Method Article

Быстрые и конкретные иммуномагнитная изоляция первичной Олигодендроциты мыши

DOI:

10.3791/57543

⸱

May 21st, 2018

 ,  , 
1Program in Molecular and Cellular Biology, State University of New York Downstate Medical Center, 2Department of Neurology and Rehabilitation, University of Illinois at Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем иммуномагнитная изоляции первичных мыши олигодендроциты, который позволяет быстрый и конкретный изоляции клеток в vitro культуры.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эффективная и надежная изоляция и культуре первичных Олигодендроциты (МЖС) является ценным инструментом для изучения в vitro развития oligodendroglia, а также биологии демиелинизирующих заболеваний, как рассеянный склероз и Как Пелицэуса Мерцбахера болезнь (ПМЛД). Здесь, мы представляем простой и эффективный выбор метода для изоляции иммуномагнитная этап три О4+ preoligodendrocytes клетки от новорожденных мышей щенков. Так как незрелых OL составляют более 80% грызунов мозг белого вещества на послеродовой день 7 (P7) Этот метод изоляции не только гарантирует Высокодоходные клеточной, но и конкретные изоляции МЖС уже привержены линии oligodendroglial, снижение возможность изолировать загрязняющих клетки, такие как астроциты и другие клетки мозга мыши. Этот метод представляет собой модификацию методов, о которых сообщалось ранее и обеспечивает чистоту подготовка Олигодендроциты выше 80% в около 4 ч.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Олигодендроциты (МЖС) являются myelinating клетки центральной нервной системы (ЦНС)1. Изоляции и культуры первичной Олигодендроциты в жестко регулируемой среде является ценным инструментом для изучения в vitro развития oligodendroglia, а также биологии демиелинизирующих заболеваний, как рассеянный склероз2 . Это требует эффективной и надежной Олигодендроциты изоляции и культуры метод3. В этом исследовании мы воспользовались выражения отличительной Олигодендроциты клеток поверхности маркер осуществить изменение изоляции техника, которая является быстрое и конкретным.

Были определены четыре различные стадии созревания олигодендроциты, каждый характеризуется выражением отличительные клеток поверхностных маркеров для каждой стадии развития (рис. 1). Эти клетки поверхностных маркеров могут быть признаны особые антитела4,5и может использоваться для изоляции Судана на определенных этапах. На первом этапе Олигодендроциты клетки-предшественники (OPCs) имеют способность размножаться, миграции и конкретно выражать тромбоцитарный фактор роста рецепторов (PDGF-Rα)6, Ганглиозиды A2B5, протеогликана NG27,8 , polysialic кислота нейронных клеток молекулы адгезии9 и белок, связывающий жирные кислоты 7 (FABP7)10. OPCs у биполярной морфологией с нескольких коротких процессов, вытекающих из противоположных полюсов клетки тела, которая является характеристикой нейронных прекурсоров клетки11.

Диаграмма созревания олигодендроцитов; стадии с маркерами: OPC, Preoligodendrocyte, Immature, Mature.
Рисунок 1: выражение клеток поверхностных маркеров во время разработки мыши олигодендроциты. ОМЖС ячейки поверхностных маркеров, такие как A2B5, GalC (O1), NG2, O4 и PDGF-Rα может использоваться для специально изолировать Олигодендроциты на конкретной стадии развития с помощью специфических антител.   Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

На втором этапе, OPCs породить preoligodendrocytes и выразить в клеточной мембраны не только маркеры OPC, но и sulfatide (сульфатированных galactolipid) признана O4 антитела12,13и GPR17 белков14, которая продолжается до стадии незрелых Олигодендроциты (OL). На данном этапе preoligodendrocytes продлить многополярного короткие процессов. Preoligodendrocytes в стадии крупнейших пр на послеродовой день 2 (P2) мозгового белого вещества крысы и мыши с незначительными населением незрелых мост15.

На третьем этапе незрелых Судана продолжают выражать O4, теряют выражение A2B5 и NG2 маркеров и начинают выражать galactocerebroside C16. На данном этапе МЖС привержены линии oligodendroglial и стать после митотическая клетки с давно разветвленной ветви17,18. В это время первые клетки MBP+ наблюдаются15,19,,2021и незрелых OL составляют более 80% грызунов белого вещества на P7. Таким образом изоляция операции МЖС в P7 может обеспечить Высокодоходные клеточной.

В окончательный и четвертой стадии развития OL Зрелые Мост Экспресс myelinating белки (основной белок миелина (MBP), proteolipid белка (ПЛП), миелина связанные гликопротеина (МАГ) и миелина Олигодендроциты гликопротеина (MOG)22,23 ,24,25,26. На данном этапе Зрелые МЖС продлить мембраны что компактная форма обертыванием влагалищ вокруг аксоны и способны myelinate. Это совпадает с замечанием о том, что в мозге крысы и мыши, MBP+ клетки становятся все более обильные P1419,,2021.

Начиная с первой изоляции Олигодендроциты Fewster и его коллеги в 1967 году27включая immunopanning28,29,30, были осуществлены несколько методов для изоляции Судана от грызунов ЦНС активирован флуоресценции клеток сортируя (FACS) эксплуатации клеток поверхности специфичные антигены28,31, дифференциальной градиентного центрифугирования32,33,34,35 и покачивая метод, основанный на дифференциальных соблюдения различных ЦНС глии36,-37. Однако существующие методы культуры имеют ограничения, особенно с точки зрения чистоты, урожайность и времени, необходимого для выполнения процедуры38. Таким образом необходимы более эффективные методы изоляции олигодендроциты.

