Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Определение фактора транскрипции Olig2 геномной привязки сайтов в остро очищенный PDGFRα + клеток по иммунопреципитации Chromatin Low клеточной последовательности анализа

8.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57547

⸱

16 апреля 2018 г.

 ,  ,  , 
1The Vivian L. Smith Department of Neurosurgery, Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Texas Health Science Center

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол, который предназначен для анализа генома всей привязки Олигодендроциты транскрипционного фактора 2 (Olig2) в клетки-предшественники Олигодендроциты остро очищенный мозга (OPCs), выполнив низким клеточной хроматина иммунопреципитации (чип) , подготовка Библиотека, высокопроизводительного секвенирования и bioinformatic анализ данных.

Аннотация

В клетках млекопитающих транскрипции гена регулируются определенным образом клетки типа взаимодействия транскрипционный анализ факторов с геномной ДНК. Линии специфических транскрипционных факторов считаются играть существенную роль в ячейки спецификации и дифференциация во время разработки. Чип, в сочетании с высокой пропускной способностью секвенирования ДНК (чип seq) широко используется для анализа сайтов генома общесистемной связывания транскрипционных факторов (или его связанный комплекс) в геномной ДНК. Однако большое количество клеток, необходимы для одного стандартного чип реакцию, которая делает его трудным для изучения ограниченное число изолированных клеток первичной или редкие клеточных популяций. Для того чтобы понять механизм регулирования Олигодендроциты линии конкретных транскрипции показано фактором Olig2 остро очищенный мыши OPCs, подробный метод, с помощью чип seq для выявления генома всей привязки сайтов Olig2 (или Olig2 комплекс). Во-первых, протокол объясняет, как очистить тромбоцитарный фактор роста рецепторов альфа (PDGFRα) положительных OPCs от мыши мозги. Далее Olig2 антител при посредничестве чип и строительство библиотеки выполняются. Последняя часть описывает bioinformatic программного обеспечения и процедуры, используемые для анализа Olig2 чип seq. В целом этот документ сообщает метод для анализа генома всей привязки транскрипционный анализ фактора Olig2 в мозге остро очищенный OPCs.

Введение

Это важно для изучения белков (или комплекс белков) ДНК привязок и эпигенетических меток для построения транскрипционный анализ регулирования сети, участвующие в различных биологических процессах. Частности привязки транскрипционных факторов в геномной ДНК могут играть важную роль в регуляции гена, дифференцировки клеток и тканей развития. Мощный инструмент для изучения регуляцию и эпигенетические механизмы — иммунопреципитации chromatin (обломока). Благодаря быстрому достижениями в технологии виртуализации следующего поколения чип, в сочетании с высокой пропускной способностью секвенирования ДНК (чип seq) используется для анализа привязок протеин дна и эпигеномные марок1. Однако это стандартный протокол чип seq требует около 20 миллионов клеток на реакцию, которая затрудняет применение этой методики, когда номер ячейки ограничено, как отдельные клетки первичной и редких клеточных популяций.

Олигодендроциты линии клеток, включая клетки-предшественники Олигодендроциты (OPCs) и Олигодендроциты широко распространены по всему мозгу и имеют важное значение для развития и функционирования мозга. Как тип клеток-предшественников OPCs способны самообновления и дифференциации. OPCs не только служить прародителями олигодендроциты, но также играют важную роль в распространении нейрональных сигнализации, общаясь с другими типами клеток мозга2. Предыдущие исследования показали, что развитие Олигодендроциты регулируется линии специфических транскрипционных факторов таких как Olig2 и Sox103,4. Эти факторы транскрипции были найдены для привязки к промоутер или усилитель регионах некоторых важнейших генов влиять на их выражение во время Олигодендроциты спецификации и дифференциации. Однако это сложно определить ДНК-связывающих белков (или комплекс белков) интерес к остро очищенный первичной OPCs с очень ограниченное количество клеток.

Этот протокол описывает систематически расследовать геномной ДНК immunoprecipitated по Olig2 в очищенной мыши OPCs в геном-масштабе, используя чип seq технику. OPCs от мыши мозги были остро очищенная методом immunopanning и используется в чип эксперимент без распространения в пробирке. Ограниченное количество OPCs могут быть получены путем immunopanning и является недостаточным для стандартных чип seq экспериментов. Здесь с низким клеточной чип seq протокол как низко как 20 тысяч клеток на чип реакции транскрипционных факторов описан. Вкратце сшитого клетки лизированы и sonicated sonication устройство, чтобы наклонить хроматина. Стриженый хроматина был инкубировали с Olig2 антитела, а также белка A-покрытием бусины в осадок Olig2 антитела связаны геномной ДНК. После элюции от протеина A-покрытием бусы и обратного сшивания геномной ДНК, осаждают Olig2 антитела был очищен путем экстракции фенольных хлороформ. Полученный продукт был количественно и подвергнут T-хвостов, грунтовка, отжиг шаблон коммутации и расширения, адаптеры и амплификации, выбор размера библиотеки и очистки шагов для чип seq библиотека строительства.

