Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Микроинъекции Западной кукуруза Rootworm, под эгидой содействие, эмбрионы для преобразования микрофлорой, или изменения генома ТРИФОСФАТЫ/Cas9

7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57497

⸱

27 апреля 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology and Plant Pathology, North Carolina State University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протоколы для сбора и microinjecting precellular Западный кукурузный rootworm эмбрионов для целей выполнения функциональных геномной анализы как микрофлорой преобразования и редактирования ТРИФОСФАТЫ/Cas9-генома.

Аннотация

Rootworm Западный кукурузный (WCR) является важным вредителей кукурузы и хорошо известна своей способностью быстро приспосабливаться к стратегиям управления вредителей. Хотя система РНК-интерференции (RNAi) оказалась мощным инструментом для изучения биологии WCR, он имеет свои ограничения. Конкретно, РНК-интерференции, сам является несохраняемым(т.е. не привести к долгосрочной Менделевское наследование связанных фенотип), и он требует, зная последовательность ДНК гена целевого объекта. Последний может иметь ограничения если фенотип интерес контролируется плохо сохраняется, или даже Роман генов, потому что будет сложной задачей выявления полезной цели, если не невозможно. Таким образом количество инструментов WCR в геномной панели инструментов должен быть расширен путем разработки методов, которые могут быть использованы для создания стабильной мутантных штаммов и включения последовательности независимые обследования WCR генома. Здесь мы подробно методы, используемые для сбора и microinject precellular WCR эмбрионов с нуклеиновыми кислотами. В то время как протоколы, описанные здесь, направлены на создание трансгенных WCR, ТРИФОСФАТЫ/Cas9-геном редактирования может также быть выполнена с использованием тех же протоколов, с той лишь разницей, что состав раствора вводят в эмбрионы.

Введение

Западный кукурузный rootworm (WCR), под эгидой эгидой, является важным вредитель кукурузы1. Интересно, что, как представляется, преодолеть управления WCR меры более быстрыми темпами, чем большинство сельскохозяйственных вредителей, поскольку они не только адаптировать физиологически, но и поведенчески2,3,4,5, 6. за последнее десятилетие, РНК-интерференции (RNAi), мощный функциональный геномной инструмент, исследована как потенциальный метод управления WCR7,8и также был использован как средство для изучения функции гена9. Однако хотя интерференции часто производится путем микроинъекции двуцепочечной РНК (dsRNA) в других видов, РНК-интерференции на основе инъекций встречается редко в ВЦС. В самом деле есть лишь несколько сообщений о RNAi через микроинъекции двуцепочечной ДНК в ВЦС9. Причина что WCR может достичь высокого уровня генов нокдаун через проглатывание dsRNA7,10, даже позволяя исследования эмбриональных эффекты кормления двуцепочечной ДНК матери11. Хотя этот метод делает WCR отличная тема для функционального геномного анализа через РНК-интерференции, он замедлился прогресс в разработке методологий для эмбриональных микроинъекции в этот вид.

Несмотря на мощь интерференции есть несколько недостатков. Например не все гены одинаково реагировать на РНК-интерференции. Эта изменчивость может сделать интерпретации результатов функциональной геномики пробирного сложнее. Кроме того РНК-интерференции является временным и не создавать наследственные мутации. С другой стороны микрофлорой трансформации, другой функциональной геномной инструмент, может генерировать наследственные мутации через вставки элемента заметно транспонированная в геном,12-13. Это делает преобразование микрофлорой отличным инструментом для создания мутантных штаммов для использования в долгосрочных генетических исследований. Преобразование может также использоваться для спасения мутация, обеспечивая функциональную копию гена мутант генома14. Кроме того преобразование микрофлорой является краеугольным камнем широкий спектр молекулярно-генетических методов. Помимо выбивания и/или спасать функции гена, микрофлорой преобразование может использоваться для enhancer треппинга15, Джин треппинга16, на основе Gal4 внематочная выражение17и генома общесистемной мутагенеза18.

