Методическая статья

Количественная оценка внутриклеточных роста внутри макрофагов является быстрый и надежный метод оценки вирулентности лейшмании паразитов

DOI:

10.3791/57486

⸱

16 марта 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все патогенных видов Leishmania проживают и репликацию внутри макрофагов их позвоночных хозяев. Здесь мы представляем протокол заразить мышиных макрофаги костного мозга, полученных в культуре с лейшманий, следуют точную количественную оценку роста внутриклеточных кинетики. Этот метод полезен для изучения отдельных факторов, влияющих на взаимодействие хост возбудителя и лейшмании вирулентности.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Жизненный цикл лейшманий, возбудителя лейшманиоз, попеременно Промастиготы и amastigote этапов внутри насекомого и позвоночных хозяев, соответственно. Хотя патогенные симптомы лейшманиоза может широко варьировать, от доброкачественных кожных высоко смертельным заболеванием висцеральных форм в зависимости от видов инфекционный, всех видов Leishmania находятся внутри узла макрофаги этапе позвоночных их жизненный цикл. Таким образом, лейшмании инфективности напрямую связана с его способность вторгнуться, выжить и воспроизвести в пределах parasitophorous вакуоли (PVs) внутри макрофагов. Таким образом оценки паразита возможность реплицировать внутриклеточно служит надежный метод для определения вирулентности. Изучение развития лейшманиоз, с использованием животных моделей является длительным, утомительно и часто трудно, особенно с разработаны патогенетически важные висцеральные формы. Здесь мы описываем методологии следовать внутриклеточных развитие лейшманий в костный мозг производные макрофагов (BMMs). Внутриклеточный паразит чисел определяются интервалом 24 ч для 72-96 h после инфицирования. Этот метод позволяет для надежного определения воздействия различных генетических факторов на лейшманий вирулентности. В качестве примера мы покажем, как исключить один аллель гена лейшмании митохондриальной железа транспортера (LMIT1) ухудшает способность мутантный штамм лейшмании amazonensis LMIT1/ΔLmit1 расти внутри BMMs, отражая резкое сокращение в вирулентности, по сравнению с одичал типа. Этот assay также позволяет точно контролировать экспериментальных условиях, которые могут управляться индивидуально для анализа влияния различных факторов (питательные вещества, реактивнооксигенных видов, и т.д.) на хост возбудитель взаимодействия. Таким образом соотвествующего исполнения и количественной оценки BMM инфекции исследования обеспечивают неинвазивный, быстрым, экономичным, безопасный и надежный альтернативу обычным животной модели исследования.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лейшманиоз ссылается на широкий спектр человеческих заболеваний, вызванных простейших паразитов видов рода Leishmania. В настоящее время примерно 12 миллионов человек инфицированы лейшмании во всем мире, и более чем 350 миллионов подвергаются риску. Патологии болезни зависит от видов Leishmania и принимающих факторов, и симптомы варьируются от безобидных самовосстановления поражениях кожи смертоносных visceralizing формы. Если untreated, Висцеральный лейшманиоз является фатальным, рейтинг только после малярии как смертоносных болезней человека, вызванного инфекцией с простейших паразитов1. Несмотря на широкие различия в патологии заболеваний и симптомов всех видов Leishmania имеют жизненный цикл digenic, чередуя Промастиготы и amastigote этапов внутри насекомых и позвоночных хозяев, соответственно. Внутри позвоночных, лейшмании целевой хост макрофагов для вторжения и вызвать образование parasitophorous вакуоли (PVs), кислой отсеков с свойства фаголизосомах скопирована Высоко вирулентным amastigote формы. Amastigotes сохраняется в тканях хост во время хронической инфекции и может быть передан на неинфицированных москитов, завершая цикл передачи. Таким образом в контексте развития болезней человека, amastigotes являются наиболее важным лейшмании жизненного цикла формы2. Расследование, как amastigotes репликацию внутри макрофагов PVs имеет решающее значение для понимания лейшмании вирулентности3,4,5,6,7 и для Разработка новых эффективных терапии.

Здесь мы описываем метод регулярно используется в нашей лаборатории для изучения лейшмании инфекции и репликации в костный мозг производные макрофагов (BMMs), который включает количественную оценку числа внутриклеточных лейшмании со временем. Этот процесс включает сбор моноциты из костного мозга мыши и дифференцировку макрофагов в культуре, в vitro инфекцию с инфекционный формы (metacyclic promastigotes или amastigotes) Leishmania и количественной оценки количество внутриклеточных паразитов в каждом интервале 24 ч в течение 72-96 ч после инфицирования. В нашей лаборатории был использован этот assay для определения влияния нескольких экологических факторов и паразита генов, включая определение критической роли железа в содействии вирулентности L. amazonensis , который был также подтвержден зверолов исследований развития поражения в мышей6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Поскольку все патогенных видов Leishmania установить их репликативной нишу внутри узла макрофагов, этот assay может использоваться универсально для вирулентности определений всех видов Leishmania .