После выполнения виртуализации, было проанализировано качество сырья читает из образца, подготовлен с антителом фактор транскрипции Olig2 и образец элемента управления. Пар низкого качества и содержащие адаптер читать фрагменты были обрезаны. Далее, подстриженные чтений были выровняны к геноме мыши ссылку. Геномный регионов, которые были значительно обогатили для читает чип, по сравнению с пример элемента управления, были обнаружены как вершины. Значительные вершины, представляющих потенциальные сайтов связывания фактор транскрипции, были отфильтрованы и визуализированы в браузере генома.

Примечательно метод, описанный в настоящем Протоколе может широко использоваться для чип seq других факторов транскрипции с любой тип клеток ограниченного числа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Всех животных использования и экспериментальные протоколы были выполнены в соответствии с руководством для ухода и использования лабораторных животных и одобрены институциональные Комитета по биобезопасности и животного благосостояния Комитет в Техасском университете центра науки здоровья на Хьюстон.

1. Очистка PDGFRα положительные Олигодендроциты Lineage клеток мозга мыши (с изменениями от ранее описанных immunopanning протоколы5,6,7)

  1. Подготовка immunopanning пластины PDGFRα положительный клеточный отбор и 2 пластины для истощения эндотелиальных клеток и микроглии.
    Примечание: Пожалуйста, обратите внимание, что Петри, но не блюда культуры клеток работать для immunopanning эксперимента; Если очищенной ячейки будут использоваться для культивирования, immunopanning шаги должны осуществляться в кабинет биобезопасности
    1. Пальто на 10 см пластины Петри с 30 мкл крыса коза против IgG в 10 мл рН 9,5, 50 мм трис-HCl на ночь при 4 ° C. Агитируйте пластину, чтобы убедиться, что на поверхности пластин полностью и равномерно покрыты раствор для нанесения покрытия.
    2. Подготовьте раствор антител PDGFRα путем разбавления 40 мкл антител анти PDGFRα Крыса с 12 мл Дульбекко фосфат амортизированное saline (DPBS) содержащие 0,2% BSA.
    3. После 3 стирок IgG покрытием плиты с 10 мл 1 x DPBS каждый, инкубировать IgG покрытием плиты с PDGFRα раствор антител при комнатной температуре в течение 4 ч.
    4. Вымойте пластину антитела покрытием анти PDGFRα крысы 3 раза с 10 mL 1 x DPBS. Аккуратно добавить решение DPBS вдоль боковой стенке пластины и не беспокоить с покрытием поверхности.
    5. Слой 2 новых плит Петри 15 см для истощения эндотелиальных клеток и микроглии с 20 мл DPBS, содержащих 2,3 мкг/мл Banderiaea simplicifolia лектины 1 (BSL-1) за 2 ч.
    6. Мыть BSL-1 покрытием пластин 3 раза с 20 мл 1 x DPBS. Аккуратно добавить решение DPBS вдоль боковой стенке плит и не беспокоить с покрытием поверхности.
  2. Очистка PDGFRα положительные Олигодендроциты линии клетки изменяется от ранее опубликованные методы6 , 7 , 8.
