Этот протокол описывает недавно созданный метод для доставки вирус мышиных простаты. Использование технологии ТРИФОСФАТЫ/Cas9, гиперэкспрессия генов или Cre рекомбиназа поставка, техника позволяет ортотопическая изменения экспрессии генов и реализует модель Роман мыши для рака простаты.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Вирус доставки ТРИФОСФАТЫ руководств для мышиных простаты для изменения гена
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Рост заболеваемости раком простаты выявление новых драйверов опухоли или модуляторы имеет решающее значение. Генетически модифицированные мыши модели (ГЭММ) для рака простаты сдерживаются неоднородность опухоли и ее динамика сложных Микроэволюция. Модели мыши традиционных рака простаты включают, среди прочего, микрофлорой и условного нокауты, трансгенных выражение онкогенов и гранулы ксенотрансплантата моделей. Поколение de novo мутаций в этих моделях является сложным, длительным и дорогостоящим. Кроме того большинство традиционных моделей целевой большинство эпителия простаты, в то время как хорошо известно человека рак простаты развиваться как изолированное событие в только небольшое подмножество ячеек. Ценность модели необходимо моделировать не только начало рака простаты, но и прогрессирования заболевания.
Здесь мы описываем метод целевым несколько ячеек путем преобразования клеток в эпителии простаты вирусных частиц. Доставка инженерии вируса в мышиных простаты позволяет изменения экспрессии генов в эпителия простаты. Тип вируса и количество будут настоящим определяется количество целевых ячеек для изменения гена преобразователя несколько клетки для начала рака и многие клетки для генной терапии. Через на основе хирургии инъекций, в передней доле, дистальная от мочевыводящих путей трек опухоли в этой модели можно развернуть без ущерба функцию мочи животного. Кроме того выбирая только подмножество эпителиальных клеток простаты техника позволяет клоновых расширения опухоли и поэтому имитирует человека опухоли посвящения, прогрессии, а также вторжения через базальную мембрану.
Этот роман техника обеспечивает мощный рака простаты модель с улучшение физиологических актуальность. Страдания животных ограничен, и поскольку без дополнительного размножения требуется, уменьшается общая животных игр. В то же время анализ новых генов кандидата и пути ускорения, который в свою очередь является более экономически эффективным.
Введение
За последнее десятилетие значительно улучшились обнаружения и лечения рака простаты. Тем не менее растет заболеваемость раком простаты, после ожидаемой продолжительности жизни. С приблизительно 1,1 миллиона новых случаев во всем мире это среди наиболее распространенных причин связанных с раком смерти мужчин 1. Рак предстательной железы является медленным в своем развитии, но когда рак прогрессировала в передовых метастатическим состояние, прогноз плохо из-за ограниченного лечения. Пока только несколько генов были определены как общие драйвера в этой рака, и его неоднородности и multifocality препятствует обнаружению биомаркеров и ориентации болезнь водители2,3.
Классические методы генерации GEMMs часто препятствовали их сложности, своевременно расходы и издержки. Условное нокаут модели широко использовался для изучения рака простаты кандидат гены, которые приводят к эмбриональной летальность при инактивированная микрофлорой4. Наиболее распространенные модели связаны рекомбиназа Cre простат специфического, движимый либо модифицированных Probasin5 или6 промоутер PSA интегрированы в ГЭММ, дополнительные метисации. В этих моделях гена интереса будут направлены в большинстве эпителиальных клеток простаты, генерации гиперплазии в весь орган, который может нарушить животного мочевыделительной функции7.
Вирусная доставки Cre белка путем инъекций в передней доле мышиных предстательной железы может решить эту проблему, только против нескольких клеток8. Принимая во внимание, метод выгоды от широкого круга возможных вариантов лаборатории технические предпосылки, опыт и целей. Успешные подходы, используя аденовирус, Хунб и Pten9 или человека, ориентация Pten и Trp5310 показали среди других. Добавление трансгенов, например Люцифераза, вирусный конструкции или ГЭММ Кроме того позволит Неинвазивный мониторинг прогрессирования заболевания через биолюминесценции изображений11.