Выполнение BMM инфекций позволяет анализ основ паразито хозяинных взаимодействия на уровне отдельной ячейки и таким образом более широкое понимание как лейшмании паразитов взаимодействуют с их предпочтительным разместить микроокружения, PVs макрофагов. Макрофагов инфекцией assays успешно использовались несколько групп16,17,18,19,20,,2122 для изучения функции принимающей макрофагов и лейшмании специфических генов и их возможного участия в сложное взаимодействие, которое характеризует внутриклеточную инфекцию. БММ инфекции позволяют квантификации роста паразита как считывание влияния принимающей факторов, которые влияют внутриклеточных выживания, как производство оксида азота бактерицидных, генерации активных форм кислорода и других неблагоприятных условий с которыми внутри Лизосома как PVs23. Макрофагов инфекции анализов также были использованы для выявления потенциальных наркотиков приводит анти leishmanial для терапевтических развития13,24.

В vitro характер BMM инфекций обеспечивает несколько преимуществ перед другими методами для оценки лейшмании вирулентности. Однако несколько предыдущих исследований, изучения механизмов выживания внутриклеточный паразит со временем не количественно инфекции как ставка20,21,24. Кроме того многие исследования сосредоточены на после инфекции в естественных условиях со временем сделал это путем измерения размера кожные поражения и другие физиологические симптомы, которые лишь косвенно связаны с паразитом репликации25,26 , 27. в естественных условиях инфекции является строгий подход к оценке вирулентности возбудителя, но поражения размер измерения на основе зверолов, опухоль в одиночку часто являются неадекватными, поскольку они отражают воспалительной реакции в инфицированных тканях и не абсолютное количество паразитов. По этой причине развитие поражения зверолов анализов должны сопровождаться количественная оценка нагрузки паразита в инфицированных тканях, процедура, которая требует продолжительного ограничения разрежения assays28. Кроме того в vivo исследования часто связаны, жертвуя несколько животных в различные моменты времени для извлечения тканей интерес6,,8,9,,10, 11 , 13. В отличие от этого, большое количество BMMs могут быть получены только одно животное, и эти клетки могут быть покрытие в условиях, которые позволяют оценку инфекции в различные моменты времени. Кроме того по сравнению с в vivo исследований, выполняя в vitro BMM инфекций позволяет больший контроль над экспериментальных условиях. Количественная оценка макрофаги быть инфицированы наряду с паразитами, сами позволяет точный контроль кратности инфекции (МВД) и условий, культуры. Точный контроль над этими факторами могут быть ключом в определении характеристики дискретных сотовой пути и в понимании их влияния на ход инфекции.

С учетом этих преимуществ, это несколько удивительно, что очень немногие группы изучения лейшмании вирулентности пока полной мере воспользовались количественной оценки внутриклеточных репликации в макрофагах. В этой статье мы обсудим распространенных ошибок, которые могут быть затрудняет более широкое использование этот assay и предоставляют пошаговые протокол для облегчения ее надлежащего осуществления. Учитывая ее точность и универсальность пробирного BMM инфекции, которую мы опишем здесь могут не только быть использованы для изучения взаимодействия хост патогена, влияющие на лейшманий вирулентности, но и для изучения других микроорганизмов, которые реплицируют внутри макрофаги29. Важно отметить, что этот assay также могут быть разработаны как метод быстрый и экономичный доклинические скрининга для анти leishmanial разработки лекарственных препаратов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все экспериментальные процедуры были проведены в соответствии с рекомендаций, содержащихся в руководстве для ухода и использования лабораторных животных, национальные институты здравоохранения и были одобрены IACUC университета штата Мэриленд. Все шаги, описанные в разделах с 1 по 4 должно осуществляться асептически внутри биологических ламинарные шкафы. Личная защита должна использоваться, и следует проявлять осторожность при обработке живой лейшмании паразитов на всех этапах экспериментов.