Совсем недавно были разработаны инструменты, которые позволяют редактирования сложных генома. Эти инструменты включают транскрипции Activator-Like эффектор Nucleases (TALEN) и ТРИФОСФАТЫ/Cas9-нуклеиназы системы19,20. Преимуществом этих новых инструментов является, что они предлагают исследователям возможность побудить двуцепочечной ДНК перерыв в практически в любом месте в течение почти любой генома. После индуцированного, эти перерывы могут быть отремонтированы, не гомологичных концах прихода, который можно ввести, удаления или вставки в целевых генов, или через ориентированные на гомологии ремонт, который в присутствии инженерных конструкции, могут катализировать Замена всего генов или генетических регионах21,22. Однако эти методы требуют микроинъекции ДНК, РНК и белков в очень молодых эмбрионов.

Важно отметить, что в отличие от двуцепочечных РНК, используемые для RNAi, нуклеиновых кислот и белков, используемые для микрофлорой преобразования и изменения генома не может пересекать легко клеточных мембран. Таким образом микроинъекции плазмида ДНК, мРНК и/или белки должны осуществляться на этапе-синцитиальный бластодермы (т.е. до cellularizes насекомых эмбриона). Это делает время инъекции решающим фактором. Например в Drosophila melanogaster, эмбрионы должны вводиться в течение двух часов после того, как яйца откладывают12. Таким образом Разработка успешной эмбриональных микроинъекции протокола для WCR должны учитывать наилучшие условия для женщин яиц, а также лучший метод для сбора достаточного количества precellular эмбрионов.

Попытка привлечь широкий спектр молекулярных генетических инструменты на WCR биологии требует разработка методов для сбора и microinjecting precellular WCR эмбрионов. Здесь мы предоставляем подробные инструкции, наряду с советы и уловки, чтобы помочь другим использовать методы на основе преобразования в ВЦС исследования. Помимо предоставления WCR трансгенные технологии для использования в функциональных геномных исследований, эти методы также позволяют мощных новых стратегий управления вредителей как ген диск23,24 должны быть опробованы в этом экономически важных Пешт.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. колонии уровень воспитания WCR взрослых

  1. Получить достаточное количество WCR взрослых (500-1000) от надежной компании или научно-исследовательских лаборатории (см. Таблицу материалов для примера) и место в клетке3 30 см.
    Примечание: Настоятельно рекомендуется использовать не diapausing штамма.
  2. Подготовить WCR искусственные диеты после производителя протокол и налить слоем 1 см толщиной в 38 oz контейнер (см. Таблицу материалы). После смешивания, Храните неиспользованные диета при температуре 4 ° C на срок до 2 месяцев.
  3. Поместите чашку Петри (100 x 15 мм) с Взрослый диета (10-15 g) в клетке3 30 см. Добавьте больше диеты, когда еда низким или сухой.
  4. Поставьте колбу (300 мл) с водой, покрытые ватный шарик, который используется для хранения на месте рулоне хлопок (6 "x 3/8"), чтобы служить в качестве источника воды. Меняйте воду, когда она не хватает.
  5. В насекомое воспитания инкубатор поддерживать WCR на 26 ° C при влажности воздуха 60% и свет 14:10.