    1. Вскрыть кортикального слоя ткани от 2 послеродовом день 7 (P7) мыши мозги согласно ранее опубликованные протоколы5,6.
    2. Отделить ткани для создания одной ячейки подвеска с нервной ткани диссоциации Kit (P) согласно инструкциям производителя подробные.
    3. Вкратце нарезать расчлененных кортикального слоя тканей с помощью скальпеля и подвергает их ферментативного пищеварения при 37 ° C. После переваривания вручную отделить куски с огнем полированные стекла, которую пипетки Пастера в одну ячейку подвеска.
    4. Центрифуга одноклеточных подвеска на 300 g x 10 мин при комнатной температуре и приостановить Пелле клеток с использованием 15 мл immunopanning буфера (immunopanning буфер является DPBS с 0,02% BSA и 5 мкг/мл инсулина).
    5. Инкубируйте одноклеточных подвеска с 2 мыши мозги последовательно на 2 пластины с покрытием BSL-1 15 мин при комнатной температуре с мягким перемешиванием пластины каждые 5 мин для обеспечения лучшего истощение Микроглия и эндотелиальных клеток.
    6. Аккуратно водоворот пластину для сбора не сторонник клеток в суспензии клеток и инкубировать их крыса PDGFRα антителами пластина для 45 мин при комнатной температуре.
    7. После инкубации суспензию клеток на пластину крыса PDGFRα антителами аккуратно водоворот пластину для сбора суспензии клеток и промойте пластины 8 раз с DPBS избавиться от non сторонник клеток. Аккуратно добавить промывочный раствор вдоль боковой стенке пластины и агитировать пластину несколько раз избавиться от non сторонник клеток.
    8. Отсоединить клетки из крыса PDGFRα антитела покрытием пластину, используя 4 мл клеток отряд решение лечение для 10 минут при 37 ° C. Встряхните пластину выбить адэрентных клеток.
    9. Собирать очищенный OPCs центрифугированием при 300 x g при комнатной температуре, приостановить клетки лепешка с 2 мл OPC клетки культуры среднего и подсчитать количество ячеек с помощью Трипановый синий и Горяева (500 мл клетки культуры среднего является среде DMEM/F12, содержащей 5 мл пенициллин стрептомицином решение (P/S), 5 мл N2, 10 мл B27, 5 мкг/мл инсулин, 0.1% BSA, bFGF 20 нг/мл и 10 нг/мл PDGFRα).
  3. Проверка чистоты OPCs после immunopanning.
    1. Для того, чтобы оценить обогащения OPCs после immunopanning, использовать некоторые из очищенного OPCs для извлечения РНК с guanidium тиоцианат на основе добычи согласно инструкциям производителя.
    2. Выполните qRT ПЦР с помощью флуоресцентный зеленый краситель микс Мастер для проверки для обогащения PDGFRα выражение в очищенной OPCs по сравнению с диссоциированных мозг клеток согласно ранее опубликованных материалов4.
    3. Кроме того, семян некоторых очищенный OPCs в поли-D-лизин покрытием 24 хорошо плиты на иммуноокрашивания с анти NG2 хондроитин сульфат протеогликана (NG2) антитела как ранее опубликованные материалы9.

