Здесь мы представляем метод инженер генома C. elegans используя ТРИФОСФАТЫ-Cas9 ribonucleoproteins и гомологии зависимых ремонт шаблоны.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Быстрое и поверхностным трубопровода для генерации геномной мутантов точки в C. elegans с помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 Ribonucleoproteins
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Кластерный повторяется регулярно перемежаются рецидивирующий (ТРИФОСФАТЫ) - ТРИФОСФАТЫ - связанных белков прокариот адаптивной иммунной обороны системы был кооптирован как мощный инструмент для точного генома эукариот техники 9 (Cas9). Здесь мы представляем быстрый и простой метод, используя химерных одно руководство РНК (sgRNA) и ТРИФОСФАТЫ-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) для эффективного и точного поколения геномной точечные мутации в C. elegans. Мы описываем трубопровода для sgRNA выбор цели, ориентированные на гомологии ремонт (HDR) шаблон дизайна, ТРИФОСФАТЫ-Cas9-RNP комплексообразования и доставки и генотипирования стратегия, которая обеспечивает надежное и быстрое выявление правильно отредактированный животных. Наш подход не только позволяет легким поколение и определение желаемого геномной точки мутанта животных, но также облегчает обнаружение других сложных indel аллелей в приблизительно 4-5 дней с высокой эффективностью и снижение скрининг рабочей нагрузки.
Введение
Последние технологические достижения радикально преобразована и ускоренного способность точно инженер геномов. В частности ТРИФОСФАТЫ-Cas9 система, которая опирается на РНК руководствуясь эндонуклеазы Cas9 вызвать разрыв двойной нити (DSB) вблизи последовательности целевых объектов, представляющих интерес, широко используется для точного инженер геном большинства модельных организмов, используемых в биомедицинских исследований1,2,3,4. Существенно использование ТРИФОСФАТЫ-Cas9 разблокирована, даже в трудных видов как C. elegans
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все ухода за животными и экспериментальной процедуры после рекомендации от национальных институтов здоровья и институциональный уход за животными и использования Комитет (IACUC) в университете штата Мичиган. Использовать бесплатные РНКазы решения и Пипетка советы по всему протоколу. Очистите рабочую область, пипетки, трубы и центрифуги с решением РНКазы обеззараживания инструкций производителя (см. Таблицу материалов).
1. sgRNA выбор цели
- С помощью веб-браузера, откройте веб-страницу: http://crispor.tefor.net8
- Ввод ~ 60 пар оснований (ВР) последовательности фланкируя желаемого измен....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мутации в человека супероксиддисмутаза 1 (SOD1) составляют ~ 10-20% семейных боковой амиотрофический склероз, разрушительные нейродегенеративные болезни, которая неизменно приводит к параличу и смерти17. Человеческой SOD-1 является эволюционно сохраненных белков, обмена 55% идентичности и 70% сходство с C. elegans SOD-1 протеин (Рисунок 1B). Чтобы продемонстрировать простоту, целесообразности и эффективности подхода н.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
ТРИФОСФАТЫ-Cas9 система является мощным и эффективным инструментом для точного изменения генома модельных организмов. Здесь мы демонстрируем, что химерных sgRNAs20 в сочетании с ssODN HDR шаблоны включить высокоэффективных поколения геномной точечные мутации в C. elegans. Важно отметить, что мы демонстрируем, что RNP доставки производит высокую эффективность редактирования, когда флуоресценции используется в качестве совместного выбора маркера, подчеркивая простоту и надежность техники.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Мы благодарим членов Beg лаборатории для критических чтении этой рукописи. Штаммы были предоставлены центром генетики Caenorhabditis , который финансируется Управлением NIH инфраструктуры научно-исследовательских программ (P40 OD010440). Исследования в лаборатории Beg поддерживается грантов из низ (R01 NS094678) и ассоциации мышечной дистрофии (MDA382300) A.A.B.
Благодарности
Существует без конфликтов интересов, связанных к настоящему докладу.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| CRISPRevolution sgRNA EZ Kit | Synthego Inc. | химерная sgRNA | |
| без нуклеазы TE | Synthego Inc. | поставляется с набором sgRNA EZ kit | |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | поставляется с набором sgRNA EZ kit | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN HDR template | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | белком Cas9 |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherry Маркер Плазмида |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| DNA Clean & Концентратор | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel Набор для восстановления ДНК | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Стекло боросиликатное стекло Микропипетки | Sutter Instruments | BF100-78-10 | OD: 1,0мм. Идентификационный номер: 0,78 мм |
| Тризма гидрохлорид | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Раствор для обеззараживания | Fisher Scientific | AM9780 |
Ссылки
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202, 885-901 (2016).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096(20....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
