Методическая статья

Быстрое и поверхностным трубопровода для генерации геномной мутантов точки в C. elegans с помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 Ribonucleoproteins

7.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57518

⸱

30 апреля 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of Michigan

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем метод инженер генома C. elegans используя ТРИФОСФАТЫ-Cas9 ribonucleoproteins и гомологии зависимых ремонт шаблоны.

Аннотация

Кластерный повторяется регулярно перемежаются рецидивирующий (ТРИФОСФАТЫ) - ТРИФОСФАТЫ - связанных белков прокариот адаптивной иммунной обороны системы был кооптирован как мощный инструмент для точного генома эукариот техники 9 (Cas9). Здесь мы представляем быстрый и простой метод, используя химерных одно руководство РНК (sgRNA) и ТРИФОСФАТЫ-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) для эффективного и точного поколения геномной точечные мутации в C. elegans. Мы описываем трубопровода для sgRNA выбор цели, ориентированные на гомологии ремонт (HDR) шаблон дизайна, ТРИФОСФАТЫ-Cas9-RNP комплексообразования и доставки и генотипирования стратегия, которая обеспечивает надежное и быстрое выявление правильно отредактированный животных. Наш подход не только позволяет легким поколение и определение желаемого геномной точки мутанта животных, но также облегчает обнаружение других сложных indel аллелей в приблизительно 4-5 дней с высокой эффективностью и снижение скрининг рабочей нагрузки.

Введение

Последние технологические достижения радикально преобразована и ускоренного способность точно инженер геномов. В частности ТРИФОСФАТЫ-Cas9 система, которая опирается на РНК руководствуясь эндонуклеазы Cas9 вызвать разрыв двойной нити (DSB) вблизи последовательности целевых объектов, представляющих интерес, широко используется для точного инженер геном большинства модельных организмов, используемых в биомедицинских исследований1,2,3,4. Существенно использование ТРИФОСФАТЫ-Cas9 разблокирована, даже в трудных видов как C. elegans5изменения генома. Независимо от вида, генерации точечные мутации с геном основанный ТРИФОСФАТЫ-Cas9, редактирования системы основывается на трех основных компонентов: 1) Cas9 эндонуклеазы, 2) одно руководство РНК (sgRNA), который руководит Cas9 эндонуклеазы в последовательности целевых объектов и 3) разработан пользователем ориентированные на гомологии ремонт (HDR) шаблон, содержащий нужную edit(s) интерес2.

Существует несколько методов, которые можно использовать для нацеливания sgRNA и Cas9 Нуклеаза в клетки, включая плазмида, РНК и доставки на основе вирусные методы6. Недавно прямые поставки pre-complexed sgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) стала мощным и эффективным инструментом в геноме ТРИФОСФАТЫ-Cas9 основе редактирования7. Прямая доставка pre-complexed ТРИФОСФАТЫ-Cas9 RNPs имеет несколько различных преимуществ, а именно: 1) RNPs обойти необходимость клеточной транскрипции и быстро очищаются перевод, 2) RNPs, которые могут повысить специфика путем уменьшения свободного времени для пробить расщепления и 3) RNPs содержат не иностранные элементы ДНК/РНК, которые нарушают введение неместных последовательностей в геном хоста через случайные интеграции. Вместе эти атрибуты вероятно обеспечивают недолго взрыв на цель ТРИФОСФАТЫ редактирования при сведении к минимуму эффекты пробить.

Мы опишем простой и эффективный протокол для конкретных участков геномных изменений в C. elegans. Этот протокол включает в себя ориентации sgRNA и одного мель олигонуклеотида (ssODN) HDR шаблон дизайна, sgRNA-Cas9 RNP комплексообразования и доставки и генотипирования стратегию для однозначной идентификации должным образом редактировать животных. Используя эту стратегию, не только может быть восстановлена желаемых конкретных изменений, но также могут быть взысканы другие неспецифические indel мутации. Таким образом наша стратегия позволяет поколение аллельные серии, используя единую стратегию, где моно аллельные, Би аллельных и indel мутанты могут создаваться в поколении1 F.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все ухода за животными и экспериментальной процедуры после рекомендации от национальных институтов здоровья и институциональный уход за животными и использования Комитет (IACUC) в университете штата Мичиган. Использовать бесплатные РНКазы решения и Пипетка советы по всему протоколу. Очистите рабочую область, пипетки, трубы и центрифуги с решением РНКазы обеззараживания инструкций производителя (см. Таблицу материалов).