2. низкий ячейка чипа подготовка и строительство библиотеки чип для высокопроизводительного секвенирования

  1. Olig2 подготовка Low ячейка чипа с системой коммерчески доступных sonication и коммерчески доступных низкой сотовый номер чипа комплекта (см. таблицу материалы), следуя инструкциям производителя подробные стандартные процедуры.
    1. После отсоединения от крыс анти PDGFRα антителами пластины и ячейки, считая с Трипановый синий и Горяева поставить 20000 очищенный OPCs в 1 мл OPC клеток питательной среды для каждого чипа реакции.
    2. 27 мкл 36,5% формальдегида исправить суспензию клеток для 10 мин при комнатной температуре.
      Внимание: Обратите внимание, что формальдегид должны использоваться в химической Зонта по соображениям безопасности.
    3. Остановите, ДНК белковых cross-linking с 50 мкл 2,5 М глицин для 5 мин при комнатной температуре.
      Примечание: Все действия должны осуществляться на льду или в холодной комнате 4 ° C от этой точки.
    4. Вымойте сшитого ячейки окатышей с 1 мл раствора из ледяной Хэнкс сбалансированный соли раствора (HBSS) с ингибитором протеазы коктейль и получить клетки, гранулированных, предварительно охлажденный центрифуги на 300 x g при 4 ° C.
    5. Лизировать клетки Пелле в 25 мкл полный буфер Lysis для 5 минут на льду.
      Примечание: Агитируйте трубки приостановить ячейки в буфер Lysis.
    6. Дополнить lysate с 75 мкл ледяной HBSS, содержащий ингибитор протеазы коктейль и сдвига хроматин клеток lysate, предварительно охлажденный sonication система с 5 циклов 30 s OFF программы и 30 s на ячейку. Всегда sonicate 6 трубы вместе и убедитесь, что баланс трубы содержат 100 мкл воды.
    7. После стрижки, центрифуги на 14 000 x g 10 мин 4 ° C и собирать супернатант в новой трубки после центрифугирования.
    8. Разбавляют 100 мкл стриженый хроматина с равным объемом ледяной полный чип буфера с ингибитором протеазы.
    9. Сохраните 20 мкл разбавленного стриженый хроматина как образец элемента управления ввода.
      Примечание: Образец элемента управления ввода требуется также как сравнение Olig2 immunoprecipitated образец для определения Olig2 антител immunoprecipitated ДНК.
    10. Добавить 1 мкл антител анти olig2 кролика к 180 мкл разбавленного стриженый хроматина и инкубировать реакции трубку на вращающееся колесо на 40 об/мин в течение 16 часов при 4 ° C.
      Примечание: Выполните этот шаг в холодной комнате.
    11. Для каждого чипа реакции, мыть 11 мкл магнитные белок А-покрытием бусины с 55 мкл буфера мытья бусы и поместить шарик пеллет в 11 мкл буфера мытья шарик после 2 стирок.
      Примечание: Выполните этот шаг в холодной комнате.
    12. Для каждого чипа реакции добавьте 10 мкл предварительно выстиранные белок А-покрытием бусины чип реакции трубки. Выполните этот шаг в холодной комнате.
    13. Инкубируйте чип реакции трубки на 4 ° C для еще 2 h на вращающееся колесо.
    14. Положите трубку реакции чип на магнитные стойки за 1 мин.
      Примечание: Выполните этот шаг в холодной комнате.
    15. Удалить супернатант и не выбить шарик Пелле.
    16. Помыть лепешка из бисера с 100 мкл для каждого из 4 мыть буферов соответственно по 4 мин на вращающееся колесо при 4 ° C.
    17. После смывки 200 мкл буфера Пелле шарик и инкубировать чип реакции трубки при 65 ° C для 4 h обратить вспять перекрестных ссылок белка ДНК.
    18. Кроме того 180 мкл буфера до 20 мкл пример ввода элемента управления и Инкубируйте на 65 ° C для 4 h обратить вспять перекрестных ссылок протеин дна также.
    19. Добавьте 200 мкл 25:24:1 (v/v) смесь фенол, хлороформ и изоамилового спирта к каждой пробке реакции чип.
    20. Вихрь энергично за 1 мин и центрифуги на 13 000 x g 15 мин при комнатной температуре. Верхний этап передать новой трубки.
    21. Добавить 40 мкл 3 M натрия ацетата раствор, 1000 мкл, 100% этанола и 2 мкл гликогена осадителя ковалентно связан с голубой краситель к каждой пробке реакции чип на ночь при-20 ° C.
    22. Центрифуга на 13 000 x g 20 мин при 4 ° C.
    23. Отменить супернатанта, мыть с 500 мкл холодный 70% этанола и центрифуги на 13 000 x g 20 мин при 4 ° C.
    24. Отменить супернатанта, держать воздух гранул сухого за 10 мин и растворяют гранулы с 50 мкл воды.
  2. Строительство библиотеки чип для высокопроизводительного секвенирования
    1. Чистота и сконцентрировать чип ДНК с комплектом очистки согласно инструкции производителя.
    2. Количественно чип образец Пико-зеленый согласно инструкциям производителя.
    3. Используйте чип seq комплект для T-хвостов, репликации и хвостохранилища, шаблон коммутации и расширения, адаптеры и амплификации, выбор размера библиотеки и очистки согласно инструкциям производителя.
      1. После denaturation dsDNA dephosphorylate 3' концу ssDNA, креветки щелочной фосфатазы и добавить хвост поли (T) ssDNA, трансферазы deoxynucleotidyl терминала.
      2. Отжиг ДНК поли (dA) грунт ssDNA шаблон для репликации ДНК и шаблон переключения.
      3. После переключения шаблон усиливают чип seq библиотека методом ПЦР с прямого и обратного праймерами для индексации.
      4. Выберите ПЦР усиленный чип seq библиотека с фрагментами, начиная от 250 до 500 bp парамагнитных бисером вариант 2 для двойной размер выделения.
      5. Проверьте качество выбранной библиотеки чип seq, используя microfluidic чип капиллярного электрофореза устройство.