Изменения генома, основанный на технологии ТРИФОСФАТЫ/Cas9 показывает новая и быстрая возможность изучить рака путем быстрого поколения соматических нокауты12. Вирусная доставки одного руководство РНК (sgRNAs) направлена к передней доле мышиных простаты устанавливает физиологически более соответствующие модели рака простаты. Таким образом отдельные клетки, переноски выбранной мутации могут образовывать клоны, которые способны расширения и вторжения. Кроме того использование руководство РНК для нескольких целевых генов будет создавать клоны клеток с изменениями в различных генов. Это позволит опухоли неоднородность и естественного отбора давления на прогрессии рака, который может выявить важность каждого гена изменения или epistatic механизмов.
Здесь мы представляем способ доставить вирусных частиц в мышиных простаты для изменения экспрессии генов. С небольшой разрез брюшной подвергается мышиных передней доле предстательной железы и вирусных частиц вводят в мочку. Пять дней после операции, хирургические зажимы могут быть удалены с поверхности кожи и рака предстательной железы могут быть проанализированы из 8 недель после. В целом это быстрый и экономичный процедура, которая имеет незначительное влияние на мыши и позволяет больше опухоли развивать без ущерба для мыши.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этот протокол включает хирургическая процедура в лабораторных мышей. Все эксперименты на животных должны быть индивидуально рассматриваются и утверждаются институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC). Как подход основан на животных восстановления и выживания, обеспечить соответствующие анестезии, боли и асептических хирургические среды на все время. Используйте грелку для предотвращения переохлаждения, во время операции и до выздоровления от анестезии.
1. Начиная с соображений
- В зависимости от используемых вирус могут применяться различные титр требования; Разбавьте вирус соответственно.
Примечание: В этом примере аденоассоциированный вирус, разбавленных в PBS вводят в титре 1 x 1012 МЕ/мл. Вирус серотипа 9 и содержит руководство РНК Pten и экспрессии белка Cre под убиквитин promotor (рис. 1). Потеря Pten увеличилась Пакт и пролиферации эпителия простаты13. - Использование самцов мышей в возрасте 8 недель на момент операции для обеспечения адекватного развития простаты.
Примечание: Мышей, показано в этом эксперименте, Rosa26-LSL-Cas9-EGFP knockin мышей C57BL/6J фон12 (рис. 1). - Свеже готовят смесь общим наркозом и если возможно хранить стерильные.
Примечание: Для лучшего животных восстановления после операции, противоядие анестезии настоятельно рекомендуется.- Подготовить общий объем 5 мл анестетика, смешайте 0,15 мл medetomidine гидрохлорид (1 мг/мл), мидазолама 0,4 мл (5 мг/мл) и Буторфанол 0,25 мл (10 мг/мл) с 4.2 мл стерильного соленой воды.
Примечание: Альтернативные анестезии методы, такие как ингаляции изофлюрановая, может использоваться в соответствии с руководящими принципами институционального ухода за животными. - Чтобы отменить эффект после операции medetomidine гидрохлорид, смешайте Атипамезола 0,1 мл (5 мг/мл) с 4,9 мл стерильной соленой воды.
- Подготовить общий объем 5 мл анестетика, смешайте 0,15 мл medetomidine гидрохлорид (1 мг/мл), мидазолама 0,4 мл (5 мг/мл) и Буторфанол 0,25 мл (10 мг/мл) с 4.2 мл стерильного соленой воды.
- Подготовка асептических хирургической среды путем надлежащего дезинфекции и стерилизации. Автоклав хирургических инструментов перед использованием.
2. вирус доставка мышиных простаты
- Анестезировать животное внутрибрюшинной инъекции 1 мл стерильного шприца и иглы 27 g x ½". Использование анестезии дозы 0,01 мл/г веса тела. Если процедура длится дольше, чем 30 мин, поддержания анестезии путем инъекций 1/3 начиная дозе каждые 30 мин.
- Изучите глубины анестезии путем оценки мышечная релаксация, педали вывода и глазной рефлексов. Когда наблюдается потеря рефлексов, брить нижней части живота животного.