1. изоляция и дифференциации костного мозга-производные макрофагов (BMMs)8,,3031

  1. День 0: Жертву 4 - 6 week-old девушки C57BL/6 или мыши BALB/c в камере2 CO и подтвердить смерть через шейки матки дислокации. Стерилизации ножницы, щипцы, сохраняя их замачивают в 70% этиловом спирте. Spray перчатки с 70% этанола чтобы позволить стерильной обработки на протяжении всего процесса изоляции клеток костного мозга.
  2. Защитить жертву мышь, чтобы вскрытия Совет, закрепляя его передние конечности и дезинфекции, обильно поливая водой 70% этиловом спирте.
  3. Сделайте небольшой надрез (около 1 см) с ножницами вблизи тазобедренного сустава. Осторожно вставьте ножницы под кожу, чтобы отделить основные мышцы и вырезать кожу весь путь вокруг тазобедренного сустава.
    Примечание: Рассечение Совета могут быть повернуты для улучшения доступа к тазобедренного сустава.
  4. Тщательно deglove кожу от ГЭН, потянув к лодыжке и удалить. Отрезать ноги на лодыжке, стараясь сократить на уровне или ниже лодыжки совместных оставить голени полностью нетронутыми.
    Примечание: Малоберцовой кости на данном этапе слабо подключен и может быть легко отделяется с щипцами.
  5. Вручную найти тазобедренного сустава, манипулируя бедра для определения точки вращения. Внимательно используйте ножницы, чтобы разорвать ногу выше тазобедренного сустава оставить нетронутыми головку проксимального отдела бедренной кости.
  6. Удалите столько мышц и соединительной ткани как можно из ногу с ножницами. Удалите любые оставшиеся кожи от лодыжки и любой избыток костного материала выше тазобедренного сустава.
  7. Место уборка нога кости в стерильных RPMI дополнена пенициллина/стрептомицина (1% конечной концентрации) в чашку Петри на льду.
  8. Повторите шаги 1.4 через 1.6 изолировать голени и бедра от других заднюю ногу.
  9. Удалите оставшиеся мышц и соединительной ткани из костей, замачивания в RPMI, с использованием стерилизованные щипцы и стерильные лезвия #10.
  10. Место костей на крышке Петри. Тщательно вырежьте голени с лезвием непосредственно над голеностопного сустава для доступа к костного мозга. Удалите большеберцовой кости от остальной части ноги, резки непосредственно под коленный сустав.
  11. Нарисуйте 10 мл стерильной RPMI дополнена пенициллина/стрептомицина (1% конечной концентрации) в 10-мл шприц и прикрепить 25G иглы.
  12. Крепко голени с щипцами, вертикально над 50 мл конические на льду. Используйте шприц осторожно впрыснуть примерно 5 мл RPMI в конце кости для очистки костного из другой конец в коническую пробирку. Промойте костного мозга в общей сложности 10 мл RPMI, до тех пор, пока кость становится белым.
    Примечание: После тщательной промывки, кости должны стать белым. Если нет, то продолжайте промывку для удаления костного мозга. Дистальный конец большеберцовой кости может потребоваться обрезать обратно с лезвием, если она является слишком узким, чтобы вставить иглу.
  13. Вырежьте бедренной сразу выше коленного сустава и сразу же ниже тазобедренного сустава подвергать обоих концов кости для доступа к костного мозга. Флеш костного мозга от бедра с в общей сложности 10 мл RPMI таким же образом, как голени.
  14. Повторите очистка и промывка шаги 1.6 через 1.13 с оставшиеся кости и собирать клетки костного вспыхнул в единый 50 мл Конические трубки
    Примечание: Если кости ломаются в любой точке во время рассечение до промывки кости, не используйте костного мозга от этой кости.
  15. Центрифуга конические трубы используются для сбора костного покраснел от всех четырех костей за 10 мин при температуре 4 ° C на 300 x g.
  16. Место 60 мл стерильной BMM среды (RPMI с окончательной концентрацией 20% FBS, пенициллин 1% / стрептомицина, 1,2 мм Na пируват, 25 мкг/мл человека M-CSF) в 175 см2 клетки культуры колба с крышку фильтра.
  17. Отменить супернатанта следующие центрифугирования и Ресуспензируйте клетки Пелле, нежный вверх и вниз, дозирование, используя 5 мл BMM среды из колбы.
  18. Суспензию клеток передавать культуры колбу и промойте Конические трубки дважды с БММ среднего от культуры Фляга для обеспечения максимальной клеток восстановления. Убедитесь, что тщательно перемешать суспензию клеток в средних и распространять 30 мл для второй 175 см2 клетки культуры колбу крышкой фильтра от первоначального 175 см2 клетки культуры колбу.
  19. Инкубируйте обоих флаконы, содержащие 30 мл суспензии клеток каждую ночь при 37 ° C, 5% CO2 разрешить разделение любой загрязняющих фибробластов, резидентов макрофаги и другие адэрентных клеток.
  20. День 1: Передача супернатанта, содержащих недифференцированные костного клетки от колбы до 100 мм x 15 мм не лечить TC полистирола Петри в приблизительно 10 мл/блюдо и инкубировать при 37 ° C, 5% CO2. Выбросите колбы.
  21. День 3 или 4: Добавить еще 5 мл BMM среднего (предварительно разогретую до 37 ° C) в каждой чашке Петри и продолжить инкубации при 37 ° C, 5% CO2.

