Простое и эффективное управление и визуализация микрочастиц в системе кровообращения малых рыб с помощью инъекций почек

Ekaterina Borvinskaya; Anton Gurkov; Ekaterina Shchapova; Dmitry Karnaukhov; Anton Sadovoy; Igor Meglinski; Maxim Timofeyev

doi:10.3791/57491

Method Article

Простое и эффективное управление и визуализация микрочастиц в системе кровообращения малых рыб с помощью инъекций почек

DOI:

10.3791/57491

⸱

June 17th, 2018

Ekaterina Borvinskaya¹^,² , Anton Gurkov¹^,³ , Ekaterina Shchapova¹ , Dmitry Karnaukhov¹ , Anton Sadovoy⁴ , Igor Meglinski¹^,⁵ , Maxim Timofeyev¹

¹Institute of Biology at Irkutsk State University, ²Institute of Biology at Karelian Research Centre of Russian Academy of Sciences, ³Baikal Research Centre, ⁴Institute of Materials Research and Engineering, Agency for Science, Technology, and Research (A*STAR), ⁵University of Oulu, Optoelectronics and Measurement Techniques Laboratory

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта статья демонстрирует принципы быстро, миниинвазивная инъекции флуоресцентные микрочастиц в circulatory system рыбки и визуализации в vivo микрочастиц в крови рыб.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Системного администрирования микро размера частиц в живой организм может применяться для визуализации сосудистую, наркотиков и вакцинации, имплантации крошечные оптических датчиков и трансгенных клеток. Однако внутривенного введения микроинъекций в мелких животных, которые в основном используются в биологических и ветеринарных лабораторий, очень сложны и требуют квалифицированного персонала. Здесь мы демонстрируем надежный и эффективный метод для введения микрочастиц в кровеносную систему взрослых рыбок данио (Danio рерио) путем инъекций в рыбы почек. Чтобы визуализировать введено микрочастиц в сосудистую, мы предлагаем простой метод прижизненной визуализации в жабры рыбы. В естественных условиях мониторинг pH крови данио рерио была выполнена с использованием вводят Микрокапсулированный флуоресцентный зонд, SNARF-1, чтобы продемонстрировать один из возможных применений описанные методики. Эта статья содержит подробное описание инкапсуляции рН чувствительных красителя и демонстрирует принципы быстрой инъекции и визуализации полученных микрокапсулы для записи в vivo флуоресцентного сигнала. Предложенный метод впрыска характеризуется низкой смертности (0-20%) и высокая эффективность (70-90% успеха) и это легко институт с помощью обычно доступных оборудования. Все описанные процедуры можно выполнять на других мелких рыб, таких как гуппи и оризии.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Администрация микро размера частиц в организм животных является одной из важных задач в таких областях, как наркотиков и доставки вакцины¹, сосудистую визуализации², трансгенными ячейку имплантации³и имплантации крошечные оптический датчик ⁴ ^, ⁵. Однако, трудно процедура имплантации микромасштабной частиц в сосудистой системе мелких лабораторных животных, особенно для деликатной водных организмов. Для популярных исследований образцов как данио рерио, он сообщил, что эти процедуры необходимо уточнить с помощью видео протоколов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все экспериментальные процедуры были проведены в соответствии с директивой ЕС 2010/63/ЕС для экспериментов на животных и были одобрены животное темам исследований Комитета из Института биологии Иркутского государственного университета.

1. Изготовление микрокапсулы

Примечание: Микрокапсулы, ношение флуоресцентные краски готовятся с использованием слой за слоем Ассамблеи противоположно заряженных полиэлектролитов⁷^,⁸. Все процедуры были выполнены при комнатной температуре.

Для синтеза пористых СаСО₃ microcores, включающего Люминесцентную....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Полученные результаты приходят от одного из трех основных категорий представленных протокола: формирование флуоресцентный микрочастиц путем инкапсуляции флуоресцентные краски (рис. 1), почки инъекции микрокапсулы с дальнейшей визуализации в Джилл капилляров (рис. 2 и 3) и, наконец, в естественных условиях спектральная записи SNARF-1 флуоресценции для мониторинга рН крови (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы продемонстрировать инъекции микрочастиц в почках данио рерио, мы использовали полупроницаемой микрокапсулы, загружен с красителем индикатора. Таким образом в протоколе содержатся инструкции для изготовления микрокапсулы, используя слой за слоем Ассамблея противоположно заряженных полиэлектролитов⁷^,⁸^,^,¹⁵¹⁶^,¹⁷ ^,¹⁸ (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы признают значительно помощью Богдан Осадчий и Евгений Протасов (Иркутский государственный университет, Россия) в рамках подготовки видео протокола. Это исследование было поддержано Российского научного фонда (#15-14-10008) и российского фонда фундаментальных исследований (#15-29-01003).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

