, and feasibility. Cell transplantation. 21 (9), 1899-1907 (2012).
  46. Jimenez-Quevedo, P., et al. Selected CD133(+) progenitor cells to promote angiogenesis in patients with refractory angina: final results of the PROGENITOR randomized trial. Circulation research. 115 (11), 950-960 (2014).
  47. Raval, A. N., et al. Bilateral administration of autologous CD133+ cells in ambulatory patients with refractory critical limb ischemia: lessons learned from a pilot randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Cytotherapy. 16 (12), 1720-1732 (2014).
  48. Andreone, P., et al. Reinfusion of highly purified CD133+ bone marrow-derived stem/progenitor cells in patients with end-stage liver disease: A phase I clinical trial. Digestive and liver disease. 47 (12), 1059-1066 (2015).
  49. Arici, V., et al. Autologous immuno magnetically selected CD133+ stem cells in the treatment of no-option critical limb ischemia: clinical and contrast enhanced ultrasound assessed results in eight patients. Journal of translational medicine. 13, 342(2015).
  50. Zali, A., et al. Intrathecal injection of CD133-positive enriched bone marrow progenitor cells in children with cerebral palsy: feasibility and safety. Cytotherapy. 17 (2), 232-241 (2015).
  51. Al-Zoubi, A., et al. Transplantation of purified autologous leukapheresis-derived CD34+ and CD133+ stem cells for patients with chronic spinal cord injuries: long-term evaluation of safety and efficacy. Cell transplantation. 23, Suppl 1. S25-S34 (2014).
  52. Isidori, A., et al. Positive selection and transplantation of autologous highly purified CD133(+) stem cells in resistant/relapsed chronic lymphocytic leukemia patients results in rapid hematopoietic reconstitution without an adequate leukemic cell purging. Biology of blood and marrow transplantation. 13 (10), 1224-1232 (2007).
  53. Nasseri, B. A., et al. Autologous CD133+ bone marrow cells and bypass grafting for regeneration of ischaemic myocardium: the Cardio133 trial. European heart journal. 35 (19), 1263-1274 (2014).
  54. Steinhoff, G., et al. Cardiac Function Improvement and Bone Marrow Response -: Outcome Analysis of the Randomized PERFECT Phase III Clinical Trial of Intramyocardial CD133(+) Application After Myocardial Infarction. EBioMedicine. 22, 208-224 (2017).
  55. Muller, P., et al. Intramyocardial fate and effect of iron nanoparticles co-injected with MACS(R) purified stem cell products. Biomaterials. 135, 74-84 (2017).
  56. Müller, P., Gaebel, R., Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Data on the fate of MACS® MicroBeads intramyocardially co-injected with stem cell products. Data in brief. 13, 569-574 (2017).
  57. Skorska, A., et al. GMP-conformant on-site manufacturing of a CD133+ stem cell product for cardiovascular regeneration. Stem cell research & therapy. 8 (1), 33(2017).
  58. Delyagina, E., Li, W., Ma, N., Steinhoff, G. Magnetic targeting strategies in gene delivery. Nanomedicine (Lond). 6 (9), 1593-1604 (2011).
  59. Schade, A., et al. Innovative strategy for microRNA delivery in human mesenchymal stem cells via magnetic nanoparticles. International journal of molecular sciences. 14 (6), 10710-10726 (2013).
  60. Delyagina, E., et al. Improved transfection in human mesenchymal stem cells: Effective intracellular release of pDNA by magnetic polyplexes. Nanomedicine. 9 (7), London, England. 999-1017 (2014).
  61. Yin, H., Kanasty, R. L., Eltoukhy, A. A., Vegas, A. J., Dorkin, J. R., Anderson, D. G. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
  62. Chen, J., Guo, Z., Tian, H., Chen, X. Production and clinical development of nanoparticles for gene delivery. Molecular therapy. Methods & clinical development. 3, 16023(2016).
  63. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6518-6548 (2016).
  64. Soenen, S. J., Rivera-Gil, P., Montenegro, J. -M., Parak, W. J., de Smedt, S. C., Braeckmans, K. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano today. 6 (5), 446-465 (2011).
  65. Estelrich, J., Sánchez-Martín, M. J., Busquets, M. A. Nanoparticles in magnetic resonance imaging: From simple to dual contrast agents. International journal of nanomedicine. 10, 1727-1741 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

CD133
Протокол для передачи микроРНК в взрослого костного мозга-производные гемопоэтических стволовых клеток для включения клеточной инженерии, в сочетании с магнитной ориентации
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.