Здесь мы представляем протокол, который предназначен для анализа генома всей привязки Олигодендроциты транскрипционного фактора 2 (Olig2) в клетки-предшественники Олигодендроциты остро очищенный мозга (OPCs), выполнив низким клеточной хроматина иммунопреципитации (чип) , подготовка Библиотека, высокопроизводительного секвенирования и bioinformatic анализ данных.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Определение фактора транскрипции Olig2 геномной привязки сайтов в остро очищенный PDGFRα + клеток по иммунопреципитации Chromatin Low клеточной последовательности анализа
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В клетках млекопитающих транскрипции гена регулируются определенным образом клетки типа взаимодействия транскрипционный анализ факторов с геномной ДНК. Линии специфических транскрипционных факторов считаются играть существенную роль в ячейки спецификации и дифференциация во время разработки. Чип, в сочетании с высокой пропускной способностью секвенирования ДНК (чип seq) широко используется для анализа сайтов генома общесистемной связывания транскрипционных факторов (или его связанный комплекс) в геномной ДНК. Однако большое количество клеток, необходимы для одного стандартного чип реакцию, которая делает его трудным для изучения ограниченное число изолированных клеток первичной или редкие клеточных популяций. Для того чтобы понять механизм регулирования Олигодендроциты линии конкретных транскрипции показано фактором Olig2 остро очищенный мыши OPCs, подробный метод, с помощью чип seq для выявления генома всей привязки сайтов Olig2 (или Olig2 комплекс). Во-первых, протокол объясняет, как очистить тромбоцитарный фактор роста рецепторов альфа (PDGFRα) положительных OPCs от мыши мозги. Далее Olig2 антител при посредничестве чип и строительство библиотеки выполняются. Последняя часть описывает bioinformatic программного обеспечения и процедуры, используемые для анализа Olig2 чип seq. В целом этот документ сообщает метод для анализа генома всей привязки транскрипционный анализ фактора Olig2 в мозге остро очищенный OPCs.
Введение
Это важно для изучения белков (или комплекс белков) ДНК привязок и эпигенетических меток для построения транскрипционный анализ регулирования сети, участвующие в различных биологических процессах. Частности привязки транскрипционных факторов в геномной ДНК могут играть важную роль в регуляции гена, дифференцировки клеток и тканей развития. Мощный инструмент для изучения регуляцию и эпигенетические механизмы — иммунопреципитации chromatin (обломока). Благодаря быстрому достижениями в технологии виртуализации следующего поколения чип, в сочетании с высокой пропускной способностью секвенирования ДНК (чип seq) используется для анализа привязок протеин дна и эпигеномные ма....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Всех животных использования и экспериментальные протоколы были выполнены в соответствии с руководством для ухода и использования лабораторных животных и одобрены институциональные Комитета по биобезопасности и животного благосостояния Комитет в Техасском университете центра науки здоровья на Хьюстон.
1. Очистка PDGFRα положительные Олигодендроциты Lineage клеток мозга мыши (с изменениями от ранее описанных immunopanning протоколы5,6,7)
- Подготовка immunopanning пластины PDGFRα положительный клеточный отбор и 2 пластины для истощен....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Низкий клеточной чип seq была выполнена и bioinformatic анализы были сделаны для расследования потенциальное взаимодействие фактора transcriptional Olig2 с геномной ДНК в остро очищенный мозга OPCs. Рисунок 1 показывает общий рабочий процесс как экспериментальные, так и процедур анализа данных. В настоящем Протоколе послеродовой мышей мозг были отделены в одну ячейку подвеска. После диссоциации ткани immunopanning была выполнена для того чтобы очистить OPCs с.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
У млекопитающих генных сетей регулирования являются весьма сложными. Чип seq является мощный метод для изучения генома общесистемной протеин дна взаимодействий. Этот протокол включает в себя как выполнять Olig2 чип seq, используя небольшое количество очищенной OPCs от мыши мозги (как низко как 20 тысяч клеток на реакции). Первый ключевой шаг для этого протокола является очистка OPCs от мыши мозги, immunopanning с PDGFRα антител. Для позитивного выбора OPCs с PDGFRα покрытием пластин OPCs часто слабо привязку к PDGFRα пок.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Благодарности
JQW, XD, RCDD и YY были поддержаны грантов от национальных институтов здоровья R01 NS088353; 1R21AR071583 гранта NIH-01; Staman Огилви фонда Мемориальный фонд Hermann; Инициатива UTHealth мозга и CTSA УЛ1 TR000371; и Грант от университета Техаса системы неврологии и нейротехнология научно-исследовательского института (Грант #362469).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Reagent/Equipment | |||
| Banderiaea simplicifolia lectin 1 | Vector Laboratories | # L-1100 | |
| Антитело крысы против PDGFRa | BD Bioscience | # 558774 | |