2. покрытие BMMs на Coverslips для инфекции (день 7 или 8)

  1. Подготовка 6-ну тканевые культуры пластин, поставив четыре (4) стерильные 12 мм стекло coverslips (газобетона и хранить в закрытой стеклянной посуде) в нижней части каждой пустой хорошо.
    Примечание: Забрать каждый coverslip стерильный 12 мм с аспирационных наконечником для вакуумной магистрали. Место coverslips в скважины без перекрытия, выпустив в желаемое положение путем сжимать трубу для прерывания вакуум.
  2. Аспирационная СМИ (и любой non сторонник клетки) из чашек Петри с приверженцами костного покрытием производным макрофагов и осторожно промыть приверженца клетки 2 x с стерильных Дульбекко фосфатный буфер без кальция и магния хлорид (PBS- / -) предварительно разогретую до 37 ° C.
  3. Каплям, добавить 5 мл стерильной 1 x PBS- / - с конечная концентрация 1 мм ЭДТА в каждой чашке Петри и инкубировать в течение 5 минут при 37 ° C для отсоединения сторонник BMMs. Убедитесь, что клетки отсоединяются с помощью микроскопа.
  4. Соберите все отдельные клетки, приостановлено в однократном ПБС- / - с 1 мм ЭДТА в 50 мл Конические трубки. Промойте каждое блюдо 2 x с 5 мл PBS- / - и добавить в ячейку подвеска пул.
    Примечание: Суспензию клеток может быть разведен с дополнительным PBS- / - защитить макрофаги от токсичности ЭДТА в процессе сбора.
  5. Центрифуга на 300 x g 10 мин при 4 ° C. Отменить супернатант и Ресуспензируйте макрофагов в 5-10 мл BMM среднего, закупорить. Место высокомобильна клетки на льду для предотвращения привязанность к трубы и слипания.
  6. Количество жизнеспособных клеток, с помощью исключения Трипановый синий в Горяева.
    Примечание: Чтобы подсчитать ячейки BMM высокомобильна в 5 мл среды, разбавления микс 25 мкл суспензии клеток в 445 мкл PBS- / - и 30 мкл 0,4% раствор Трипановый синий обычно позволяет легко количественной оценки в Горяева (принимая во внимание коэффициент разбавления 20 x для окончательного расчета ). Учитываются только те ячейки, которые сделали не запачкаться с Трипановый синий (жизнеспособных клеток). Объем суспензии клеток могут быть изменены, если эта смесь слишком сконцентрированы или разбавленный. В общем доходность BMM за подготовку колеблется от 2 x 10-7 и 5 x 107 клеток из одной мыши.
  7. Готовят суспензию клеток в среде BMM желаемого покрытия концентрации (5 x 105/мл) и разогнать подвеска 6 хорошо пластин в 2 мл средний за хорошо, так что каждый хорошо получает 1 x 10-6 макрофагов.
    Примечание: Это важный шаг, который обеспечивает каждый хорошо получает достаточное количество макрофагов для покрытия coverslips равномерно. Проверьте не перекрывающиеся или плавающие в среде coverslips в скважинах. Если это так, аккуратно настройте с наконечником стерильной пипеткой.
  8. Инкубируйте на ночь при 37 ° C, 5% CO2.

3. Очистка инфекционный форм л amazonensis

Примечание: Подготовиться лейшмании инфекции - очистить metacyclic promastigotes от стационарных Промастиготы культур8,13, или дифференцироваться в amastigote форме, с использованием стандартных л amazonensis promastigotes в культуре стерильных дифференциация протокол6,8.

  1. Очистка лейшмании metacyclic promastigotes с использованием градиента плотности media(Materials) 33
    1. Подготовьте раствор 40% плотности градиента СМИ в стерильные, эндотоксинов свободной воды.
    2. Разбавьте градиента плотности раствора в 10 средних x M199 (без сыворотки) для подготовки 10% концентрации в среде M199.
    3. Фильтр все решения через 0,22 мкм фильтром.
      Примечание: Фондовая решения могут храниться на 4 oC в темноте не более чем на 1 месяц.
    4. Добавьте 2 мл 40% раствора плотностью градиента СМИ в нижней части трубки 15 мл конические центрифуги.
    5. Слой 2 мл 10% плотность раствора градиент СМИ в M199 поверх слоя градиента СМИ 40% плотность тщательно, не допускать любого смешивания между двумя слоями с помощью пипетки Пастера.
    6. Соберите 1 х 109 паразитов от стационарных фаза культуры центрифугированием в 1900 x g за 10 мин.
    7. Ресуспензируйте клетки в 6 мл Дульбекко изменение основных средних (DMEM).
    8. Слой 2 мл суспензии клеток прямо на вершине 10% плотности, которую градиента СМИ слоя, аккуратно, с помощью пипетки Пастера во избежание смешивания между слоями.
    9. Центрифуга градиент для 10 мин на 1300 x g при комнатной температуре.
      Примечание: Из-за различия в физических свойствах видов Leishmania , центрифугирование условия для каждого возможно придется немного корректироваться для обеспечения максимальной доходности.
    10. Соберите паразитов (обогащенный в форме metacyclic Промастиготы) группа, образованная на границе верхней 10% плотность градиента СМИ (интерфейс между 0% и 10% плотности градиента СМИ слоями).
    11. Разбавить паразитов с одного тома DMEM и собрать центрифугированием (1900 x g 10 мин при комнатной температуре).
    12. Ресуспензируйте в 500 мкл среде DMEM и рассчитывать в Горяева для количественной оценки урожайности.
  2. Поколение л amazonensis amastigotes культуры в стерильных условиях (низкий рН / повышенных температуры)6,8,13
    1. Mix 5 мл лаг фазы Промастиготы культуры (рН 7,4 на 26 oC) с равным объемом amastigote среды (pH 4.5), с использованием 25 см2 фляги (всего 10 мл среды) и Инкубируйте на 26 ° C на ночь.
    2. Сдвиг колбу от 26 ° C до 32 ° C.
    3. После 3 или 4 дня Сплит культуры 1:5 в средствах массовой информации amastigote на 32 ° C.
    4. Проверьте паразитов в ближайшие 3-4 дней (максимум 7 дней) чтобы увидеть, если они готовы для использования в инфекции.
      Примечание: Здоровый стерильных amastigotes должны иметь овальную форму, без видимых жгутиков. Частично дифференцированных amastigotes имеют большой овальной формы с короткой жгутиков. Культура не должны много сгустки - многие сгустки являются признаком межвегетационный, умирая паразитов. Amastigote культура можно разделить 1:5 и сохранить максимум 3 недели.