3. анализ данных

  1. Подготовка структуры каталогов.
    1. Создайте каталог для выполнения анализа данных чип seq. Внутри только что созданный каталог, создать шесть подкаталоги со следующими именами: raw.files, fastqc.output, bowtie.output, homer.output, macs2.output, motif.analysis и докладов.
  2. Подготовка данных и контроль качества анализа необработанные данные о последовательности.
    1. Переместить в папку «raw.files» и скачать чип seq файлы данных.
    2. Проверьте имена файлов. Если последовательность была в паре конец, будет 4 файлов (два для лечения) и два для ввода данных с одинаковыми именами базы: PDGFRα_Olig2.read1.fastq, PDGFRα_Olig2.read2.fastq, PDGFRα_input.read1.fastq и PDGFRα_input.read2.fastq. Если имена не совпадают, переименуйте их, используя команду «МВ».
    3. Перейти к каталогу «fastqc.output».
    4. Получение метрик контроля качества от сырых чтений, с использованием программного обеспечения контроля качества fastq файл10. Используйте команду в Рисунке S1A для запуска процесса контроля качества отдельно для каждого файла fastq. Программное обеспечение будет отображаться несколько метрик качества управления в html-файле.
    5. Откройте html-файл контроля качества и проверки количество операций чтения, чтение длина, за качество базовой последовательности, последовательность показателей качества, последовательности GC содержание, последовательность дублирования уровней, адаптер содержание и содержание kmer.
  3. Трим конечные низкого качества чтения и адаптер содержание.
    1. Соблюдайте «за качество базовой последовательности» и «Адаптер содержание» участков. Определите длину обрезки для головы и хвоста каждого чтения. Надлежащей длины для обрезки, где базовый качество падает ниже 30, и есть свидетельства адаптер содержание.
    2. Перейти к каталогу «raw.files».
    3. Скачать и установить программное обеспечение для обрезки читает11. Используйте команду в Рисунке S1B для обрезки как лечения, так и вход отдельно. Параметр «Урожай» длина оставшихся чтения после усечения баз из конца и «HEADCROP» указывает количество баз устраняются от начала читать.
    4. Обрезки команда также включает в себя минимум, читать длина принимаются после фильтрации в параметре «MINLEN». Если чтение, по крайней мере 50 bp, bp использования 35 как прочитано длина порог.
    5. Перейти к каталогу «fastqc.output».
    6. Выполните анализ контроля качества файл fastq после обрезки читает. Убедитесь, что вопросы контроля качества были решены. Используйте команду в Рисунке S1C для получения контроля качества метрик.
  4. Выровняйте одно конец или конец парных чип seq читает генома мыши ссылку.
    1. Перейти к каталогу «bowtie.output» для сопоставления.
    2. Скачайте GENCODE мм10 мыши ссылку генома. Переименуйте ссылку генома мыши мм10 как «mm10.fa».
    3. Скачать читать картографа12 и установить его в системе.
    4. Создание индексного файла генома скачать ссылка, с помощью команды в Рисунке S2A. Автоматически создаются шесть файлов: mm10.1.bt2, mm10.2.bt2, mm10.3.bt2, mm10.4.bt2, mm10.rev.1.bt2 и mm10.rev.2.bt2.
    5. Используйте команду в Рисунке S2B выполнить выравнивание и отрегулируйте параметр «-p» на количество ядер согласно параметрам системы. Если работает в паре-режим, параметры «-1» и «-2» укажите имена файлов отделаны fastq.
      Примечание: Сопоставление выполняется отдельно для образцов лечения и ввода и вывода файлов метрики журнала создаются для каждого образца.
    6. Скачать программное обеспечение для работы с файлами в формате Сэм13 и установить его в системе. Преобразуйте соответствие файла SAM в БАМЕ файл, используя команду в Рисунке S2C.
  5. Получение метрик качества сопоставленных гласит до пика, призывающие оба парных конец лечения и контроля образцов.
    1. Одним из наиболее важных показателей контроля качества адрес является глубина последовательности. Открыть файлы «log.bowtie.PDGFRα_Olig2.txt» и «log.bowtie.PDGFRα_input.txt» в каталоге bowtie.output и убедитесь, что количество однозначно сопоставленных чтения пар в каждом образце превышает 10 миллионов.
    2. Перейти к каталогу «homer.output».
    3. Скачать программное обеспечение для обнаружения мотив и секвенирование нового поколения анализ14 и установить его в системе.
    4. Создайте каталог с именем «tagDir».
    5. Чтобы проверить тег clonality, используйте команду, показано на Рисунке S3A. Команда «makeTagDirectory» будет генерировать четыре контроля качества вывода files:tagAutocorrelation.txt, tagCountDistribution.txt, tagInfo.txt и tagLengthDistribution.txt.
    6. Перейти к каталогу «tagDir».
    7. Скопируйте файл «tagCountDistribution.txt» в папку «Отчеты».
    8. Переместить в папку «Отчеты».
    9. Откройте файл tagCountDistribution.txt с помощью программы электронных таблиц и создайте панель участок количество тегов в геномной позиции. Сохраните файл гистограммы с именем «tag.clonality.xlsx».
    10. Установите Р программирования языка15 в системе.