В этой статье, мы представляем простой и эффективный выбор метода для изоляции иммуномагнитная этап три О4+ preoligodendrocytes клетки от новорожденных мышей щенков. Этот метод является модификацией техники, сообщает Эмери et al. 39 и Dincman и др. 40 и обеспечивает подготовку чистоту Олигодендроциты выше 80% в около 4 ч.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мышей, используемые в данном исследовании были заботятся согласно указаниям номер протокола SUNY Downstate медицинский центр Отдела о лабораторных животных ресурсов (DLAR) 15-10492.

Примечание: Основная Олигодендроциты были изолированы от новорожденных (P5-P7 одичал тип C57Bl/6Н) мышах. На данном этапе незрелых МЖС составляют более 80% грызунов белого вещества, обеспечение высокой доходности сотовых. Все буфера и реагента композиций доступны в конце Таблицы материалов.

1. Coverslips подготовка

Примечание: Поли-D-Лизин (PDL) / Ламинин покрытием coverslips должен быть подготовлен до OL изоляции.

  1. Место #1 Немецкий стекло coverslips в 50-мл Конические трубки и добавить 35 мл 70% EtOH, чтобы очистить их.
  2. Закройте трубку, поместите его в миксер nutating и инкубации при комнатной температуре по крайней мере 30 минут во время нежно покачиваясь. Coverslips может быть инкубированы всю ночь.
  3. Выбросите EtOH 70%.
  4. Мыть coverslips 3 раза с дейонизированной водой, удалить воду каждый раз с вакуум-аспирацией.
  5. Добавьте coverslips в 50-мл пробирку, достаточно для покрытия coverslips 30-35 мл PDL 50 мкг/мл.
  6. Место 50-мл пробирку, содержащую coverslips на nutating смеситель и инкубации при комнатной температуре по крайней мере 30 минут во время нежно покачиваясь.
  7. Мыть coverslips 3 раза с дейонизированной водой, удаляя воду каждый раз с вакуум-аспирацией.
  8. Перевод coverslips на Петри 60-мм, содержащие деионизированную воду.
  9. Используете наконечник пипетки Р200 организовать coverslips слой, покрывающий всю поверхность Петри.
  10. Тщательно удалите воду из блюд с вакуум-аспирацией.
  11. Удалите избыток воды вокруг coverslips и дайте им высохнуть на ночь с открытой крышкой и под УФ света в капюшоне.
    Примечание: PDL покрытием стекла coverslips могут храниться на 4 ° C в стерильные чашки Петри на срок до трех месяцев.
  12. Поместите coverslips в 24-ну пластины, один на колодец, с помощью тонкой щипцами.
  13. Перемещение coverslips к центру также убедившись, что края не прикасайтесь к стенке скважины.
  14. 100 мкл 10 мкг/мл Ламинин, разбавленных в B27NBMA (см. Таблицу материалов) начиная в центре каждого coverslip и перемещение в циркуляре моды к краям, чтобы охватить все области.
    Примечание: Поскольку Ламинин участвует в ПР обслуживания и способствует дифференциации в зрелых ОМЖС, это является важным фактором выживания OL в vitro культуры41,42,,4344.
  15. Инкубируйте пластину в инкубатор 37 ° C на 5% CO2 для по крайней мере 1 час или до тех пор, пока OLs готовы для обшивки.