₃

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
SNARF-1-dextran, 70000 МВт	Fluor Fisher Scientific	D3304	Флуоресцентный зонд. Любой другой подходящий флуоресцентный краситель, связанный с полимером, может быть использован в качестве наполнителя микрокапсул
Альбумин-флуоресцеин изотиоцианат конъюгат (FITC-BSA)	SIGMA	A9771	Флуоресцентный зонд
Родамин B изотиоцианат-декстран (RITC-декстран)	SIGMA	R9379	Флуоресцентный зонд
Образование шаблонов
Образование	карбоната натрия SIGMA	S7795	CaCO₃
поли(аллиламина гидрохлорид), MW 50000 (PAH)	SIGMA	283215	катионный полимер
поли(4-стиролсульфонат натрия), MW 70000 (PSS)	SIGMA	243051	анионный полимер
поли-L-лизин [20 кДа], привитый полиэтиленгликолем [5 кДа], g = 3,0 до 4,5 (PLL-g-PEG)	SuSoS	PLL(20)- g[3.5]-PEG(5)	Готовый полимер для повышения биосовместимости микрокапсул
Хлорид натрия	SIGMA	S8776	Для растворения применяемых полимеров
Система очистки воды	Millipore	SIMSV0000	Для приготовления деионизированной воды
Магнитная мешалка	Stegler		Для формирования
шаблонов CaCO₃Eppendorf Исследования плюс пипетка, 1000 & микро; L	Eppendorf		Дозирующие решения
Eppendorf Исследования плюс пипетка, 10 и микро; L	Eppendorf		Дозаторы
Наконечники для дозаторов, диапазон объема от 200 до 1000 и микро; L	F.L. Medical	28093	Дозирующие растворы
Наконечники для пипеток, диапазон объема 0,1-10 μ L	Eppendorf	Z640069	Дозирующие решения
Мини-центрифуга Microspin 12, высокоскоростная	BioSan		Для процедуры центрифугирования-промывки микрокапсул
Микроцентрифужные пробирки, 2 мл	Eppendorf	Z666513	Синтез и хранение микрокапсул
Шейкер Intelli-миксер RM-1L	ELMY Ltd.		Для снижения агрегации микрокапсул
Ультразвуковой очиститель			Для снижения агрегации микрокапсул
Головные телефоны			Для защиты ушей от ультразвука
Этилендиаминтетрауксусная кислота	SIGMA	EDS	Для растворения шаблонов CaCO₃
Мононатрийфосфат	SIGMA	S9638	Приготовление pH-буферов
Динатрий-фосфат	SIGMA	S9390	Приготовление pH-буферов
Гидроксид натрия	SIGMA	S8045	Для регулировки рН раствора ЭДТА и буферов
Термостатная камера			Для сушки микрокапсул на предметном стекле
Гемоцитометр Камера			Для исследования распределения размеров и концентрации приготовленных микрокапсул
Флуоресцентный микроскоп Микмед 2	ЛОМО		Визуализация микрокапсул в крови
рыб in vivoКомплект флуоресцентных фильтров для СНАРФ-1 (следует выбирать в зависимости от модели микроскопа; пример предоставляется)	Chroma	79010	Визуализация микрокапсул с помощью флуоресцентных зондов
Волоконный спектрометр QE Pro	Ocean Optics		Калибровка микрокапсул под микроскопом
Оптическое волокно QP400-2-VIS NIR, 400μ m, 2 м	Океаническая оптика		Для подключения спектрометра к порту микроскопа
Коллиматор F280SMA-A	Thorlabs		Для подключения спектрометра к порту микроскопа
Предметное стекло микроскопа	Fisherbrand	12-550-A3	Калибровка микрокапсул под микроскопом
Покровные стекла, 22 x 22 мм	Жемчуг	MS-SLIDCV	Калибровка микрокапсул под микроскопом
Стеклянные микрокапилляры Intra MARK, 10 & микро; L	Blaubrand	BR708709	Для сбора крови рыб
Гвоздичное масло	SIGMA	C8392	Обезболивание рыб
Ланцет No 11	Apexmed international B.V.	P00588	Для разрезания рыбьего хвоста и освобождения стальной иглы от кончика инсулинового автоинъектора
Гепарин, 5000 Ед/мл	Calbiochem	L6510-BC	Для обработки всех поверхностей, соприкасающихся с рыбьей кровью во время забора рыбьей крови
Seven 2 Go Pro pH-метр с микроэлектродом	Mettler Toledo		Для определения pH крови рыб
Инсулиновые ручки иглы Micro-Fine Plus, 0,25 х 5 мм	Becton, Dickinson and Company		Для инъекционной процедуры. Подойдет любая тонкая игла (Ø 0,33 мм или меньше) Стеклянные
капилляры, 1 х 75 мм	Hirschmann Laborgerä te GmbH & Co	9201075	Для инъекционных процедур
Газовая горелка			Для пайки стальной иглы к стеклу капилляра
Микроинъектор IM-9B	NARISHIGE		Для точного дозирования микрокапсул суспензии
чашки Петри, 60 мм х 15 мм, полистирол	SIGMA	P5481	Для манипуляций с рыбами под наркозом
Пластиковая ложка			Для манипуляций с рыбами под наркозом
Влажная губка			Для манипуляций с рыбами под наркозом
Диссекционные ножницы	Thermo Scientific	31212	Для снятия жаберной крышки с головы рыбы
Пипетка Пастера, 3,5 мл	BRAND	Z331767	Для увлажнения жабр рыб

хлорида кальция SIGMA C1016 CaCO матриц для подсчета клеток крови

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rivas-Aravena, A., Sandino, A. M., Spencer, E. Nanoparticles and microparticles of polymers and polysaccharides to administer fish vaccines. Biol. Res. 46 (4), 407-419 (2013).
Yashchenok, A. M., Jose, J., Trochet, P., Sukhorukov, G. B., Gorin, D. A.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Простое и эффективное управление и визуализация микрочастиц в системе кровообращения малых рыб с помощью инъекций почек

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles