Все патогенных видов Leishmania проживают и репликацию внутри макрофагов их позвоночных хозяев. Здесь мы представляем протокол заразить мышиных макрофаги костного мозга, полученных в культуре с лейшманий, следуют точную количественную оценку роста внутриклеточных кинетики. Этот метод полезен для изучения отдельных факторов, влияющих на взаимодействие хост возбудителя и лейшмании вирулентности.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Количественная оценка внутриклеточных роста внутри макрофагов является быстрый и надежный метод оценки вирулентности лейшмании паразитов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Жизненный цикл лейшманий, возбудителя лейшманиоз, попеременно Промастиготы и amastigote этапов внутри насекомого и позвоночных хозяев, соответственно. Хотя патогенные симптомы лейшманиоза может широко варьировать, от доброкачественных кожных высоко смертельным заболеванием висцеральных форм в зависимости от видов инфекционный, всех видов Leishmania находятся внутри узла макрофаги этапе позвоночных их жизненный цикл. Таким образом, лейшмании инфективности напрямую связана с его способность вторгнуться, выжить и воспроизвести в пределах parasitophorous вакуоли (PVs) внутри макрофагов. Таким образом оценки паразита возможность реплицировать внутриклеточно служит надежный метод для определения вирулентности. Изучение развития лейшманиоз, с использованием животных моделей является длительным, утомительно и часто трудно, особенно с разработаны патогенетически важные висцеральные формы. Здесь мы описываем методологии следовать внутриклеточных развитие лейшманий в костный мозг производные макрофагов (BMMs). Внутриклеточный паразит чисел определяются интервалом 24 ч для 72-96 h после инфицирования. Этот метод позволяет для надежного определения воздействия различных генетических факторов на лейшманий вирулентности. В качестве примера мы покажем, как исключить один аллель гена лейшмании митохондриальной железа транспортера (LMIT1) ухудшает способность мутантный штамм лейшмании amazonensis LMIT1/ΔLmit1 расти внутри BMMs, отражая резкое сокращение в вирулентности, по сравнению с одичал типа. Этот assay также позволяет точно контролировать экспериментальных условиях, которые могут управляться индивидуально для анализа влияния различных факторов (питательные вещества, реактивнооксигенных видов, и т.д.) на хост возбудитель взаимодействия. Таким образом соотвествующего исполнения и количественной оценки BMM инфекции исследования обеспечивают неинвазивный, быстрым, экономичным, безопасный и надежный альтернативу обычным животной модели исследования.
Введение
Лейшманиоз ссылается на широкий спектр человеческих заболеваний, вызванных простейших паразитов видов рода Leishmania. В настоящее время примерно 12 миллионов человек инфицированы лейшмании во всем мире, и более чем 350 миллионов подвергаются риску. Патологии болезни зависит от видов Leishmania и принимающих факторов, и симптомы варьируются от безобидных самовосстановления поражениях кожи смертоносных visceralizing формы. Если untreated, Висцеральный лейшманиоз является фатальным, рейтинг только после малярии как смертоносных болезней человека, вызванного инфекцией с простейших паразитов1. Несмотря на широкие различия....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все экспериментальные процедуры были проведены в соответствии с рекомендаций, содержащихся в руководстве для ухода и использования лабораторных животных, национальные институты здравоохранения и были одобрены IACUC университета штата Мэриленд. Все шаги, описанные в разделах с 1 по 4 должно осуществляться асептически внутри биологических ламинарные шкафы. Личная защита должна использоваться, и следует проявлять осторожность при обработке живой лейшмании паразитов на всех этапах экспериментов.