2. диссоциация коры мозга мыши

  1. Пожертвуйте послеродовой 5-7-дневный старые C57Bl/6Н мыши щенков быстро обезглавливание с ножницами, ранее мыть в 70% этиловом спирте.
    Примечание: коре головного мозга от 5-6 щенков новорожденных мышей были использованы для каждого приготовления. В среднем один мозг мыши дает 1-1,5 х 106 ОМЖС.
  2. Вырезать ножницами мелких рассечения кожи головы вдоль средней линии и отозвать подвергать черепа.
  3. Вырежьте черепа внимательно вдоль средней линии, начиная с открытия в задней части черепа к фронтального области, подняв с ножницами, чтобы избежать повреждения мозга. Затем используя открытия задней части черепа режут к каждой глазницы вдоль основания черепа.
  4. Использование тонкой щипцами осторожно дразнить коре от мозга и передавать их на блюдо культуры ткани 60-мм, содержащие 7 мл B27NBMA. Повторите шаги 2.2 через 2.4 для каждого мозга, объединение расчлененных коре.
  5. Передать новое блюдо культуры ткани 60-мм, содержащие 5 мл буфера диссоциации коре (B27NBMA, 20-30 ед/мл папаин и 2500 U DNase I).
  6. Нарезать на мелкие кусочки около 1 мм3 с помощью лезвием скальпеля #15 коре и проинкубируйте втечение 20 мин в 37 ° C, 5% CO2 инкубатора.
  7. Добавьте 1 мл сыворотки роста крупного рогатого скота (BGS), чтобы остановить ферментативной реакции.
  8. Коре наряду с диссоциации СМИ передать 15 мл Конические трубки с помощью Серологические Пипетки 10 мл.
  9. Нежно начинают отделить ткани мозга, медленно закупорить вверх и вниз 6 - 8 раз с помощью 10-мл Серологические Пипетки, используя уход для сведения к минимуму пузыри.
  10. Разрешить куски ткани соглашаться на 2-3 мин и передать свежие трубки супернатант.
  11. Добавить 3 мл B27NBMA, содержащие 10% Кортикальной/2500 U DNase I к ткани Пелле.
  12. Используйте 5 мл Серологические Пипетки для осторожно отделить ткани мозга во время закупорить вверх и вниз 6 - 8 раз. Будьте осторожны, чтобы минимизировать пузыри.
  13. Разрешить куски ткани соглашаться на 2-3 мин.
  14. Супернатант передать свежие трубки. Добавить 3 мл B27NBMA, содержащие 10% Кортикальной/DNase I к ткани Пелле.
  15. Аккуратно отделить ткани мозга, используя кончик накапайте P1000, пока дозирование смеси СМИ и мозг ткани вверх и вниз. Повторите шаги 2.13 и 2,14 до тех пор, пока не большие куски ткани остаются или до B27NBMA содержащий 10% Кортикальной/DNase I в исчерпаны, что наступит раньше. Будьте осторожны, чтобы минимизировать пузыри.
  16. Суспензию клеток в бассейн с предыдущим supernatants.
  17. Место 70 мкм ячейки сита в 50-мл. С помощью 10-мл Серологические Пипетки, передайте суспензию пула клеток нежно ситечко ячейки 70 мкм.
  18. Промойте ситечко ячейки, добавив 1 мл B27NBMA, содержащие 10% Кортикальной/DNase I.
  19. Отменить фильтр ячейки. Довести объем до 30-мл с B27NBMA, содержащие 10% Кортикальной/DNase I.
  20. Суспензию клеток передавать два 15-мл конические трубы. Центрифуга суспензию клеток в течение 10 минут при 200 x g.
  21. Удалите супернатант не выходя из клетки, подвергается в воздухе. Супернатант будет ясно из-за мусора клеток. Добавить 3 мл B27NBMA, содержащие 10% Кортикальной Пелле.
  22. Осторожно отделить Пелле клетки, с помощью пипетки P1000. Довести объем до 15 мл с B27NBMA, содержащие 10% BGS.
  23. Передайте суспензию клеток через стрейнер клеток свежие 40 мкм.
  24. Промойте ситечко ячейки, добавив 1 мл B27NBMA, содержащие 10% BGS. Отменить фильтр ячейки.
  25. Довести объем до 30 мл с B27NBMA, содержащие 10% BGS.
  26. Суспензию клеток передавать 2 x 15 мл конические трубы. Центрифуга суспензию клеток в течение 10 минут при 200 x g.
  27. Удалите большую часть супернатант не выходя из клетки, подвергается в воздухе. Ресуспензируйте клетки окатышей в 5 мл, лед холодной магнитные ячейки, сортировка (MCS) буфера.

3. Определение клеток и жизнеспособности

  1. Разбавляют 100 мкл суспензии клеток с 400 мкл раствора Трипановый синий в 1,5 мл microcentrifuge трубки для достижения разбавления 1:5 в 0,4% (w/v).
  2. Центр Стекло покровное над камеры Горяева и заполнения двух камер с 10 мкл ячейки разрежения с помощью пипетки P10 и во избежание переполнения. Решение будет проходить под покровным стеклом капиллярность.
  3. Поместите Горяева на микроскопа и отрегулировать фокус с помощью 40 кратном.
    Примечание: Клеток записываются с помощью ручной счетчик в каждом из пяти квадратов (четырех углов и один центр). Только нежизнеспособных клеток поглощать красителя и синее, хотя живой и здоровые клетки появляются круглые и рефракционной и не впитывают краска синего цвета, позволяя для определения числа жизнеспособных и общая клеток на миллилитр.

4. изоляция О4+ Олигодендроциты

  1. Центрифуга суспензию клеток на 200 g x 10 мин.
  2. Тщательно отбросить супернатант с помощью вакуум-аспирации, избегая воздействия клеток в воздух.
  3. Ресуспензируйте гранулы в 90 мкл буфера MCS за 1 x 107 всего клетки с последующим добавлением 10 мкл анти О4 бусы на 1 x 10-7 клеток.
  4. Смешайте суспензию клеток и бусы, нежно стряхивая 15 мл конические с палец 4 - 5 раз.
  5. Инкубировать смесь для 15 мин при температуре 4 ° C, стряхивая 15 мл конические с палец 4-5 timesevery 5 мин.
  6. Вымойте смесь осторожно добавив 2 мл буфера MCS за 1 x 10-7 клеток к трубе. Центрифуга смесь на 200 g x 10 мин.
  7. Отказаться от супернатанта, тщательно с использованием вакуумной аспирации, избегая воздействия клеток в воздух. Ресуспензируйте Пелле клеток в 500 мкл буфера МКН для каждого 1 x 107 клеток.
  8. Прикрепите магнитный сепаратор магнитный сепаратор стенда. Прикрепить столбец выделения к магнитным сепаратором и место стрейнер клеток 40 мкм на колонне. Место два 15-мл или один 50-мл Конические трубки ниже разделения столбцов для сбора через поток.
  9. Предварительно промыть 40 мкм фильтром и разделения столбца ячейки с 3 мл буфера MCS и пусть буфере запустить через колонку, не давая ему высохнуть.
  10. Добавьте смесь суспензии клеток и бусы ситечко клеток и в столбце выбора.
  11. Вымойте 40 мкм клеток ситечко с 1 мл раствора MCS буфера.
  12. Отменить ячейки сита и пусть смесь клеток, бусы и буфера, запустить через колонку, не давая ему высохнуть.
  13. Вымойте разделения столбцов 3 раза с 3 мл буфера MCS и 1 раз с OL распространения средствами массовой информации.
  14. Удалите столбец разделение из магнитный сепаратор, быстро поместить его в 15 мл конические пробки и сразу же добавить 5 мл OL распространения средств массовой информации.
  15. Место поршень в верхней части столбца и твердо толчок для промывки помечены клетки в 15 мл Конические трубки.
  16. Удаление 100 мкл суспензии клеток для определения клеток и жизнеспособности, используя Трипановый синий и Горяева, как указано в разделе 3.
    Примечание: Жизнеспособность клеток выше 80% считается приемлемым приступить к культуре ОМЖС, однако жизнеспособность более чем на 90% является оптимальным.