1. sgRNA выбор цели

  1. С помощью веб-браузера, откройте веб-страницу: http://crispor.tefor.net8
    1. Ввод ~ 60 пар оснований (ВР) последовательности фланкируя желаемого изменения интереса (то есть 30 bp 5' и 3' желаемого редактирования).
    2. Выберите Caenorhabditis elegans генома из выпадающего меню.
    3. Выберите Protospacer прилегающие мотив (20 bp НЭС - SpCas9, SpCas9-HF1, eSPCas9 1.1) из выпадающего меню.
    4. Нажмите кнопку Отправить. На странице результатов выберите Топ Ранжированные последовательности ближе к редактирования интерес. Если нет подходящей мишенью сайтов в пределах входной последовательности фланкируя 60 bp, разверните узел последовательности запроса до 100 bp (т.е. 50 bp обе стороны желаемого редактирования).
  2. Из доступных источников, например synthego, получить целевой sgRNA 20-mer со следующими спецификациями: 3 нмоль; никакие изменения.
  3. По получении, центрифуга лиофилизированные sgRNA, содержащие трубки на > g 12000 x 1 мин при комнатной температуре. 60 мкл свободной от нуклеиназы TE на трубу и аккуратно вновь приостановить, закупорить вверх и вниз 15 - 20 раз с помощью пипетки P200. Конечная концентрация составляет 50 мкм.

2. ориентированные на гомологии ремонт шаблон дизайна

  1. Дизайн ssODN HDR шаблон содержит: 1) мутации интерес, 2) уникальный эндонуклеазы ограничения в кадр сайт, 3) немого мутации одного или обоих из Gs в пределах последовательности NGG PAM и 4) 50 bp, 5' и 3' оружия гомологии фланговые первый и последний мутации. (Рис. 1 c) 9 , 10.
    1. Если мутация NGG PAM последовательности невозможно, ввести 5-6 немого мутации в sgRNA признание последовательности для предотвращения sgRNA опосредованной расщепления HDR шаблона ssODN.
  2. Из доступных источников, например idtdna, получить «Ultramer ДНК олигонуклеотида» со следующими параметрами: шкала: 4 нмоль; Разработка: Нет; Очистка: Стандартные обессоливания.
  3. По получении, центрифуга лиофилизированные ssODN, содержащие трубки на > g 12000 x 1 мин при комнатной температуре. Аккуратно вновь приостановите ssODN до конечной концентрации 100 мкм в свободной от нуклеиназы ddH2O, закупорить вверх и вниз 15 - 20 раз с помощью пипетки P200.

3. дизайн генотипирования праймеры

  1. Дизайн праймера, набор фланговые модификации генома для создания Ампликон ПЦР ~ 400-700 bp11.
  2. Оптимизируйте Велоспорт условия PCR для производства одного и конкретных ампликон11.

4. подготовить смесь инъекций

  1. Центрифуга Таблица 1 реагентов на максимальной скорости на 2 мин при 4 ° C.
  2. В указанном порядке добавьте таблицы 1 реагентов в свободной от нуклеиназы ПЦР-пробирку.
  3. Тщательно смешайте нежно закупорить вверх и вниз в 10 раз с P20 пипетки.
  4. Инкубируйте инъекции смесь для 10 мин при комнатной температуре.