4. инфекции с amazonensis л

  1. Разбавьте паразита суспензий согласно желаемой MOI (обычно 3-5 metacyclic promastigotes за Макрофаг [MOI 1:3 или 1:5]) и 1 amastigote за Макрофаг [MOI 1:1]. Добавьте лейшманий в PBS- / - в объеме 50-100 мкл каждой скважины, уже содержащий среднего 2 мл.
  2. Проинкубируйте BMMs 1 ч с amastigotes и 3 h с metacyclic promastigotes на 34 oC на инфекции.
    Примечание: Оптимальный инфекции температура зависит от вида.
  3. После инкубации, тщательно смыть бесплатно паразитов в каждом хорошо 3 x с 2 мл PBS- / - подогретым до 37 ° C.
    Примечание: Дисперсные PBS осторожно, чтобы обеспечить, что coverslips не плавают друг над другом. Аккуратно водоворот пластину и затем удалить из жидкости. Используете отдельный аспирационных кончик, если использовать несколько штаммов паразитов, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
  4. Исправить 1 h или 3 h-момент образцы по инкубации каждый хорошо с 1,5-2 мл 2% ПФА в PBS- / - за 10 минут Вымойте 3 x с PBS- / -. Не аспирационная последний мыть и охладите пластины, содержащие coverslips в PBS до окрашивания.
  5. Добавить 2 мл свежего BMM среднего для каждой скважины на пластины для дальнейшего раз точек и Инкубируйте на 34 ° C.
  6. Исправить остальные моменты времени как хотелось как описано в разделе Шаг 4.3 и охладите пластины до окрашивания.

5. DAPI окрашивание и Coverslip монтажа

  1. Аспирационная PBS из скважин, содержащих coverslips и добавить 1,5 мл PBS- / - с 0.1% неионные моющего средства. Проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре, после чего промыть 3 x 2 мл PBS- / -.
  2. Добавьте 1 mL PBS- / - с 2 мкг/мл (разбавленный от 5 мг/мл Стоковый раствор в воде) DAPI скважин, содержащих coverslips и проинкубируйте еще 1 ч при комнатной температуре.
    Примечание: Время инкубации с DAPI важно для правильной визуализации лейшмании внутриклеточных паразитов. Макрофагов ядер пятна быстро, из-за их большего размера и ДНК содержание, но окрашивания ядер внутриклеточных паразитов медленнее. Таким образом расширяя время инкубации за то, что требуется визуализировать BMM ядра необходимо позволить DAPI проникать через и паразита плазматической мембраны и мембраны ядерного паразита. С надлежащей DAPI пятно кинетопласта митохондриальной ДНК вблизи flagellar карман паразит может также быть визуализированы, помимо ядерной ДНК.
  3. Мыть каждый хорошо содержащие coverslips 3 x с 2 мл PBS- / - и затем лифта и флип coverslips пинцетом место стороны ячейки вниз и смонтировать на стекле микроскопа слайды с реактивом коммерчески доступных antifade монтажа.
    Примечание: Coverslips чрезвычайно хрупки и необходимости осторожного обращения. Избегайте давления на них, особенно против боковины скважин при подъеме. Добавление нескольких капель PBS- / - уменьшает поверхностное натяжение между coverslip и хорошо и облегчает процесс подъема. Тонкой иглы могут использоваться для оказания помощи в посторонних coverslips из нижней части колодца. После размещения coverslip на слайде, аккуратно нажмите вниз с щипцами для вытолкнуть воздушные пузыри в средствах массовой информации монтажа. Если coverslip нарушается или возможно отражено во время процесса подъема, не ремонта; просто используйте запасные четвертый coverslip.
  4. Охладите слайды до количественной оценки.