2. эмбриона коллекции и выравнивание

  1. Сделайте яйцо коллекции камеру, с использованием 1% агар в воде в стерильных 100 x 15 мм2 Петри. Хранить при 4 ° C, после того, как агар затвердевает.
  2. Чтобы собрать недавно установленными яйца, место одного слоя фильтровальной бумаги, а затем 4 слоя Марли (каждого разреза на размер) на поверхности агара (Рисунок 1A).
    Примечание: Марлю может быть повторно, после того, как мыть отбеливателя и газобетона, но это не нужно делать это для первого использования. Фильтр бумага не должна быть повторно и не нужно стерилизовать.
  3. Место коллекции плита яйцо в клетке WCR в в конце дня как можно скорее (конец рабочего дня) и накрыть фольги палатку. Оставьте на ночь.
    Примечание: Имея огни на 10: 00 до 12: 00 (14 ч) задержки откладки яиц, способствуя коллекции молодых яиц для микроинъекции без необходимости персонал лаборатории для место коллекции камеру в клетке поздно ночью.
  4. Снимите камеру сбора яиц около 8 или 9 часов.
  5. Используйте пинцет, чтобы забрать 1 слой марли на время и место в стакан (500 мл) воды. Мыть яйца офф марлю, осторожно помешивая (рис. 1B и 1 C).
  6. Используйте лампы пипетки для передачи яйца в другой стакан (500 мл) воды. Повторяйте 2-3 x очистить яйца.
  7. Используйте лампы пипетку для передачи яйца на фильтровальную бумагу (рис. 1 d) при сведении к минимуму количество воды переноса.
  8. Вырезать черный фильтровальную бумагу на полоски шириной ленты и стекла слайд твердо на слайд, чтобы убедиться, документ закладывает плоский (рисунок 2A).
    Примечание: Черный фильтр бумага помогает улучшить видимость под микроскопом, снижая количество отраженного света.
  9. Применить нетоксичный клей (см. Таблицу материалов для примера) на фильтровальную бумагу в тонких линий (рис. 2B). Храните клей линии тоньше, чем диаметр яйца, чтобы избежать попадания яйца, покрытая клеем.
  10. Используйте осторожно двигаться WCR яйца по одному из их фильтр-бумаги к линии клей тонкой кистью. Попробуйте положить яйца на клею, прежде чем оно высыхает и держать по крайней мере одно яйцо расстояние между каждой яйцо.
  11. Максимизировать эффективность инъекции, поместив несколько строк яиц на слайд один фильтр-бумаги (рис. 3).
  12. После того, как все яйца выкладываются на фильтровальной бумаге, подождите, пока все клей высохнет перед микроинъекции.
    Примечание: Для преобразования микрофлорой и ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной генома редактирования, привнести все эмбрионы, полдень (12: 00) так, что старый эмбриона не более чем 19 h старый. Однако для RNAi, существует без ограничения времени, потому что в ВЦС, малым интерферирующим РНК могут перемещаться между ячейками. В самом деле для RNAi, старение эмбрионов может привести к лучшей выживаемости.

3. Подготовка плазмида ДНК и инъекций иглами

  1. Подготовить высокого качества supercoiled плазмида ДНК с помощью эндотоксинов свободный коммерческих комплект (см. Таблицу материалов для примера).
  2. Подготовить инъекционного раствора, проверьте концентрацию каждого плазмиды и затем объединить вспомогательные плазмида (250 нг/мкл конечная концентрация), доноров плазмида (750 нг/мкл конечная концентрация) и фенола Красного буфера (20% конечной концентрации). Вихревой решение кратко и центрифуги для 3 минуты на максимальной скорости, чтобы осадить частицы, которые могут засорить иглы.
  3. Тянуть боросиликатного стекла иглы (O.D. и.д. 0,58 мм, длина 10 см, 1 мм) с использованием съемник микропипеткой типа Flaming/коричневый. Для хранения безопасной вытащил иглы на двухсторонний скотч в чашке Петри или других очистить контейнер.
    Примечание: Для системы съемник микропипеткой, параметры, используемые были: тепла = 335, FIL = 4, VEL = 40, дель = 200, пул = 100.
  4. Засыпки инъекционной иглы с помощью микро погрузчик Совет (см. Таблицу материалы) для пипетки 0.5 - 1.0 мкл вниз внутри иглу, вблизи остроконечный конец. Удалите пузыри от кончика иглы при возникновении любого.
  5. Вставьте иглу в иглодержателя.
  6. Откройте кончик иглы нежно с парой тонкой щипцами, или нежно прикасаясь к/перетаскивания кончик на слайде coverslip или стекла.
    Примечание: Цель должна иметь наименьшее отверстие, которое по-прежнему позволяет инъекции микс выйти (меньшие отверстия обычно требуется более высокое давление впрыска). Среза иглы не требуют этого шага, так как они уже открыты.

4. микроинъекции и впрыск Уход

  1. С помощью тонкой кистью, тщательно мокрой поверхности 1-3 яйца с стерильной водой, вставить иглу и внедрить решение. Придать каждое яйцо, прежде чем поверхность высыхает. Посмотрите на внешний вид небольшое количество красного цвета внутри яйца во время инъекции для обозначения успешного микроинъекции. Подавить или удалить все яйца, которые выглядят повреждения, пустой, или иным образом не может быть введен.
    Примечание: Хотя давление впрыска зависит от размера отверстия иглой, 10-13 psi является хорошей отправной точкой.
  2. После того, как все яйца вводят, удалите фильтр бумага из стеклянное скольжение.
  3. Поместите документ фильтр на поверхности агара 1% блюдо (описанные выше).
  4. Используйте пластиковые парафин фильм печать блюдо, и положить в 26 ° C насекомых, воспитание инкубатор на 12 дней.
    Примечание: Парафин фильм поможет предотвратить перекрестное загрязнение плесень между блюдами. Однако любое другое лечение для предотвращения плесени и бактерий может уменьшить выживания вводят эмбрионов.