- Осторожно накройте глаза животного ветеринарная Офтальмология Мазь, с использованием стерильным ватным тампоном, чтобы предотвратить слепоту из-за отсутствия роговицы рефлекс.
- Протрите бритая живота с 70% этанола и 10% повидон йод для дезинфекции хирургических области. Скраб хирургические области от центра области хирургической к периферии.
- Выполните вертикальный разрез на низкий брюшной midline примерно 1 см, используя стерильные хирургические ножницы.
- Поднимите брюшины, с помощью тонкой точке щипцы для предотвращения повреждения органов, которые лежат под. Аккуратно сделайте надрез < 8 мм, используя Ножницы хирургические через брюшину.
Примечание: В отличие от человека, грызун предстательной железы состоит из четырех отдельных лепестков. Передней доле прилагается к семенных пузырьков. - Аккуратно переместите жировой ткани сторону раскрыть семенных пузырьков. С помощью щипцов кольцо, осторожно поднимите семенных пузырьков до передней предстательной железы могут быть определены (рис. 1).
- Придать общий объем 30 мкл раствора вирус (3 x 1010 вирусных частиц) в передней эпителия простаты с помощью инсулина 0,5 мл шприц с иглой 30G x 8 мм. Свести к минимуму утечки и убедитесь, что жидкость впитывается в ткань, образуя небольшой пузырек. Место семенных пузырьков обратно в брюшной полости.
- Шовные брюшины с 2-3 простых Прерванный швы с помощью 6-0 рассасывающиеся швы с 13 мм, 3/8 окружности и конические точки иглой.
- Сшивание кожи с 3 клипы стерильные 4.8 x 6,5 мм, лифтинг кожи пинцетом, чтобы избежать повреждения брюшины.
- Для лучшего восстановления применить противоядия анестезии в дозе 0,01 мл/г веса тела, внутрибрюшной инъекции с использованием стерильных 1 мл шприц и иглу 27 g x ½". Осторожно поместите животных обратно в своей клетке.
3. после хирургии
- Держите клетки мышей, которые перенес операцию на грелку для 1 h после процедуры, для предотвращения переохлаждения до тех пор, пока полностью восстановился. Если применяется противоядие, животное должно быть проснулся через несколько минут после инъекции.
- Мониторинг животных ежедневно на исцеление и снятие боли указаний соответствующих раны. При необходимости применять дополнительные болеутоляющие согласно рекомендации институционального ухода за животными.
- Удаление кожи клипы после 4-5 дней, после закрытия раны.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Чтобы оценить вирус доставки мышиных простаты, образцы были проанализированы три месяца после операции. Rosa26-LSL-Cas9-EGFP мышей12 Экспресс GFP в клетках, которые были подвержены Cre белка, выраженные вирус. Простаты образцы были рассмотрены с флуоресцентной микроскопии для определения областей с GFP сигнал (рис. 2A). GFP сигнал указывает на активность КРР в эпителии простаты, но не ли Джин редактирования под воздействием ТРИФОСФАТЫ ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом протоколе мы описываем метод для изменения экспрессии генов в передней доле мышиных предстательной железы путем инъекции вируса, создание мощной новой модели мыши для рака простаты (рис. 2). Успешного управления аденовирус был впервые описан Leow et al. в 2005 году8. Ранее мы показали, как аденовирус кодирования для белка рекомбиназа Cre может заменить времени метисации Cre аллеля для удаления ткани конкретных 9 (
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Г-н финансировался стипендий от датской онкологическое общество (R146-A9394-16-S2). MFB и MKT финансировались, Нова AUFF (AUFF-E-2015-FLS-9-8). Г-н и MFB совместно финансируется выпускник школы, здравоохранение, АС. Лаборатория E.F.W. поддерживается грантов от министерства экономики (SAF2015-70857, совместно финансируемые ЕФРР-ЕС) и КЧП расширенный Грант (741888 - CSI-Fun) Испании.