6. инфекции количественная оценка

  1. Изучить DAPI-окрашенных слайды под флуоресцентным микроскопом, сосредоточив внимание на макрофагов с использованием 100 X объектив с погружения нефти (возбуждения на 358 Нм; оптимальное выбросов в 461 Нм).
    Убедитесь, что фокус находится на слое макрофаги между стеклянное скольжение и coverslip.
  2. Подсчитать количество макрофагов (крупными ядрами, окрашенных с DAPI) и количество небольших ядер amastigote, группируются вокруг каждого ядра макрофагов (см. рисунок 2A, DAPI) для каждого поля зрения, используя ручной счетчик.
    Примечание: Amastigote ядрами могут не все будут видны в одной плоскости фокуса вследствие их малого размера. Граф тех, которые видны, когда уделялось ядер макрофагов, а затем использовать тонкой фокус для проверки паразита ядер в плоскостях выше и ниже макрофагов ядер.
  3. Перейти в другое поле зрения повторить количественной оценки. Использовать ключ отдельный счетчик для отслеживания количества полей учитываются. Перемещения через поля зрения в параллельные ряды по каждой coverslip, чтобы предотвратить подсчета перекрытия.
  4. Количественно минимум 200 макрофагов в coverslip. Количественно каждый момент инфекции в трех экземплярах (3 coverslips). Граф четвертый coverslip, если одно из предыдущих не подходит для подсчета из-за перекрытия coverslip, плохой монтаж, стекла и т.д.
    Примечание: Если 200 макрофаги не может быть подсчитанным на любой одной coverslip, граф запасных четвертый.
  5. Расчет показателей инфицирования как amastigotes/макрофагов или amastigotes/100 макрофагов и определить процент инфицированных макрофагов из сырых количественной оценки данных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лейшмании имеет две формы инфекционный - metacyclic promastigotes, что дифференцировать от procyclic promastigotes на стационарном этапе культуры и amastigotes, которые являются внутриклеточные стадии (рис. 1). В некоторых видов Leishmania , таких как л amazonensisamastigotes может также быть продифференцированным в стерильных культуры, сдвигая Промастиготы клетки для снижения pH (4.5) и при повышенной температуре (32 ° C), условия,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Количественные данные, подготовленные пробирного BMM инфекции, описанных выше, позволяет следователям получить показатели инфицирования и надежного определения изменения вирулентности свойств в относительно короткий период времени (максимум 2 недели, по сравнению с 2 месяцев, необходимых для экспериментов в естественных условиях ). Этот метод основывается на конкретных краситель ДНК DAPI, который специально пятна макрофагов и паразита ядер и позволяет быстрое выявление и количественная оценка инфицированных клет...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов,

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана национальными институтами здравоохранения грант RO1 AI067979 NWA.
YK является получателем Бакалавриат стипендии от Говард Хьюз медицинский институт/Университет Мэриленд, Колледж Парк.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
6-луночный планшет для культивирования клетокCellstar657160
АденинАкрос ОрганикиAC147440250
Аэрозольный барьер Наконечники для пипеток (100-1000; L)Fisherbrand02-707-404
Наконечники для аэрозольных барьеров для пипеток (20-200 μ L)Fisherbrand02-707-430
Наконечники для дозаторов с аэрозольным барьером (2-20; L)Fisherbrand02-707-432
Bard-Parker ребристая спинка из углеродистой стали хирургическое лезвие #10Aspen Surgical371110
BD Luer-Lok Tip 10 мл шприцBecton Dickinson (BD)309604
BD Precisionglide Needle, 25G Becton Dickinson (BD)305124
Чашка для клеточных культур 35 мм x 10 ммCellstar627 160
Колба для клеточных культурCellstar660175
Покровные стаканы: круги 12 ммFisherbrand12-545-80
DAPI (4',6-Диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорид)InvitrogenD1306
D-биотинJ.T. BakerC272-00
EDTASigma AldrichEDS
Этиловый спирт 200 proofPharmco-AAPER111000200
Falcon 100 мм x 15 мм необработанный ТК полистирол чашка ПетриCorning351029
Фетальная бычья сывороткаSeradigm1500-500
Ficoll400Sigma AldrichF8016
Флуоресцентный микроскопNikonE200
Козий антимышиный IgG Техасский красныйInvitrogenT-862
Козий антикролик IgG AlexaFluor488InvitrogenA-11034
HeminTokyo Chemical Industry Co. LtdH0008
HEPES (1M)Gibco15630-080
Isoton II DiluentBeckman Coulter
L-глютаминGemini400-106
Medium 199 (10X)Gibco11825-015
Na pyruvate (100 mM)Gibco11360-070
ПараформальдегидAlfa Aesar43368
Пенициллин/стрептомицинGemini400-109
Фосфатный буферный раствор (-/-)ThermoFisher14200166
Полипропилиновые конические центрифужные пробирки 15 млCellstar188 271
Полипропилиновые конические центрифужные пробирки 50 млCellstar227 261
ProLong Gold противовыцветающий реагентThermoFisherP36930
Крыса антимышиная лампа-1 антителаИсследования развития гибридома банка1D4B
Рекомбинантный человеческий M-CSFPeproTech300-25
Reichert Bright-Line  Гемоцитометр Hausser Scientific1492
RPMI Medium 1640 (1X)Gibco11875-093
Triton X-100 Поверхностно-активное веществоMillipore SigmaTX1568-1
TrypanBlue SigmaAldrich T8154
Деликатные ножницы, 4 1/2"VWR82027-582
Щипцы для препарирования, тонкий наконечникVWR82027-386
Предметные стекла микроскопаVWR16004-368
Z1 Coulter счетчик частиц, двухпороговыйBeckman Coulter6605699
8546719