5. покрытие изолированных О4+ Олигодендроциты

  1. Разбавления суспензии клеток на желание, покрытие плотность (5 x 105 ячеек на coverslip) с помощью OL распространения средств массовой информации.
    Примечание: OL, плотность посева очень важно, поэтому плотность соответствующей ячейки должны быть подтверждены с помощью микроскопа культуры ткани перед. Посева плотность ниже 10 000 клеток/coverslips может привести к плохой ячейку выживания. На покрытие плотность при 10000 до 25000, OL морфологической дифференцировки является медленным45. Мы пластины МЖС на посевной плотности по крайней мере 50 000 клеток/coverslips обеспечить выживание клетки.
  2. Перемещение пластин 24-Ну, содержащие coverslips, покрытые Ламинин от инкубатора на культуре ткани капот.
  3. Удаление Ламинин от каждого coverslip и замените его с 100 мкл суспензии OL.
  4. Инкубируйте ОМЖС в 37 °C/5% CO2 инкубатора для максимум 45 мин содействовать OL адгезии к coverslips.
  5. После инкубации удалите 24-ну пластины из инкубатора. Наводнение каждый хорошо из 24-ну пластины с 500 мкл OL распространения средств массовой информации.
  6. Место операции МЖС обратно в 37 °C/5% CO2 инкубатора для дополнительных 24 h.
  7. 24 ч после покрытия операции МЖС, удалите распространения средств массовой информации и заменить OL дифференциация СМИ побудить дифференциации.
  8. Место операции МЖС обратно в инкубаторе и не удалять до тех пор, пока клетки готовы к фиксации.
    Примечание: Изменения в pH вредны для Судана и снижение жизнеспособности клеток, поэтому следует избегать ненужных удаления операции МЖС культур из инкубатора.