1. изоляция и дифференциации костного мозга-производные макрофагов (BMMs)8,,30
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Лейшмании имеет две формы инфекционный - metacyclic promastigotes, что дифференцировать от procyclic promastigotes на стационарном этапе культуры и amastigotes, которые являются внутриклеточные стадии (рис. 1). В некоторых видов Leishmania , таких как л amazonensisamastigotes может также быть продифференцированным в стерильных культуры, сдвигая Промастиготы клетки для снижения pH (4.5) и при повышенной температуре (32 ° C), условия,.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Количественные данные, подготовленные пробирного BMM инфекции, описанных выше, позволяет следователям получить показатели инфицирования и надежного определения изменения вирулентности свойств в относительно короткий период времени (максимум 2 недели, по сравнению с 2 месяцев, необходимых для экспериментов в естественных условиях ). Этот метод основывается на конкретных краситель ДНК DAPI, который специально пятна макрофагов и паразита ядер и позволяет быстрое выявление и количественная оценка инфицированных клет.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов,
Благодарности
Эта работа была поддержана национальными институтами здравоохранения грант RO1 AI067979 NWA.
YK является получателем Бакалавриат стипендии от Говард Хьюз медицинский институт/Университет Мэриленд, Колледж Парк.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 6-луночный планшет для культивирования клеток | Cellstar | 657160 | |
| Аденин | Акрос Органики | AC147440250 | |
| Аэрозольный барьер Наконечники для пипеток (100-1000; L) | Fisherbrand | 02-707-404 | |
| Наконечники для аэрозольных барьеров для пипеток (20-200 μ L) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
| Наконечники для дозаторов с аэрозольным барьером (2-20; L) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
| Bard-Parker ребристая спинка из углеродистой стали хирургическое лезвие #10 | Aspen Surgical | 371110 | |
| BD Luer-Lok Tip 10 мл шприц | Becton Dickinson (BD) | 309604 | |
| BD Precisionglide Needle, 25G | Becton Dickinson (BD) | 305124 | |
| Чашка для клеточных культур 35 мм x 10 мм | Cellstar | 627 160 | |
| Колба для клеточных культур | Cellstar | 660175 | |
| Покровные стаканы: круги 12 мм | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| DAPI (4',6-Диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорид) | Invitrogen | D1306 | |
| D-биотин | J.T. Baker | C272-00 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | |
| Этиловый спирт 200 proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Falcon 100 мм x 15 мм необработанный ТК полистирол чашка Петри | Corning | 351029 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Seradigm | 1500-500 | |
| Ficoll400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Флуоресцентный микроскоп | Nikon | E200 | |
| Козий антимышиный IgG Техасский красный | Invitrogen | T-862 | |
| Козий антикролик IgG AlexaFluor488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Hemin | Tokyo Chemical Industry Co. Ltd | H0008 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter | ||
| L-глютамин | Gemini | 400-106 | |
| Medium 199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Na pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Параформальдегид | Alfa Aesar | 43368 | |
| Пенициллин/стрептомицин | Gemini | 400-109 | |
| Фосфатный буферный раствор (-/-) | ThermoFisher | 14200166 | |
| Полипропилиновые конические центрифужные пробирки 15 мл | Cellstar | 188 271 | |
| Полипропилиновые конические центрифужные пробирки 50 мл | Cellstar | 227 261 | |
| ProLong Gold противовыцветающий реагент | ThermoFisher | P36930 | |
| Крыса антимышиная лампа-1 антитела | Исследования развития гибридома банка | 1D4B | |
| Рекомбинантный человеческий M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| Reichert Bright-Line Гемоцитометр | Hausser Scientific | 1492 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Triton X-100 Поверхностно-активное вещество | Millipore Sigma | TX1568-1 | |
| Trypan | Blue Sigma | Aldrich T8154 | |
| Деликатные ножницы, 4 1/2" | VWR | 82027-582 | |
| Щипцы для препарирования, тонкий наконечник | VWR | 82027-386 | |
| Предметные стекла микроскопа | VWR | 16004-368 | |
| Z1 Coulter счетчик частиц, двухпороговый | Beckman Coulter | 6605699 |
Ссылки
- WHO. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser. (949), (2010).
- Naderer, T., McConville, M. J. Intracellular growth and pathogenesis of Leishmania parasites. Essays Biochem. 51, 81-95 (2011).
- Rosenzweig, D., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