5. культивирование и инкубационные эмбрионов

  1. Начать проверку эмбрионов 12 дней после инъекции для недавно вылупившихся личинок и продолжают ежедневно в течение 2 нед.
  2. Переноса личинок, с помощью тонкой кистью, в воспитании коробку с проросшие зерна и почвы.
    Примечание: Плесень может расти в агар блюдо, но в большинстве случаев по-прежнему вылупятся личинки. Ищите личинки тщательно в форму, чтобы поймать их всех. Некоторые личинки могут перейти к крышке блюдо и может застрять в конденсации.
  3. Задние личинок на 26 ° C, после стандартных WCR воспитания методы25.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Важным соображением при разработке этого протокола был стадии эмбрионального развития в то время микроинъекции. В частности преобразование микрофлорой требует микроинъекции НОО до эмбриональных cellularization. Это потому, что НОО не может пересекать легко клеточных мембран. Попытки визуализировать на этапах эмбрионального развития WCR с использованием ядерных пятно были неудачными, потому что dechorionation WCR эмбрионов по существу растворяет все защитные мембраны, ответственность за це...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Хотя микроинъекции WCR с двуцепочечных РНК с целью RNAi сообщил9, это первый протокол к внедрению наилучшей практики для microinjecting precellular WCR эмбрионов, критический процесс для проведения преобразования микрофлорой и/или Геном ТРИФОСФАТЫ/Cas9 редактирования в этот вид. Успешный микроинъекции WCR эмбрионов зависит от многих факторов, как эффективность преобразования. Ниже некоторые из основных вопросов отражаются итоги использования этого протокола для преобразования микрофлорой в этот жу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грант от Монсанто кукурузы Rootworm знаний исследовательская программа, предоставить номер AG/1005 (в леях и МК) и запуск средства MDL от NCSU. ФК была поддержана от грантов от Монсанто кукурузы Rootworm знание программы исследований (AG/1005) и национального научного фонда, предоставьте номер MCB-1244772 (MDL). Авторы заявляют не конкурирующие интересы. ФК и MDL задумана и разработана экспериментов; FC, PW и SP выполненных экспериментов; ФК и MDL проанализированы результаты; и ФК, нг и MDL написал рукопись. Мы благодарим Тереза о ' Лири, Уильям Klobasa и Стефани Горски за их квалифицированную помощь в скрининг WCR. Мы также благодарим д-р французский Уэйд (USDA-ARS, север центральной сельскохозяйственных научно-исследовательская лаборатория, Брукингс, SD) для поставок яиц для создания лаборатории колоний и обеспечения воспитания протоколы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Качественная фильтровальная бумага (черная)Ahlstrom8613-0900Для микроинъекций яиц
1 унция Контейнеры Пластиковая посуда Anny's ASET101контейнер для яиц
Дрозофила Агар тип IIApex66-103Субстрат для чаши для кладки яиц
WCR Featherweight ЩипцыBioquip4748Обращение с личинками и куколками 
Clorox Regular-Bleach1Clorox44600-30770Мыть кукурузу и посуду
Любимый дальнобойщик ЖелтыйCoor Farm Supply502Кукуруза для кормления WCR
Система микровпрыска (домашняя)NAЗапчасти и инструкции доступны по запросуКонтролирует давление впрыска (0-20 фунтов на квадратный дюйм)