6. иммунофлюоресценции пятнать

  1. Для обнаружения ячейки поверхностных маркеров (NG2, O1 и O4) удалить медиафайл из скважин.
  2. 250 мкл мыши гибридомной supernatants содержащие первичных антител против O1 (неразбавленный)13 и O4 (неразбавленный)13 и кролика polyclonal против NG2 (1: 150, разбавленных в B27NBMA).
    Примечание: Если коммерчески доступных антитела анти О1 и анти О4 должны использоваться, это целесообразно использовать разведений, предложил заводом-изготовителем.
  3. Инкубируйте клетки с основное антитело для 45 мин Максимальная в 37 °C/5% CO2 инкубатора.
  4. Мыть дважды с 0,05% анимации-20/1 X PBS. Исправить клетки с параформальдегида 4% (4% PFA) для 10 мин при комнатной температуре.
  5. Вымойте три раза за 5 мин с 0,05% анимации-20/1 X PBS.
  6. Разбавьте Alexa 488-конъюгированных коза анти мыши IgM или вторичного антитела анти кролик IgG (1: 400), в B27NBMA.
  7. Удаление ПБС 0,05% анимации-20/1 от coverslips. Инкубируйте клетки с вторичное антитело за 1 ч при комнатной температуре в темноте.
  8. Вымойте три раза за 5 мин с 0,05% анимации-20/1 X PBS.
  9. Для двойной окрашивания для выявления внутренних маркеров (СВМС), удалите 0,05% анимации-20/1 X PBS и блок/разрушения клеток с буфера блока/permeabilization 15 мин при комнатной температуре. В противном случае перейдите к шагу 6.17.
  10. Удаление буфера блока/permeabilization и добавить 250 мкл курица анти СВМС (1: 100) разводят в буфер блок/permeabilization.
  11. Инкубируйте клетки с анти СВМС для 1 ч при комнатной температуре. Вымойте три раза за 5 мин с 0,05% анимации-20/1 X PBS.
  12. Разбавьте конъюгированных Alexa 594 коза анти курица IgG вторичное антитело (1: 400) в B27NBMA.
  13. Удаление ПБС 0,05% анимации-20/1 от coverslips. Инкубируйте клетки с вторичное антитело за 1 ч при комнатной температуре в темноте.
  14. Вымойте три раза за 5 мин с 0,05% анимации-20/1 X PBS.
  15. Изображение с 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) и смонтировать клетки с antifade монтаж средств массовой информации, содержащие DAPI.
  16. Пусть coverslips лечения на ночь в темноте при комнатной температуре.
  17. Изображения окрашенных клеток с помощью эпифлуоресцентного микроскопа.
    Примечание: В настоящем Протоколе, клетки были образы на 40 кратном увеличении с помощью единообразного выдержка.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Целью данного исследования было установить метод улучшения изоляции для О4+ мыши олигодендроциты, требуя наименьшего манипулирования клеток-мишеней. Вся процедура от эвтаназии щенков для обшивки клеток в coverslips занимает около 4 часов, и данных, показанный здесь представляют три независимых экспериментов. После диссоциации ткани в среднем 4,3 ± 0.46 x 107 клеток были изолированы для каждой независимой эксперимент с жизнеспособности 91% ± 5,6%. После того, как имму...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой связи мы представляем метод для эффективной изоляции высокоочищенных незрелых мыши Олигодендроциты культур. По сравнению с ранее опубликованные протоколы39,40, этот метод принесли более высокой чистоты с гораздо более низком уровне астроциты СВМС положительные и очень низкий процент других клеток, не характерны. Важно отметить, что эти незрелые МЖС уже совершенных в линии oligodendroglial. Таким образом эти клетки не будет полезным для изучения ранних стад...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы имеют не раскрытия.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано грантов от Национальное общество рассеянного склероза (RG4591A1/2) и национальных институтов здравоохранения (R03NS06740402). Авторы благодарят д-р Иван Эрнандес и его члены лаборатории за предоставление лабораторных помещений, оборудования и консультации.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 мл серологические пипеткиFisher Scientific13-676-10J
10 мл шприц Luer-Loc tipBD, Becton Dickinson309604
15 мл конические пробиркиFalcon352097
24-луночные планшеты для культуры тканейFalcon353935
40&микро; m клеточное ситечкоFisher Scientific22368547
конические пробирки 50 млFalcon352098
серологические пипетки 5 млFisher Scientific13-676-10H
60 мм планшеты для культуры тканейFalcon353002
70&микро; m клеточный фильтрFisher Scientific22363548
Alexa Fluor 488 козий анти-мышиный IgG (H+L) вторичное антителоInvitrogenA11001
Alexa Fluor 488 козий анти-кролик IgM (H+L) вторичное антителоInvitrogenA21042
Alexa Fluor 488 козий анти-кроличий IgM (H+L) вторичное антителоInvitrogenA11008
Alexa Fluor 594 козий антикуриный IgG (H+L) вторичное антителоInvitrogenA11042
Анти-O4 шарики - Anti-O4MicroBeadsMiltenyi Biotec130-094-543
Апо-трансферрин человеческийSigmaT1147
Autofil полный фильтр для бутылки в сборе, фильтр 0,22 мкм, 250 млСША Scientific6032-1101
Autofil полный фильтр для бутылки сборка, 0,22 мкм фильтр, 250 млСША Scientific6032-1102
B27 ДобавкаInvitrogen17504-044
Борная кислотаSigmaB7660
Сыворотка для роста крупного рогатого скота (BGS)GE Healthcare Life SciencesSH30541,03
BSAFisher ScientificBP-1600-100
CNTFPeprotech450-50
d-BiotinSigma B4639
Дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза I)WorthingtonLS002007
EDTAFisher ScientificS311
Эпифлуоресцентный микроскоп с фотоаппаратом Olympus DP70OlympusBx51
Feather одноразовые скальпелиAndwin ScientificEF7281C
ForskolinSigmaF6886
Немецкие стеклянные покровные стекла, #1 толщина, диаметр 12 мм круглыйNeuVitroGG-12-oz