    11. В терминале введите «R» и нажмите клавишу ENTER для доступа к среде программирования R.
    12. Загрузите пакет R для обработки данных чип seq16 и установить его с помощью команды, изображенные в Рисунке S3B.
    13. Используйте сценарий R в Рисунке S3C печать стренги кросс корреляции.
  6. Обнаружение с помощью картографа пик вершины.
    1. Перейти к каталогу «macs2.output». Скачать и установить картографа пик17 в вашей системе.
    2. Используйте функцию «callpeak» с лечения и контроля BAM файлы, созданные на шаге 3.4.6.
      Примечание: Другие параметры включают «-f» для формата входного файла,»-g» для размера генома,»-имя» для указания базовое имя всех выходных файлов, и «-B» для хранения pileup фрагмента в формате bedgraph. Полный пик, вызов команды включен в Рисунке S4A. Используйте BEDPE для парных конец образцов.
    3. Убедитесь, что пик картографа создано шесть файлов: PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.narrowPeak, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_summits.bed, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_model.r, PDGFRα_Olig2_vs_ PDGFRα_input_control_lambda.bdg и PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_treat_pileup.bdg.
    4. Открыть файл PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls для просмотра называется пики, местоположение, длина, саммите позиция, pileup ' а и пик обогащения метрики:-log10(pvalue), сложите обогащения и - log10(q-value).
  7. Фильтр и аннотировать называется пиков.
    1. Используя этот файл открыт на предыдущем шаге, фильтр в результате пики согласно раза обогащения, значение p или q значение. Принять адекватные фильтрации порогов, сделайте сюжет гистограммы для определения плотности каждой метрики. Отфильтровать значения ниже выбранного порога для получения значительных вершин.
    2. Скачать черный мм10 (регионы известны своими искусственно завышенных сигнала) и отфильтровать чип seq пики, которые находятся внутри любой из этих областей артефакт.
    3. Создайте файл кровати с отфильтрованной пиков, содержащих следующие столбцы: хромосомы, начало, конец, peakID, макет и Стрэнд. Заполните столбец макет с точкой «.» так как он не используется. В столбце Стрэнд, задать все значения как «+». Сохраните файл кровати как «filtered.peakData2.bed».
    4. Скопируйте файл «filtered.peakData2.bed» в папку «Отчеты».
    5. Переместить в папку «Отчеты».
    6. Для аннотирования отфильтрованных пиков в область конкретных генов, используйте функцию «annotatePeaks» с кровати файл, созданный на предыдущем шаге. Команда, используемая показан на Рисунке S5A.
    7. Откройте файл «filtered.annotatedPeaks.txt», с помощью статистического программного обеспечения.
    8. Фильтровать результирующий пиков, лежа в intergenic регионе на расстояние более 5 КБ от аннотированный ТП. Используйте столбец «Расстояние до TSS» в файле как расстояние для фильтрации. Сохранять отфильтрованные пиков в файле excel, названный «5kbup.geneBody.peakData.txt».
    9. Магазина в результате фильтрации пиков в файле bedGraph с колоннами: хромосомы, начало, конец и - log10(q-value). Имя файла «5kbup.geneBody.peakData.bedGraph».
  8. Создавать файлы воротила для визуализации браузера.
    1. Скачать и установить программное обеспечение для генома арифметические18.
    2. Скачать инструмент для преобразования bedgraph воротила и установить в системе. Скачайте файл «mm10.chrom.sizes».
    3. Используйте команду в Рисунке S6A для создания файла воротила.
    4. Скачать и установить генома браузер19 в системе.
    5. Откройте генома браузер и загрузите файл «5kbup.geneBody.peakData.bigwig» для визуализации отфильтрованных значительные вершины и их расположения относительно известных генов.
  9. Поиск мотива.
    1. Перейти к каталогу «motif.analysis».
    2. Скачать de novo мотив сканирование и мотив программы обогащения и установить его в вашей системе20.
    3. Скачайте мотив всеобъемлющей базы данных, которая включает мотивы Olig2.
    4. Получите genomic последовательностей 500 bp регионах сосредоточены на существенные пиковых саммитах. Храните последовательности как peak.sequences.txt. Используйте команду в Рисунке S7 для поиска Olig2 мотивы в рамках каждой из 500 bp пик регионов.
    5. Фильтровать результирующий мотивы, с использованием надлежащих E-значение (по умолчанию = 0,05).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Низкий клеточной чип seq была выполнена и bioinformatic анализы были сделаны для расследования потенциальное взаимодействие фактора transcriptional Olig2 с геномной ДНК в остро очищенный мозга OPCs. Рисунок 1 показывает общий рабочий процесс как экспериментальные, так и процедур анализа данных. В настоящем Протоколе послеродовой мышей мозг были отделены в одну ячейку подвеска. После диссоциации ткани immunopanning была выполнена для того чтобы очистить OPCs с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