5. инъекции протокол

  1. Загрузите микропипеткой инъекций с примерно половину смеси инъекции12. Сохраните оставшиеся инъекции смеси в случае инъекционной иглы башмаки или разрывы.
  2. Разбейте микропипеткой наконечник, так что ~ 20-30 МПа производит постепенного течет решение12.
    Примечание: Большего диаметра советы негативно повлиять на здоровье животных и снижение урожайности потомства1 F.
  3. Придать 10-15 молодых взрослых червей в обоих гонадной оружия если возможно12. Если не, инъекций в одну руку, гонадной является достаточным.
  4. Разрешите вводят животных (0P), чтобы восстановить для 1-2 ч при комнатной температуре на плите СМИ (НГМ) нематоды роста ОР50 посеян 35 мм. Впоследствии один вводили P0 животных для отдельных ОР50 посеян 35 мм NGM пластины с помощью провода платины червь выбрать12.

6. экран P0 пластины и одного mCherry(+) F1s

  1. Два дня впрыск, определить P0 пластины, содержащие F1 потомства, выражая mCherry в глотки, с использованием флуоресцентных стереомикроскопом (рис. 1 d, день 2 - 3). Выберите три P0 пластины, которые содержат большинство животных mCherry(+) F1 .
  2. От каждого из трех выбранных плит0 P, один 8-12 mCherry(+) F1 животных для в общей сложности 24-36 mCherry(+) F1s с помощью червь выбрать (рис. 1 d, день 2 - 3).
    Примечание: mCherry(-) животных можно также выделить из этих плит0 P, но вероятность выявления корректно отредактировал животных гораздо ниже (рисунок 2A).
  3. Разрешить отдельные F1s self-fertilize и откладывают яйца на 1-2 дней при комнатной температуре.

7. единственный червь ПЦР и генотипирования

  1. После 1-2 дней яйцекладки перевод1ф на отдельные ПЦР газа труба шапки содержащие 7 мкл буфера Lysis червя, используя забрать червя (Таблица 2, рис. 1 d, 4-5 день).
  2. ПЦР пробирок с максимальной скоростью за 1 мин при комнатной температуре животных на дно трубки, и заморозить трубок-80 ° C в течение 1 ч.
    Примечание: Черви могут храниться при температуре-80 ° C на неопределенный срок.
  3. Лизировать замороженных червей в Термоциклер, используя следующую программу: 60 ° C в течение 60 мин., 95 ° C в течение 15 мин., 4 ° C провести.
  4. Set-up mastermix PCR, как показано в таблице 3.
  5. 21 мкл mastermix ПЦР в чистой ПЦР трубки, а затем добавить 4 мкл лизис червя из шага 3. Смеси хорошо с помощью пипетки и запустите программу ПЦР инструкций производителей (см. Таблицу материалов).
  6. Очистить ПЦР-реакции, используя набор ДНК чистой и концентрат, следуя инструкциям производителя (см. Таблицу материалов). Элюировать ДНК путем добавления 10 мкл воды в столбце спина.
  7. Set-up mastermix энзима ограничения, как показано в таблице 4.
  8. 10 мкл mastermix энзима ограничения для каждой очищенных реакции PCR и инкубировать в течение 1-2 ч при 37 ° C13.
  9. Отдельные переваривается продуктов ПЦР на 1,5% агарозном геле на 120 V с использованием буфера Tris ацетат ЭДТА (ТЭ) 1 x14.