GFAP антителоAvesGFAP
GlucoseFisher ScientificD16-1
GlutaMAXInvitrogen35050-61
ИнсулинInvitrogen12585-014
Стенд магнитный сепаратор - MACS мультистендMiltenyi Biotec130-042-303
Магнитный сепаратор - MiniMACS сепараторMiltenyi Biotec130-042-302
Millex PES 0.22&микро; m фильтрующий блокMilliporeSLG033RS
Монтажный материал- Prolong Gold with DAPIThermo FisherP36930
N-ацетил-цистеин (NAC)SigmaA8199
Натуральный мышиный ламининInvitrogen23017-015
Нейробазальная среда AInvitrogen10888-022
Нейротрофин-3 (NT-3)Peprotech450-03
NG2 антителоMilliporeAB5320
PapainWorthingtonLS003126
PBS без Ca2+ и Mg2+SigmaD5652
PDGFPeprotech100-13A
чашкиПетри Falcon351029
Поли-D-лизинSigmaP6407
ПримоцинИнвивогенAnt-PM-2
ПрогестеронSigmaP8783
ПутресцинSigmaP5780
Селекционная колонка-LS колонкиMiltenyi Biotec130-042-401
Селенит натрияSigmaS5261
Микроэлементы BCorning25-000-CI
Трийодтиронин (T3)SigmaT6397
Triton-XSigmaT8787
Трипановый синий растворCorning25-900-CI
Tween 20SigmaP1379
B27NBMA487,75 мл нейробазальной среды А; 10 мл добавки B27; 1 мл примоцина; 1,25 мл Глутамакса; Фильтр простерилизовать и хранить при 4°С; C до использования.
B27NBMA + 10% BGS27 мл B27NBMA; 3 мл сыворотки роста крупного рогатого скота
CNTF раствор (10 & микро; г/мл; 1000X)Заказ от Peprotech (450-50). Концентрируйте от 0,1 до 1 мг/мл в соответствии с рекомендациями производителя (может варьироваться от лота к лоту) в буфере (например, DPBS + 0,2% BSA). Хранить при температуре -80 °C.<бр/> Рабочий раствор (10 °C; г/мл, 1000X)<бр/> 1. Сделать по 0,2% БСА (Fisher scientific BP-1600-100) в растворе DPBS и простерилизовать фильтр.<бр/> 2. Разбавьте аликвоту мастер-стока до 10&микро; г/мл в стерильном, охлажденном 0,2% BSA/DPBS.
3. Аликвот (20&микро; л/тюбик) и мгновенной заморозки в жидком азоте.<бр/> 4. Хранить аликвоты при температуре -80 °С.
d-биотин стоковый раствор (50 & микро; г/мл; 5000X)Ресуспендированный d-биотин (Sigma-B4639) в двойном дистиллированном H2O при 50 &; г/мл (например, 2,5 мг в 50 мл ddH2O). Повторное взвешивание может потребовать изрядного перемешивания/перемешивания или умеренного кратковременного потепления при 37°C. Если d-биотин все еще не растворяется, можно восполнить менее концентрированный (например, 10&микро; г/мл), а также добавить к B27NBMA больший объем (1/1000, вместо 1/5000). Хранить при температуре 4&�C.
DNase I стоковый раствор1. Растворить при 12 500 ЕД дезоксирибонуклеазе I/мл в охлажденном на льду HBSS.<бр/> 2. Фильтр стерилизовать на льду<бр/> 3. Аликвота в 200 &микро; и замерзнуть на ночь при -20°С.<бр/> 4. Хранить аликвоты при температуре от -20 до -30°С.
Дульбекко s Фосфатно-солевой буфер (без Ca2+ и Mg2+)Растворите мешочек в 1 литре воды до получения 1 литра среды при 9,6 граммах порошка на литр среды. Хранить при температуре 2-8 °C.
Форсколин стоковый раствор (4,2 мг/мл; 1000X)Добавьте 1 мл стерильного ДМСО к 50 мг Форсколина во флакон (Sigma-F6886) и пипетируйте пипеткой до ресуспендирования. Переложите в центрифужную пробирку объемом 15 мл и добавьте 11 мл стерильного ДМСО, чтобы довести до 4,2 мг/мл. Аликвота (например, 20 & микро; м) и хранить при температуре -20°С.
Хэнк s сбалансированных солей (HBSS) (Sigma1. Отмерьте 900 мл воды (температура 15-20°; В) в цилиндре и аккуратно перемешайте.<бр/> 2. Добавьте мощность и перемешайте до полного растворения.
3. Промойте оригинальную упаковку небольшим количеством воды, чтобы удалить все следы порошка.<бр/> 4. Добавляем в раствор на шаге 2.
5. Добавьте 0,35 г гидрокарбоната натрия (7,5% по массе) на каждый литр конечного объема.<бр/> 6. Продолжайте помешивать до полного растворения.
7. Отрегулируйте pH буфера при перемешивании на 0,1-0,3 единицы ниже pH= 7,4, так как при фильтрации он может повыситься. Использование 1N HCl или 1N NaOH рекомендуется для регулировки pH.
8. Добавьте немного воды, чтобы довести итоговый объем до 1л.<бр/> 9. Стерилизовать путем фильтрации с помощью мембраны с пористостью 0,22 мкм.<бр/> 10. Хранить при температуре 2-8 °C.
Исходный раствор инсулина (4000 &; г/мл)Разморозьте флакон и аликвоту 25 &микро; л на микроцентрифужную пробирку и хранить при температуре -20°С.
ламининаМедленно разморозьте ламинин на холоде (2&�; C до 8° В) чтобы избежать образования геля. Затем аликвоты в полипропиленовые трубки. Хранить в 5° C до -20°С; C в аликвотах (например, 20 & микро; м) и не замораживать/размораживать повторно. Ламинин может храниться при таких температурах до полугода.
для магнитной сортировки клеток (MCS)Приготовьте раствор, содержащий фосфатно-солевой буфер (PBS), pH 7,2 и 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 0,5 мМ ЭДТА, 5&микро; г/мл инсулина, 1 г/л глюкозы. Стерилизуйте и дегазируйте путем фильтрации буфера, пропуская его через 0,22 & микро; m Фильтр Millex. Храните буфер при температуре 4° C до использования
стандартного раствора N-ацетил-L-цистеина (NAC) (5 мг/мл; 1000X)Растворите N-ацетил-L-цистеин (Sigma-A8199) в дозе 5 мг/мл в DMEM (например, 50 мг NAC в 10 мл B27NBMA). Фильтр стерилизуется и аликвотируется (например, 20 & микро; м). Хранить при температуре -20°С.
Стоковый раствор NT3 (1 & микро; г/мл; 1000X)Мастер-сток:<бр/> Заказ от Peprotech (450-03). Концентрация препарата составляет от 0,1 до 1 мг/мл в зависимости от производителя (может варьироваться от лота к лоту), в буфере (например, DPBS + 0,2% BSA). Хранить при -80°C.