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. WHO. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser. (949), (2010).
  2. Naderer, T., McConville, M. J. Intracellular growth and pathogenesis of Leishmania parasites. Essays Biochem. 51, 81-95 (2011).
  3. Rosenzweig, D., et al. Retooling Leishmania metabolism: from sand fly gut to human macrophage. FASEB J. 22 (2), 590-602 (2008).
  4. Lahav, T., et al. Multiple levels of gene regulation mediate differentiation of the intracellular pathogen Leishmania. The FASEB Journal. 25 (2), 515-525 (2011).
  5. Saunders, E. C., et al. Induction of a stringent metabolic response in intracellular stages of Leishmania mexicana leads to increased dependence on mitochondrial metabolism. PLoS Pathog. 10 (1), e1003888(2014).
  6. Mittra, B., et al. Iron uptake controls the generation of Leishmania infective forms through regulation of ROS levels. J Exp Med. 210 (2), 401-416 (2013).
  7. Kloehn, J., et al. Using metabolomics to dissect host-parasite interactions. Curr Opin Microbiol. 32, 59-65 (2016).
  8. Huynh, C., Sacks, D. L., Andrews, N. W. A Leishmania amazonensis ZIP family iron transporter is essential for parasite replication within macrophage phagolysosomes. J Exp Med. 203 (10), 2363-2375 (2006).
  9. Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 Ferric Iron Reductase of Leishmania amazonensis Is Essential for the Generation of Infective Parasite Forms. J Biol Chem. 286 (26), 23266-23279 (2011).
  10. Miguel, D. C., Flannery, A. R., Mittra, B., Andrews, N. W. Heme uptake mediated by LHR1 is essential for Leishmania amazonensis virulence. Infect Immun. 81 (10), 3620-3626 (2013).
  11. Cortez, M., et al. Leishmania Promotes Its Own Virulence by Inducing Expression of the Host Immune Inhibitory Ligand CD200. Cell Host Microbe. 9 (6), 463-471 (2011).
  12. Mittra, B., Andrews, N. W. IRONy OF FATE: role of iron-mediated ROS in Leishmania differentiation. Trends Parasitol. 29 (10), 489-496 (2013).
  13. Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathog. 12 (1), e1005340(2016).
  14. Ben-Othman, R., et al. Leishmania-mediated inhibition of iron export promotes parasite replication in macrophages. PLoS Pathog. 10 (1), e1003901(2014).
  15. Renberg, R. L., et al. The Heme Transport Capacity of LHR1 Determines the Extent of Virulence in Leishmania amazonensis. PLoS Negl Trop Dis. 9 (5), e0003804(2015).
  16. McConville, M. J. Metabolic Crosstalk between Leishmania and the Macrophage Host. Trends Parasitol. 32 (9), 666-668 (2016).
  17. Carrera, L., et al. Leishmania promastigotes selectively inhibit interleukin 12 induction in bone marrow-derived macrophages from susceptible and resistant mice. J Exp Med. 183 (2), 515-526 (1996).
  18. Hsiao, C. H., et al. The effects of macrophage source on the mechanism of phagocytosis and intracellular survival of Leishmania. Microbes Infect. 13 (12-13), 1033-1044 (2011).
  19. Murray, A. S., Lynn, M. A., McMaster, W. R. The Leishmania mexicana A600 genes are functionally required for amastigote replication. Mol Biochem Parasitol. 172 (2), 80-89 (2010).
  20. Farias Luz, N., et al. RIPK1 and PGAM5 Control Leishmania Replication through Distinct Mechanisms. J Immunol. 196 (12), 5056-5063 (2016).
  21. Franco, L. H., et al. Autophagy downstream of endosomal Toll-like receptor signaling in macrophages is a key mechanism for resistance to Leishmania major infection. J Biol Chem. 292 (32), 13087-13096 (2017).
  22. da Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PLoS One. 7 (3), e34022(2012).
  23. Carneiro, P. P., et al. The Role of Nitric Oxide and Reactive Oxygen Species in the Killing of Leishmania braziliensis by Monocytes from Patients with Cutaneous Leishmaniasis. PLoS One. 11 (2), e0148084(2016).
  24. Siqueira-Neto, J. L., et al. An image-based high-content screening assay for compounds targeting intracellular Leishmania donovani amastigotes in human macrophages. PLoS Negl Trop Dis. 6 (6), e1671(2012).
  25. Pastor, J., et al. Combinations of ascaridole, carvacrol, and caryophyllene oxide against Leishmania. Acta Trop. 145, 31-38 (2015).