| Набор для диссоциации нервной ткани (P) | MACS Miltenyi Biotec | # 130-092-628 | |
| Технологии | Accutase STEMCELL# 07920 | ||
| TRIzol | Thermo Fisher | # 15596026 | |
| Анти-NG2 Хондроитин сульфат Протеогликан антитело | Millipore | # AB5320 | |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | # B01060001 | |
| набор True MicroChIP | Diagenode | # C01010130 | |
| Фенол:Хлороформ:Изоамиловый спирт (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | # 15593031 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | MACHEREY-NAGEL | # 740609 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Anasay Kit | Thermo Fisher | # P11496 | |
| DNA SMART ChIP-Seq kit | Clontech Laboratories | # 634865 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Voulter | # A63880 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | # AM9516 | |
| пико-зеленый | Thermo Fisher | # P11496 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | # 14190-144 | |
| SYBR зеленый мастер-микс | Bio-Rad Laboratories | # 1725124 | |
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | # 11-320-033 | |
| Пенициллин-стрептомицин (P/S) | Fisher Scientific | # 15140122 | |
| N-2 Добавка | Fisher Scientific | # 17502048 | |
| B-27 Добавка | Fisher Scientific | # 17504044 | |
| инсулин | Sigma | # I6634 | Приготовьте 0,5 мг/мл раствора инсулина, растворив 5 мг инсулина в 10 мл воды и 50 мкм; l из 1 N HCl. |
| Бычий сывороточный альбумин, подходящий для клеточной культуры (BSA) | Sigma | # A4161 | Приготовьте 4% раствор BSA, растворив 4 г BSA в 100 мл D-PBS, и отрегулируйте pH до 7,4 |
| Фактор роста фибробластов Основной белок, человеческий рекомбинантный (bFGF) | EMD Millipore | # GF003 | |
| HUMAN PDGF-AA | VWR# | 102061-188 | |
| ПОЛИ-D-лизин | VWR | # IC15017510 | Приготовьте 1 мг/мл раствора поли-D-лизина, растворив 10 мг поли-D-лизина в 10 мл воды и разбавьте в 100 раз при использовании. |
| Одноразовые чашки Петри Falcon, стерильные, Corning, 100x15 мм | VWR | # 25373-100 | |
| Одноразовые чашки Петри Falcon, стерильные, Corning, 150x15 мм | VWR | # 25373-187 | |
| HBSS, 10X, без кальция, без магния, без фенола Red | Fisher Scientific | # 14185-052 | |
| Trypan Blue | Stemcell Technologies | # 07050 | |
| коктейль ингибиторов протеазы | Sigma | # 11697498001 | |
| Software | |||
| FastQC | [10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | Получение метрик контроля качества необработанных и обрезанных прочтений | |
| Trimmomatic 0.33 | [11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | Обрезка и фильтрация необработанных прочтений | |
| GENCODE mm10 | ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gz | Референсный геном мыши | |
| Bowtie2 2.2.4 | [12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | Выравнивание прочтений с референсным геномом | |
| SAMTools 1.5 | [13] http://samtools.sourceforge.net/ | Конвертация файла SAM в формат BAM | |
| HOMER 4.9.1 | [14] http://homer.ucsd.edu/homer/ | Создание каталога тегов и аннотирование обогащенных геномных областей с помощью символов генов | |
| R 3.2.2 | [15] https://www.R-project.org/ | Программирование скриптов и выполнение функций | |
| SPP 1.13 | [16] https://github.com/hms-dbmi/spp | Создание графика перекрестной корреляции нитей | |
| MACS2 2.2.4 | [17] https://github.com/taoliu/MACS | Нахождение областей обогащения ChIP над контрольным | |
| BEDTools 2.25 | [18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Арифметика генома | |
| bedGraphToBigWig | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/ | Конвертация файла bedGraph в | |
| браузер bigwig IGV 2.3.58 | [19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | Визуализация и просмотр значительный ChIP-seq пики | |
| Excel | Spreasheet программа | ||
| ENCODE черный список | https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists | Фильтрация пиков | |
| mm10.chrom.sizes | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes. | Преобразование файла bedGraph в | |
| базу данных мотивов bigwig ENCODE | [25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/ | Требуется комплексная база данных мотивов для обогащения мотивов | |
| MEME-ChIP | [20] http://meme-suite.org/index.html | Анализ обогащения мотивов и обнаружение мотивов | |
| Primer names used for qPCR | Primer последовательности, используемые для qPCR | ||
| Mbp-F: | CTATAAATCGGCTCACAAGG | ||
| Mbp-R: | AGGCGGTTATATTAAGAAGC | ||
| Iba1-F: | ACTGCCAGCCTAAGACAACC | ||
| Iba1-R: | GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC | ||
| Mog-F: | GGCTTTGGAGGAAGGGAC | ||
| Mog-R: | TGAATTGTGTCCTGCATAGCTGC | ||
| GAPDH-F | ATGACATCAAGAAGGTGGTG | ||
| GAPDH-R | CATACCAGGAAATGAGCTTG | ||
| Tuj1-F | TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG | ||
| Tuj1-R | GATGACCTCCCAGAACTTGGC | ||
| PDGFRα-F | AGAGTTACACGTTTGAGCTC | ||
| PDGFRα-R | GTCCCTCCACGGTACTCCT |
Ссылки
- Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS Genet. 8 (3), e1002565(2012).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Intrinsi....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