У млекопитающих генных сетей регулирования являются весьма сложными. Чип seq является мощный метод для изучения генома общесистемной протеин дна взаимодействий. Этот протокол включает в себя как выполнять Olig2 чип seq, используя небольшое количество очищенной OPCs от мыши мозги (как низко как 20 тысяч клеток на реакции). Первый ключевой шаг для этого протокола является очистка OPCs от мыши мозги, immunopanning с PDGFRα антител. Для позитивного выбора OPCs с PDGFRα покрытием пластин OPCs часто слабо привязку к PDGFRα пок...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

JQW, XD, RCDD и YY были поддержаны грантов от национальных институтов здоровья R01 NS088353; 1R21AR071583 гранта NIH-01; Staman Огилви фонда Мемориальный фонд Hermann; Инициатива UTHealth мозга и CTSA УЛ1 TR000371; и Грант от университета Техаса системы неврологии и нейротехнология научно-исследовательского института (Грант #362469).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Reagent/Equipment
Banderiaea simplicifolia lectin 1Vector Laboratories# L-1100
Антитело крысы против PDGFRaBD Bioscience# 558774
Набор для диссоциации нервной ткани (P)MACS Miltenyi Biotec# 130-092-628
ТехнологииAccutase STEMCELL# 07920
TRIzolThermo Fisher# 15596026
Анти-NG2 Хондроитин сульфат Протеогликан антителоMillipore# AB5320
Bioruptor Pico sonication deviceDiagenode# B01060001
набор True MicroChIPDiagenode# C01010130
Фенол:Хлороформ:Изоамиловый спирт (25:24:1, v/v)Thermo Fisher# 15593031
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up KitMACHEREY-NAGEL# 740609
Quant-iT PicoGreen dsDNA Anasay KitThermo Fisher# P11496
DNA SMART ChIP-Seq kitClontech Laboratories# 634865
Agencourt AMPure XPBeckman Voulter# A63880
GlycoBlueThermo Fisher# AM9516
пико-зеленыйThermo Fisher# P11496
D-PBSThermo Fisher# 14190-144
SYBR зеленый мастер-миксBio-Rad Laboratories# 1725124
DMEM/F12Fisher Scientific# 11-320-033
Пенициллин-стрептомицин (P/S)Fisher Scientific# 15140122
N-2 ДобавкаFisher Scientific# 17502048
B-27 ДобавкаFisher Scientific# 17504044
инсулинSigma# I6634Приготовьте 0,5 мг/мл раствора инсулина, растворив 5 мг инсулина в 10 мл воды и 50 мкм; l из 1 N HCl.
Бычий сывороточный альбумин, подходящий для клеточной культуры (BSA)Sigma# A4161Приготовьте 4% раствор BSA, растворив 4 г BSA в 100 мл D-PBS, и отрегулируйте pH до 7,4
Фактор роста фибробластов Основной белок, человеческий рекомбинантный (bFGF)EMD Millipore# GF003
HUMAN PDGF-AAVWR#102061-188
ПОЛИ-D-лизинVWR# IC15017510Приготовьте 1 мг/мл раствора поли-D-лизина, растворив 10 мг поли-D-лизина в 10 мл воды и разбавьте в 100 раз при использовании.
Одноразовые чашки Петри Falcon, стерильные, Corning, 100x15 ммVWR# 25373-100
Одноразовые чашки Петри Falcon, стерильные, Corning, 150x15 ммVWR# 25373-187
HBSS, 10X, без кальция, без магния, без фенола RedFisher Scientific# 14185-052
Trypan BlueStemcell Technologies# 07050
коктейль ингибиторов протеазыSigma# 11697498001
Software
FastQC[10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/Получение метрик контроля качества необработанных и обрезанных прочтений
Trimmomatic 0.33[11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomaticОбрезка и фильтрация необработанных прочтений
GENCODE mm10ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gzРеференсный геном мыши
Bowtie2 2.2.4[12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtmlВыравнивание прочтений с референсным геномом
SAMTools 1.5[13] http://samtools.sourceforge.net/Конвертация файла SAM в формат BAM
HOMER 4.9.1[14] http://homer.ucsd.edu/homer/Создание каталога тегов и аннотирование обогащенных геномных областей с помощью символов генов
R 3.2.2[15] https://www.R-project.org/Программирование скриптов и выполнение функций
SPP 1.13[16] https://github.com/hms-dbmi/sppСоздание графика перекрестной корреляции нитей
MACS2 2.2.4[17] https://github.com/taoliu/MACSНахождение областей обогащения ChIP над контрольным
BEDTools 2.25[18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/Арифметика генома
bedGraphToBigWighttp://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/Конвертация файла bedGraph в
браузер bigwig IGV 2.3.58[19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/Визуализация и просмотр значительный ChIP-seq пики
ExcelSpreasheet программа
ENCODE черный списокhttps://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklistsФильтрация пиков
mm10.chrom.sizeshttp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes.Преобразование файла bedGraph в
базу данных мотивов bigwig ENCODE[25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/Требуется комплексная база данных мотивов для обогащения мотивов
MEME-ChIP[20] http://meme-suite.org/index.htmlАнализ обогащения мотивов и обнаружение мотивов
Primer names used for qPCRPrimer последовательности, используемые для qPCR
Mbp-F:CTATAAATCGGCTCACAAGG
Mbp-R:AGGCGGTTATATTAAGAAGC
Iba1-F:ACTGCCAGCCTAAGACAACC
Iba1-R:GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC
Mog-F:GGCTTTGGAGGAAGGGAC
Mog-R:TGAATTGTGTCCTGCATAGCTGC
GAPDH-FATGACATCAAGAAGGTGGTG
GAPDH-RCATACCAGGAAATGAGCTTG
Tuj1-FTTTTCGTCTCTAGCCGCGTG
Tuj1-RGATGACCTCCCAGAACTTGGC
PDGFRα-FAGAGTTACACGTTTGAGCTC
PDGFRα-RGTCCCTCCACGGTACTCCT
Microsoft