  26. Giarola, N. L., et al. Leishmania amazonensis: Increase in ecto-ATPase activity and parasite burden of vinblastine-resistant protozoa. Exp Parasitol. 146, 25-33 (2014).
  27. Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Curr Protoc Immunol. , Chapter 19 Unit 19 12(2001).
  28. Tabbara, K. S., et al. Conditions influencing the efficacy of vaccination with live organisms against Leishmania major infection. Infect Immun. 73 (8), 4714-4722 (2005).
  29. Price, J. V., Vance, R. E. The macrophage paradox. Immunity. 41 (5), 685-693 (2014).
  30. Huynh, C., Andrews, N. W. Iron acquisition within host cells and the pathogenicity of Leishmania. Cell Microbiol. 10 (2), 293-300 (2008).
  31. Blackwell, J. M., et al. SLC11A1 (formerly NRAMP1) and disease resistance. Cell Microbiol. 3 (12), 773-784 (2001).
  32. Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. Int J Parasitol. 35 (7), 757-764 (2005).
  33. Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Exp Parasitol. 99 (2), 97-103 (2001).
  34. Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annu Rev Microbiol. 48, 449-470 (1994).
  35. Bates, P. A. Transmission of Leishmania metacyclic promastigotes by phlebotomine sand flies. Int J Parasitol. 37 (10), 1097-1106 (2007).
  36. Bates, P. A., Robertson, C. D., Tetley, L., Coombs, G. H. Axenic cultivation and characterization of Leishmania mexicana amastigote-like forms. Parasitology. 105 (Pt 2), 193-202 (1992).
  37. Frickmann, H., et al. Rapid identification of Leishmania spp. in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples by fluorescence in situ hybridization. Trop Med Int Health. 17 (9), 1117-1126 (2012).
  38. Seguin, O., Descoteaux, A. Leishmania, the phagosome, and host responses: The journey of a parasite. Cell Immunol. 309, 1-6 (2016).
  39. Wanderley, J. L., Thorpe, P. E., Barcinski, M. A., Soong, L. Phosphatidylserine exposure on the surface of Leishmania amazonensis amastigotes modulates in vivo infection and dendritic cell function. Parasite Immunol. 35 (3-4), 109-119 (2013).
  40. Crauwels, P., et al. Apoptotic-like Leishmania exploit the host's autophagy machinery to reduce T-cell-mediated parasite elimination. Autophagy. 11 (2), 285-297 (2015).
  41. Bringmann, G., et al. A novel Leishmania major amastigote assay in 96-well format for rapid drug screening and its use for discovery and evaluation of a new class of leishmanicidal quinolinium salts. Antimicrob Agents Chemother. 57 (7), 3003-3011 (2013).
  42. Sacks, D. L., Brodin, T. N., Turco, S. J. Developmental modification of the lipophosphoglycan from Leishmania major promastigotes during metacyclogenesis. Mol Biochem Parasitol. 42 (2), 225-233 (1990).
  43. Sacks, D. L. Leishmania-sand fly interactions controlling species-specific vector competence. Cell Microbiol. 3 (4), 189-196 (2001).
  44. McConville, M. J., Turco, S. J., Ferguson, M. A., Sacks, D. L. Developmental modification of lipophosphoglycan during the differentiation of Leishmania major promastigotes to an infectious stage. EMBO J. 11 (10), 3593-3600 (1992).
  45. Sacks, D. L., Hieny, S., Sher, A. Identification of cell surface carbohydrate and antigenic changes between noninfective and infective developmental stages of Leishmania major promastigotes. J Immunol. 135 (1), 564-569 (1985).
  46. Yao, C., Chen, Y., Sudan, B., Donelson, J. E., Wilson, M. E. Leishmania chagasi: homogenous metacyclic promastigotes isolated by buoyant density are highly virulent in a mouse model. Exp Parasitol. 118 (1), 129-133 (2008).
  47. Almeida Marques-da-Silva, E., et al. Extracellular nucleotide metabolism in Leishmania: influence of adenosine in the establishment of infection. Microbes Infect. 10 (8), 850-857 (2008).
  48. Moreira, D., et al. Impact of continuous axenic cultivation in Leishmania infantum virulence. PLoS Negl Trop Dis. 6 (1), e1469(2012).
  49. Svensjo, E., et al. Interplay between parasite cysteine proteases and the host kinin system modulates microvascular leakage and macrophage infection by promastigotes of the Leishmania donovani complex. Microbes Infect. 8 (1), 206-220 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

LeishmaniaDAPI

Похожие статьи