8. Идентификация и проверка последовательности отредактированный животных

  1. Проверьте образцы фермента усваиваются на наличие полос, которые показывают, что потенциал редактировать14 животных (рис. 1 d, 4-5 день).
    Примечание: Загрузите элемент управления N2 для выявления потенциальных indel мутации, которые могут наблюдаться как сдвиги в группе Размер и/или Пищеварение энзима ограничения неожиданные и сложных, диапазонов моделей.
  2. После выявления потенциальных отредактированный животных, использовать оставшиеся 3 мкл червь лизис и повторите реакции PCR. Не мойте или энзима ограничения дайджест реакции PCR после завершения программы. Загрузить реакции PCR на геле агарозы 1%, отдельный и извлекать группы с помощью геля добыча комплект15 (см. Таблицу материалов).
  3. Сэнгер последовательности16 гель извлечь ДНК, используя праймер F1 для идентификации правильно отредактированный животных (рис. 1A)
    Примечание: Гетерозиготности читает будет содержать обложил вершины вследствие наличия дикого типа и инженерии аллеля.
  4. Для получения гомозиготных животных из проверенных гетерозиготных отредактированная животных, один 8-12 F2 животных и выполните шаги 7-8.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мутации в человека супероксиддисмутаза 1 (SOD1) составляют ~ 10-20% семейных боковой амиотрофический склероз, разрушительные нейродегенеративные болезни, которая неизменно приводит к параличу и смерти17. Человеческой SOD-1 является эволюционно сохраненных белков, обмена 55% идентичности и 70% сходство с C. elegans SOD-1 протеин (Рисунок 1B). Чтобы продемонстрировать простоту, целесообразности и эффективности подхода н...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

ТРИФОСФАТЫ-Cas9 система является мощным и эффективным инструментом для точного изменения генома модельных организмов. Здесь мы демонстрируем, что химерных sgRNAs20 в сочетании с ssODN HDR шаблоны включить высокоэффективных поколения геномной точечные мутации в C. elegans. Важно отметить, что мы демонстрируем, что RNP доставки производит высокую эффективность редактирования, когда флуоресценции используется в качестве совместного выбора маркера, подчеркивая простоту и надежность техники.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Мы благодарим членов Beg лаборатории для критических чтении этой рукописи. Штаммы были предоставлены центром генетики Caenorhabditis , который финансируется Управлением NIH инфраструктуры научно-исследовательских программ (P40 OD010440). Исследования в лаборатории Beg поддерживается грантов из низ (R01 NS094678) и ассоциации мышечной дистрофии (MDA382300) A.A.B.

Благодарности

Существует без конфликтов интересов, связанных к настоящему докладу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
CRISPRevolution sgRNA  EZ KitSynthego Inc.химерная sgRNA
без нуклеазы TESynthego Inc.поставляется с набором sgRNA EZ kit
Nuclease-free waterSynthego Inc.поставляется с набором sgRNA EZ kit
4 nmole Ultramer DNA OligoIntegrated DNA TechnologiesssODN HDR template
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLSIntegrated DNA Technologies1078728белком Cas9
pCFJ90 Addgene19327Pmyo-2::mCherry Маркер Плазмида
KClSigmaP5405
HEPESSigmaH4034
DNA Clean & КонцентраторZymo ResearchD4004
Zymoclean Gel Набор для восстановления ДНКZymo ResearchD4002
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master MixNew England BiolabsM0494L
Proteinase KSigmaP2308
Стекло боросиликатное стекло МикропипеткиSutter InstrumentsBF100-78-10OD: 1,0мм. Идентификационный номер: 0,78 мм
Тризма гидрохлоридSigmaT5941
MgCl2SigmaM2393
NP-40Sigma74385
Tween-20Fisher ScientificBP337-100
RNaseZap Раствор для обеззараживанияFisher ScientificAM9780

Ссылки

  1. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202, 885-901 (2016).
  2. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096(2014).
  3. Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).
  4. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
  5. Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans. Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).
  6. Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).
  7. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).
  8. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148(2016).
  9. Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. , (2017).
  10. Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans. G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).
  11. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction. J Vis Exp. , (2017).
  12. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
  13. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , (2017).
  14. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis . J Vis Exp. , (2017).
  15. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. J Vis Exp. , (2017).
  16. Estrada-Rivadeneyra, D. Sanger sequencing. FEBS J. , (2017).
  17. Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. Amyotrophic lateral sclerosis. Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).
  18. Evans, T. C. WormBook. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).
  19. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  20. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
  21. Boyd, S. D., et al. A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other "Omics") Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care. Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).
  22. Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis? Brain. 136, 2342-2358 (2013).
  23. Acevedo-Arozena, A., et al. A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis. Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).
  24. Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

C eleganssgRNAssODN HDRmCherry

Похожие статьи