Нетоксичный клей Elmer'sElmer's Products, Inc.E304Клея яиц на фильтровальную бумагу
epTIPS Наконечники микрозагрузчикаEppendorfC2554691Обратная засыпка иглой Наконечники
для загрузки Falcon Чашки для культуры тканейFalcon25383-103Проращивание кукурузы /150 x 25 мм
Fisherbrand  Фильтрующая бумага количественного качества КружкиFisher ScientificS47576CИзготовление агаровой чашки для кладки яиц / 9 см
SparkleenFisher Scientific04-320-4Мытье посуды
Обычный микроскоп СлайдыFisherScientific 12-549-3Хранение фильтровальной бумаги и яиц для микроинъекций
Western Corn Root Worm без заменителя пыльцыFrontier Agricultural Sciences F9766BWCR Искусственная диета для взрослых
Ватные шарики, большиеGenesee Scientific51-101Закрыть колбу
Globe Scientific 3,0 мл Маленькая лампочка Переносные пипеткиGlobe Scientific137035Собирать и переносить яйца
Leica M165 FC Флуоресцентный стереомикроскоп LeicaM165 FC Скрининг WCR
Набор фильтров DsRed для флуоресцентного стереомикроскопаLeicaDSRФильтр возбуждения: 510-560 нм, фильтр излучения: 590-650 нм
Фильтр EGFPLeicaGFP2Фильтр возбуждения: 440– 520 нм, фильтр излучения: 510 нм
BugDormMegaView ScienceDP1000_5PКлетка для взрослой колонии
Миниатюрная кистьMyArtscapeMAS-102-MINILiner 2/0 
Джойстик МикроманипуляторNarishigeMN-151Микроманипулятор и иглодержатель
Микроскоп XY StageOlympus265515Предметный столик для микроскопа (адаптирован для использования со стереоскопом)
Grade 90 МарляИнтернет-магазин тканейCHEE90Для яйцекладки
Пластиковая парафиновая пленка Pechiney Plastic PackagingPM-996Герметичная агаровая чашка после микровпрыска/Размер рулона 4 дюйма x 125 футов
Percival IncubatorPercival I41VLH3C8Камера выращивания WCR (инкубатор для выращивания насекомых)
Узкогорлые колбы ЭрленмейераVWR4980-300-PKКонтейнер для воды для взрослой семьи 
Стаканы Griffin низкой формыVWR1000-600-PKдля промывки яиц
Плетеные хлопчатобумажные рулоныRichmond Dental Cotton Co.605-3599Использование в водоснабжении для взрослой семьи 
Чашки Петри (35x10мм)SIGMACLS430588-500EAДля диетических тарелок
Фенол РедСигма143-78-8Микроинъекционный буфер
Лазерный пуллер для микропипиеткиSutter InstrumentP-2000/GИгла Puller/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100
Премиальный верхний слой почвыThe Scotts Company71130758Почва для выращивания крон
Reloc Zippit 2 Mil Zipper BagsStates Plastic Corporation48342Мешок для агара после микровпрыска / 5x7
Чашки Петри (100x15 м)VWR89038-968Изготовление агаровой чашки для кладки яиц / 100 x 15 мм
6 унций КонтейнерыWebstaurantstore128E506WCR для одной пары сопрягаемой камеры 
Контейнеры на 38 унцийWebstaurantstore128NC888Ящик для выращивания личинок/38
унций ChoiceHD 16 унций Полупрозрачный пластиковый контейнер для деликатесов для микроволновой печиWebstaurantstore128HRD16Ящик для выращивания личинок/16 унций
Микроинъекция Scope Wild HeerbruggWILD-M8Эндоскоп для микроинъекций, оснащенный XY-каскадом
Стандартные стеклянные капиллярыWorld Precision Instruments1B100F-4Иглы для микроинъекций
Взрослые западные кукурузные корневые червиNorth Centeral Aqricultural reasearch ЛабораторияНедиапазный штаммЗапрос от доктора Брайана Уэйда Лаборатория Френча
Набор для плазмидной ДНК Midi KitQiagen12143Очистка плазмидных ДНК, готовых к инъекциям
United