Рабочий состав (1&микро; г/мл; 1000X):
1. Внесите 0,2% BSA в раствор DPBS и простерилизуйте фильтром.
2. Разбавьте аликвоту мастер-стока до 1&мкм; г/мл в стерильном, охлажденном 0,2% BSA/DPBS.
3. Аликвоты (например, 20&микро; л/тюбик) и мгновенной заморозки в жидком азоте.<бр/> 4. Хранить аликвоты при -80°С.
Стоковое решение PDGF (10 & микро; г/мл; 1000X)Мастер-сток:<бр/> Заказ от Peprotech (100-13A). Концентрация препарата составляет от 0,1 до 1 мг/мл в зависимости от производителя (может варьироваться от лота к лоту) в буфере (например, DPBS) + 0,2% BSA). Хранить при -80°C.

Рабочий состав (1&микро; г/мл; 1000X):
1. Внесите 0,2% BSA в раствор DPBS и простерилизуйте фильтром.
2. Разбавьте мастер-бульон аликвоту до 1&микро; г/мл в стерильном, охлажденном 0,2% BSA/DPBS.
3. Аликвоты (например, 20&микро; л/тюбик) и мгновенной заморозки в жидком азоте.<бр/> 4. Хранить аликвоты при -80°С.
Поли-D-лизин (1 мг/мл; 100X)Ресуспендировать поли-D-лизин, молекулярная масса 70-150 кД (Sigma P6407) в дозе 0,5 мг/мл в 0,15 мг борной кислоты pH 8,4 (например, 50 мг в 50 мл боратного буфера). Фильтр стерилизующий и аликвотный (например, 100&микро; l/tube). Хранить при температуре -20°C. Перед использованием разбавьте 100-кратный бульон (1 мг/мл) до 50°; г/мл в стерильной воде.
для пролиферации олигодендроцитовсм. Дополнительная таблица 1Среда
для дифференцировки олигодендроцитовсм. Дополнительная таблица 1Sato
добавка (100X)см. Дополнительная таблица 1
Ссылки: список реагентов и рецептов был взят из протоколов, ранее описанных Emery et al. 2013 (Emery, B. & Дугас, Д. К. Очистка клеток линии олигодендроцитов из коры головного мозга мышей методом иммунопанорамирования. Колд Спринг Харб Проток. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) и Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Уитмор, С. Р. Выделение клеток-предшественников олигодендроцитов коры головного мозга мыши. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012))
Раствор Буфер Среды