Мы хотим поблагодарить Лилиана Fajardo Меллор (генов, развития и болезней; Национальный онкологический исследовательский центр) для критических чтении рукописи.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J мыши | The Jackson Laboratory | 26175 | |
| 0,5 мл U-100 инсулиновый шприц | BD | 324825 | для инъекции вируса |
| 1 мл шприц | BD | 300013 | для инъекции анестезии |
| 30 G 1/2' ' игла | BD | 304000 | для инъекции анестезии |
| 6-0 Полисорбский шов | Medtronic | GL889 | для закрытия брюшины |
| Одноразовая стерилизованная хирургическая простыня | несколько поставщиков | ||
| Грелка | несколько поставщиков | ||
| Повидон-йод Подготовительная прокладка | Fisher Scientific | 06-669-70 | |
| Обрезка аппарат | Aesculap | GT415 | для бритья живота |
| Щипцы Dumont | F.S.T | 11252-00 | |
| Микроиглодержатель Halsey | F.S.T | 12500-12 | |
| Ножницы для радужной оболочки | глаза F.S.T | 14094-11 | |
| Узконаправленные щипцы | F.S.T | 11002-12 | |
| Кольцевые щипцы | F.S.T | 11106-09 | |
| Система зажимов для ран Ручка в комплекте с зажимами | F.S.T | 12030-01 | для закрытия кожи |
| Система фиксаторов для ран Remover | F.S.T | 12030-04 | |
| Микроскоп | Leica | Использовались разные модели | |
| Reagents | |||
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Antisedan | получен из животного хозяйства | ||
| Буторфанол | получен из животного хозяйства | ||
| Медетомидингидрохлорид | получен из животного хозяйства | ||
| Мидазолам | получен из животного хозяйства | ||
| 100% этанол | Fisher Scientific | 22-032-103 | |
| Глазная мазь | Takeda | 7242 | |
| Вирус (AAV, AV) | множественных поставщиков | вирус, используемый в этом протоколе, представляет собой антитело к | |
| pAKT | CST | 4060 | используется 1:200 разведение |
| GFP anitbody | CST | 2956 | используется 1:100 разведение |
Ссылки
- Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).
- Robinson, D., et al. Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer. Cell. 162, 454(2015).
- Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct Funct. 214, 91-109 (2010).
- Wu, X., et al. Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation. Mech Dev. 101, 61-69 (2001).
- Ma, X., et al. Targeted biallelic inactivation of Pten in the mouse prostate leads to prostate cancer accompanied by increased epithelial cell proliferation but not by reduced apoptosis. Cancer Res. 65, 5730-5739 (2005).
- Chen, Z., et al. Crucial role of p53-dependent cellular senescence in suppression of Pten-deficient tumorigenesis. Nature. 436, 725-730 (2005).
- Leow, C. C., Wang, X. D., Gao, W. Q. Novel method of generating prostate-specific Cre-LoxP gene switching via intraductal delivery of adenovirus. Prostate. 65, 1-9 (2005).
- Thomsen, M. K., et al. Loss of JUNB/AP-1 promotes invasive prostate cancer. Cell Death Differ. 22, 574-582 (2015).
- Cho, H., et al. a novel GEM model for metastatic prostate cancer analysis and therapy, reveals myc as a driver of Pten-mutant metastasis. Cancer Discov. 4, 318-333 (2014).
- Cho, H., et al. Rapid in vivo validation of candidate drivers derived from the PTEN-mutant prostate metastasis genome. Methods. 77-78, 197-204 (2015).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159, 440-455 (2014).
- Wang, S., et al. Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer. Cancer Cell. 4, 209-221 (2003).
- Liu, W., et al. Copy number analysis indicates monoclonal origin of lethal metastatic prostate cancer. Nat Med. 15, 559-565 (2009).
- Haffner, M. C., et al. Tracking the clonal origin of lethal prostate cancer. J Clin Invest. 123, 4918-4922 (2013).
- Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).
- Price, D. Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate. Natl Cancer Inst Monogr. 12, 1-27 (1963).
- McNeal, J. E. Anatomy of the prostate: an historical survey of divergent views. Prostate. 1, 3-13 (1980).
- Thomsen, M. K., et al. SOX9 elevation in the prostate promotes proliferation and cooperates with PTEN loss to drive tumor formation. Cancer Res. 70, 979-987 (2010).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