Ссылки

  1. Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest. Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).
  2. Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W. Field-evolved resistance to Bt maize by western corn rootworm. PLoS One. 6 (7), e22629(2011).
  3. Gray, M. E., Levine, E., Oloumi-Sadeghi, H. Adaptation to crop rotation: western and northern corn rootworms respond uniquely to a cultural practice. Recent research developments in entomology. 2, 19-31 (1998).
  4. Meinke, L. J., Siegfried, B. D., Wright, R. J., Chandler, L. D. Adult Susceptibility of Nebraska Western Corn Rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) Populations to Selected Insecticides. Journal of Economic Entomology. 91 (3), 594-600 (1998).
  5. Roselle, R., Anderson, L., Simpson, R., Webb, M. Annual report for 1959, cooperative extension work in entomology. , University of Nebraska Extension. Lincoln, NE. (1959).
  6. Wright, R., Meinke, L., Siegfried, B. Corn rootworm management and insecticide resistance management. Proceedings. , 45-53 (1996).
  7. Baum, J. A., et al. Control of coleopteran insect pests through RNA interference. Nat Biotechnol. 25 (11), 1322-1326 (2007).
  8. Velez, A. M., et al. Parameters for Successful Parental RNAi as An Insect Pest Management Tool in Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. Genes (Basel). 8 (1), (2016).
  9. Alves, A. P., Lorenzen, M. D., Beeman, R. W., Foster, J. E., Siegfried, B. D. RNA interference as a method for target-site screening in the Western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. J Insect Sci. 10, 162(2010).
  10. Rangasamy, M., Siegfried, B. D. Validation of RNA interference in western corn rootworm Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae) adults. Pest Management Science. 68 (4), 587-591 (2012).
  11. Khajuria, C., et al. Parental RNA interference of genes involved in embryonic development of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte. Insect Biochem Mol Biol. 63, 54-62 (2015).
  12. Cooley, L., Kelley, R., Spradling, A. Insertional mutagenesis of the Drosophila genome with single P elements. Science. 239 (4844), 1121-1128 (1988).
  13. Robertson, H. M., et al. A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster. Genetics. 118 (3), 461-470 (1988).
  14. Spradling, A. C., Rubin, G. M. Transposition of Cloned P Elements into Drosophila Germ Line Chromosomes. Science. 218 (4570), 341-347 (1982).
  15. O'Kane, C. J., Gehring, W. J. Detection in situ of genomic regulatory elements in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (24), 9123-9127 (1987).
  16. Lukacsovich, T., et al. Dual-tagging gene trap of novel genes in Drosophila melanogaster. Genetics. 157 (2), 727-742 (2001).
  17. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  18. Horn, C., Offen, N., Nystedt, S., Hacker, U., Wimmer, E. A. piggyBac-based insertional mutagenesis and enhancer detection as a tool for functional insect genomics. Genetics. 163 (2), 647-661 (2003).
  19. Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).
  20. Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501(2009).
  21. Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
  22. Jeggo, P. A. DNA breakage and repair. Adv Genet. 38, 185-218 (1998).
  23. Gantz, V. M., Bier, E. Genome editing. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations. Science. 348 (6233), 442-444 (2015).
  24. Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
  25. Branson, T. F., Jackson, J. J., Sutter, G. R. Improved Method for Rearing Diabrotica virgifera virgifera (Coleoptera, Chrysomelidae). Journal of Economic Entomology. 81 (1), 410-414 (1988).
  26. Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression. Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 749-755 (2008).
  27. Chu, F., et al. Germline transformation of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. Insect Mol Biol. , (2017).
  28. Ingolia, T. D., Craig, E. A., McCarthy, B. J. Sequence of three copies of the gene for the major Drosophila heat shock induced protein and their flanking regions. Cell. 21 (3), 669-679 (1980).
  29. Berghammer, A. J., Klingler, M., Wimmer, E. A. A universal marker for transgenic insects. Nature. 402 (6760), 370-371 (1999).
  30. Branson, T. The selection of a non-diapause strain of Diabrotica virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae). Entomologia Experimentalis et Applicata. 19 (2), 148-154 (1976).
  31. Handel, K., Grunfelder, C. G., Roth, S., Sander, K. Tribolium embryogenesis: a SEM study of cell shapes and movements from blastoderm to serosal closure. Dev Genes Evol. 210 (4), 167-179 (2000).
  32. Handler, A. M., James, A. A. Insect transgenesis: methods and applications. , CRC Press. (2000).
  33. Lorenzen, M. D., et al. piggyBac-based insertional mutagenesis in Tribolium castaneum using donor/helper hybrids. Insect Mol Biol. 16 (3), 265-275 (2007).
  34. Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum. Development. 142 (16), 2832-2839 (2015).
  35. Phuc, H. K., et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biol. 5, 11(2007).
  36. Horn, C., Wimmer, E. A. A transgene-based, embryo-specific lethality system for insect pest management. Nat Biotechnol. 21 (1), 64-70 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Микроинъекции Западной кукуруза Rootworm, под эгидой содействие, эмбрионы для преобразования микрофлорой, или изменения генома ТРИФОСФАТЫ/Cas9
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.