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Emery, B. Regulation of oligodendrocyte differentiation and myelination. Science. 330 (6005), 779-782 (2010).
  2. Yang, Z., Watanabe, M., Nishiyama, A. Optimization of oligodendrocyte progenitor cell culture method for enhanced survival. J Neurosci Methods. 149 (1), 50-56 (2005).
  3. Niu, J., et al. An efficient and economical culture approach for the enrichment of purified oligodendrocyte progenitor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 241-249 (2012).
  4. Zhang, S. C. Defining glial cells during CNS development. Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).
  5. Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. The oligodendrocyte and its many cellular processes. Trends Cell Biol. 3 (6), 191-197 (1993).
  6. Hart, I. K., Richardson, W. D., Heldin, C. H., Westermark, B., Raff, M. C. PDGF receptors on cells of the oligodendrocyte-type-2 astrocyte (O-2A) cell lineage. Development. 105 (3), 595-603 (1989).
  7. Nishiyama, A., Lin, X. H., Giese, N., Heldin, C. H., Stallcup, W. B. Interaction between NG2 proteoglycan and PDGF alpha-receptor on O2A progenitor cells is required for optimal response to PDGF. J Neurosci Res. 43 (3), 315-330 (1996).
  8. Pringle, N. P., Mudhar, H. S., Collarini, E. J., Richardson, W. D. PDGF receptors in the rat CNS: during late neurogenesis, PDGF alpha-receptor expression appears to be restricted to glial cells of the oligodendrocyte lineage. Development. 115 (2), 535-551 (1992).
  9. Grinspan, J. B., Franceschini, B. Platelet-derived growth factor is a survival factor for PSA-NCAM+ oligodendrocyte pre-progenitor cells. J Neurosci Res. 41 (4), 540-551 (1995).
  10. Sharifi, K., et al. Differential expression and regulatory roles of FABP5 and FABP7 in oligodendrocyte lineage cells. Cell Tissue Res. 354 (3), 683-695 (2013).
  11. Chittajallu, R., Aguirre, A., Gallo, V. NG2-positive cells in the mouse white and grey matter display distinct physiological properties. J Physiol. 561 (Pt 1), 109-122 (2004).
  12. Bansal, R., Warrington, A. E., Gard, A. L., Ranscht, B., Pfeiffer, S. E. Multiple and novel specificities of monoclonal antibodies O1, O4, and R-mAb used in the analysis of oligodendrocyte development. J Neurosci Res. 24 (4), 548-557 (1989).
  13. Sommer, I., Schachner, M. Monoclonal antibodies (O1 to O4) to oligodendrocyte cell surfaces: an immunocytological study in the central nervous system. Dev Biol. 83 (2), 311-327 (1981).
  14. Boda, E., et al. The GPR17 receptor in NG2 expressing cells: focus on in vivo cell maturation and participation in acute trauma and chronic damage. Glia. 59 (12), 1958-1973 (2011).
  15. Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Dev Neurosci. 33 (3-4), 251-260 (2011).
  16. Yu, W. P., Collarini, E. J., Pringle, N. P., Richardson, W. D. Embryonic expression of myelin genes: evidence for a focal source of oligodendrocyte precursors in the ventricular zone of the neural tube. Neuron. 12 (6), 1353-1362 (1994).
  17. Armstrong, R. C., Dorn, H. H., Kufta, C. V., Friedman, E., Dubois-Dalcq, M. E. Pre-oligodendrocytes from adult human CNS. J Neurosci. 12 (4), 1538-1547 (1992).
  18. Gard, A. L., Pfeiffer, S. E. Oligodendrocyte progenitors isolated directly from developing telencephalon at a specific phenotypic stage: myelinogenic potential in a defined environment. Development. 106 (1), 119-132 (1989).
  19. Bjelke, B., Seiger, A. Morphological distribution of MBP-like immunoreactivity in the brain during development. Int J Dev Neurosci. 7 (2), 145-164 (1989).
  20. Hardy, R. J., Friedrich, V. L. Jr Progressive remodeling of the oligodendrocyte process arbor during myelinogenesis. Dev Neurosci. 18 (4), 243-254 (1996).
  21. Hartman, B. K., Agrawal, H. C., Kalmbach, S., Shearer, W. T. A comparative study of the immunohistochemical localization of basic protein to myelin and oligodendrocytes in rat and chicken brain. J Comp Neurol. 188 (2), 273-290 (1979).
  22. Wei, Q., Miskimins, W. K., Miskimins, R. Stage-specific expression of myelin basic protein in oligodendrocytes involves Nkx2.2-mediated repression that is relieved by the Sp1 transcription factor. J Biol Chem. 280 (16), 16284-16294 (2005).
  23. Stolt, C. C., et al. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes Dev. 16 (2), 165-170 (2002).
  24. Emery, B., et al. Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination. Cell. 138 (1), 172-185 (2009).
  25. Reynolds, R., Wilkin, G. P. Development of macroglial cells in rat cerebellum. II. An in situ immunohistochemical study of oligodendroglial lineage from precursor to mature myelinating cell. Development. 102 (2), 409-425 (1988).
  26. Scolding, N. J., et al. Myelin-oligodendrocyte glycoprotein (MOG) is a surface marker of oligodendrocyte maturation. J Neuroimmunol. 22 (3), 169-176 (1989).
  27. Fewster, M. E., Scheibel, A. B., Mead, J. F. The preparation of isolated glial cells from rat and bovine white matter. Brain Res. 6 (3), 401-408 (1967).
  28. Gard, A. L., Williams, W. C. 2nd, Burrell, M. R. Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta. Dev Biol. 167 (2), 596-608 (1995).
  29. Gard, A. L., Pfeiffer, S. E. Glial cell mitogens bFGF and PDGF differentially regulate development of O4+GalC- oligodendrocyte progenitors. Dev Biol. 159 (2), 618-630 (1993).
  30. Barres, B. A., Raff, M. C. Proliferation of oligodendrocyte precursor cells depends on electrical activity in axons. Nature. 361 (6409), 258-260 (1993).
  31. Behar, T., McMorris, F. A., Novotny, E. A., Barker, J. L., Dubois-Dalcq, M. Growth and differentiation properties of O-2A progenitors purified from rat cerebral hemispheres. J Neurosci Res. 21 (2-4), 168-180 (1988).
  32. Vitry, S., Avellana-Adalid, V., Lachapelle, F., Baron-Van Evercooren, A. Migration and multipotentiality of PSA-NCAM+ neural precursors transplanted in the developing brain. Mol Cell Neurosci. 17 (6), 983-1000 (2001).
  33. Duncan, I. D., Paino, C., Archer, D. R., Wood, P. M. Functional capacities of transplanted cell-sorted adult oligodendrocytes. Dev Neurosci. 14 (2), 114-122 (1992).
  34. Goldman, J. E., Geier, S. S., Hirano, M. Differentiation of astrocytes and oligodendrocytes from germinal matrix cells in primary culture. J Neurosci. 6 (1), 52-60 (1986).
  35. Althaus, H. H., Montz, H., Neuhoff, V., Schwartz, P. Isolation and cultivation of mature oligodendroglial cells. Naturwissenschaften. 71 (6), 309-315 (1984).
  36. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  37. Szuchet, S., Yim, S. H. Characterization of a subset of oligodendrocytes separated on the basis of selective adherence properties. J Neurosci Res. 11 (2), 131-144 (1984).
  38. Chew, L. J., DeBoy, C. A., Senatorov, V. V. Jr Finding degrees of separation: experimental approaches for astroglial and oligodendroglial cell isolation and genetic targeting. J Neurosci Methods. 236, 125-147 (2014).
  39. Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).
  40. Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226 (2012).
  41. Buttery, P. C., ffrench-Constant, C. Laminin-2/integrin interactions enhance myelin membrane formation by oligodendrocytes. Mol Cell Neurosci. 14 (3), 199-212 (1999).
  42. Chun, S. J., Rasband, M. N., Sidman, R. L., Habib, A. A., Vartanian, T. Integrin-linked kinase is required for laminin-2-induced oligodendrocyte cell spreading and CNS myelination. J Cell Biol. 163 (2), 397-408 (2003).
  43. Colognato, H., Ramachandrappa, S., Olsen, I. M., ffrench-Constant, C. Integrins direct Src family kinases to regulate distinct phases of oligodendrocyte development. J Cell Biol. 167 (2), 365-375 (2004).
  44. ffrench-Constant, C., Colognato, H. Integrins: versatile integrators of extracellular signals. Trends Cell Biol. 14 (12), 678-686 (2004).
  45. Oh, L. Y., Yong, V. W. Astrocytes promote process outgrowth by adult human oligodendrocytes in vitro through interaction between bFGF and astrocyte extracellular matrix. Glia. 17 (3), 237-253 (1996).
  46. Besnard, F., Perraud, F., Sensenbrenner, M., Labourdette, G. Effects of acidic and basic fibroblast growth factors on proliferation and maturation of cultured rat oligodendrocytes. Int J Dev Neurosci. 7 (4), 401-409 (1989).
  47. Armstrong, R., Friedrich, V. L., Holmes, K. V., Dubois-Dalcq, M. In vitro analysis of the oligodendrocyte lineage in mice during demyelination and remyelination. J Cell Biol. 111 (3), 1183-1195 (1990).
  48. Grinspan, J. B., Stern, J. L., Franceschini, B., Pleasure, D. Trophic effects of basic fibroblast growth factor (bFGF) on differentiated oligodendroglia: a mechanism for regeneration of the oligodendroglial lineage. J Neurosci Res. 36 (6), 672-680 (1993).
  49. Mason, J. L., Goldman, J. E. A2B5+ and O4+ Cycling progenitors in the adult forebrain white matter respond differentially to PDGF-AA, FGF-2, and IGF-1. Mol Cell Neurosci. 20 (1), 30-42 (2002).
  50. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (71), (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Oligodendrocyte IsolationImmunomagnetic SeparationO4 Positive CellsPrimary OligodendrocytesNeonatal Mouse PupsMagnetic Cell SortingCell Strainer FiltrationCentrifugation ProtocolOligodendrocyte ProliferationImmunofluorescence Staining

Related Articles