Ссылки

  1. Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS Genet. 8 (3), e1002565(2012).
  2. Zuchero, J. B., Barres, B. A. Intrinsic and extrinsic control of oligodendrocyte development. Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 914-920 (2013).
  3. Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Dev Biol. 302 (2), 683-693 (2007).
  4. Dong, X., et al. Comprehensive Identification of Long Non-coding RNAs in Purified Cell Types from the Brain Reveals Functional LncRNA in OPC Fate Determination. PLoS Genet. 11 (12), e1005669(2015).
  5. Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures. J Vis Exp. (10), e562(2007).
  6. Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).
  7. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
  8. Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  9. Cheng, X., et al. Bone morphogenetic protein signaling and olig1/2 interact to regulate the differentiation and maturation of adult oligodendrocyte precursor cells. Stem Cells. 25 (12), 3204-3214 (2007).
  10. Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequencing data. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2018).
  11. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  12. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  13. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  14. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  15. Team, R. C. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2015).
  16. Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nat Biotechnol. 26 (12), 1351-1359 (2008).
  17. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137(2008).
  18. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  19. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
  20. Bailey, T. L., et al. MEME SUITE: tools for motif discovery and searching. Nucleic Acids Res. 37 (Web Server issue), W202-W208 (2009).
  21. Sims, D., Sudbery, I., Ilott, N. E., Heger, A., Ponting, C. P. Sequencing depth and coverage: key considerations in genomic analyses. Nat Rev Genet. 15 (2), 121-132 (2014).
  22. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  23. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  24. Mazzoni, E. O., et al. Embryonic stem cell-based mapping of developmental transcriptional programs. Nat Methods. 8 (12), 1056-1058 (2011).
  25. Kheradpour, P., Kellis, M. Systematic discovery and characterization of regulatory motifs in ENCODE TF binding experiments. Nucleic Acids Res. 42 (5), 2976-2987 (2014).
  26. Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. J Neurosci. 26 (43), 10967-10983 (2006).
  27. Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645(2012).
  28. Raskatov, J. A., et al. Modulation of NF-kappaB-dependent gene transcription using programmable DNA minor groove binders. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1023-1028 (2012).
  29. Cheneby, J., Gheorghe, M., Artufel, M., Mathelier, A., Ballester, B. ReMap 2018: an updated atlas of regulatory regions from an integrative analysis of DNA-binding ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2017).
  30. Yevshin, I., Sharipov, R., Valeev, T., Kel, A., Kolpakov, F. GTRD: a database of transcription factor binding sites identified by ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D61-D67 (2017).
  31. Kulakovskiy, I. V., et al. HOCOMOCO: a comprehensive collection of human transcription factor binding sites models. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D195-D202 (2013).
  32. Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 43 (14), 6959-6968 (2015).
  33. Gerstein, M. B., et al. Architecture of the human regulatory network derived from ENCODE data. Nature. 489 (7414), 91-100 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

ChIP-seq для Olig2PDGFR-альфа-положительные клеткиклетки-предшественники олигодендроцитовпроцедура иммунопаннингарасщепление хроматинабиоинформатический анализсайты связывания в масштабе всего геномаанализ транскрипционных факторовочистка первичных клеток
Определение фактора транскрипции Olig2 геномной привязки сайтов в остро очищенный PDGFRα + клеток по иммунопреципитации Chromatin Low клеточной последовательности анализа
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.