Электрохимические обнаружения от дейтерия кинетическая изотопный эффект на внеклеточные переноса электронов в Shewanella oneidensis MR-1

Электрохимические методы непосредственно характеризуют редокс белка в нетронутыми бактериальной клетке недавно появились после обнаружения металла сокращение микробных штаммов, например S. oneidensis MR-1 или Geobacter sulfurreducens СПС, которые имеют внешняя мембрана тип c тситохрома комплексы (ом c-Cyts) подвергается ячейку внешней^1,2,3,4,5. ОМ c- Cyts посредником переноса электронов от дыхательной цепи для твердых субстратов внеклеточно расположенных. Этот транспорт называется внеклеточного переноса электронов (EET)^1,6 и представляет собой критический процесс для новых биотехнологий, в частности микробные топливные элементы⁶. Таким образом чтобы понять основной EET кинетики и механизмов и ее связь с микробной физиологии, ом c -Cyts были исследованы с помощью поклеточного электрохимии^4,7, в сочетании с микроскопией ^{8 , 9},^10,спектроскопии¹¹и молекулярной биологии^2,4. Напротив методы для изучения последствий EET-связаны катионов транспорта, например, протонов, на кинетику EET в живых клетках едва созданы, несмотря на протонного транспорта через бактериальной мембраны, что решающую роль сигнализации, гомеостаза и энергии производство^12,,1314. В настоящем исследовании, мы опишем технику для изучения воздействия протонного транспорта на кинетику EET в ячейке S. oneidensis MR-1 с помощью поклеточного электрохимических измерений, которая требует идентификации тариф ограничивая шаг в микробные текущего производства¹⁵.

Прямой способ оценить вклад протонного транспорта на связанные EET является эффект кинетическая изотопа дейтерия (ки). КИЕ наблюдается как изменения в кинетика электронов передачи после замена протонов с ионы дейтерия, который представляет воздействия транспорта протон электрон передачи кинетики¹⁶. Теория KIE, сама была создана хорошо с использованием электрохимических измерений с очищенной ферментов¹⁷. Однако, поскольку текущее производство в S. oneidensis MR-1 результаты из нескольких, разнообразных и меняющихся процессы¹⁸, один не может идентифицировать просто EET как процесс ограничения скорости. Соблюдать KIE на Протон транспортных процессов в сочетании с EET, мы должны подтвердить, что микробные текущего производства ограничивается переноса электронов через ом c- Cyts к электроду. Для этой цели мы заменили супернатанта решение с свежей средой, с высокой концентрацией лактата как донора электрона на оптимальный рН и температурные условия перед KIE измерения; Эта замена служил две роли: (1) повысить уровень вверх метаболических процессов, по сравнению с EET и (2) опущены плавательный клетки в надосадке освобожден от биопленки монослоя S. oneidensis MR-1 на рабочих электродом ( Индия легированный оловом оксид (ITO) электрод). Представлен подробный протокол призван помочь новичкам сохранить и подтвердить, что процесс EET курс определение шаг.

1. формирование монослоя биопленки S. oneidensis MR-1 на Ито электрода (рис. 1)

Примечание: Для предотвращения загрязнения электрохимических реактора с другими микробами, все средства массовой информации, внедряет и компонентов электрохимических реактора должны быть простерилизованы заранее. Когда с использованием клеток S. oneidensis MR-1 и строительства электрохимического реакторов, все процедуры должны проводиться на лавочке чистой.

1. Культивирование клеток S. oneidensis MR-1
   Примечание: Однослойная биопленки S. oneidensis MR-1 был сформирован на Ито электрода условий сообщалось ранее⁴.
   1. Рост клеток S. oneidensis MR-1, добавьте один колонии S. oneidensis MR-1 выросла на плите агар составе Бертани Лурия (LB) (20 г/Л) и bacto агар (15 г/Л) в 15 мл среды фунтов (20 г/Л) на 30 ° C в течение 24 ч в аэробных условиях встряхивании в 160 об/мин.
   2. Центрифуга суспензию клеток на 6000 × g за 10 мин и Ресуспензируйте Пелле результирующая ячейка в 15 мл определенной среды (pH 7,8) (DM: NaHCO₃ [2,5 г/Л], CaCl₂·2H₂O [0,08 г/Л], NH₄Cl [1,0 г/Л], MgCl₂· 6 H₂O [0,2 г/Л], [10 г/Л], NaCl и 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic кислоты [HEPES; 7,2 г/Л]), с 10 мм молочной кислоты и 0,5 г/Л дрожжевой экстракт как источник углерода и микроэлементов для S. oneidensis MR-1 , соответственно.
   3. Далее культивировать суспензию клеток высокоусвояемого при 30 ° C в течение 12 ч при встряхивании в 160 об/мин и центрифуги снова на 6000 × g для 10 минут вымыть результирующая ячейка Пелле дважды с DM среднего центрифугированием 10 мин на 6000 × g перед электрохимические эксперимент.
2. Строительство 3 электрод электрохимических реактора (рис. 1)
   1. Ставлю ITO подложке рабочих электродом в нижней части реактора.
   2. Впоследствии вставьте стеклянный цилиндр (диаметром 2 см) и крышкой из политетрафторэтилена (ПТФЭ). Затем вставьте Ag/AgCl (KCl насыщенных) и провод платины реактора как ссылка и Счетчик электродов, соответственно.
      Примечание: Для предотвращения утечки воздуха и решения, вставьте лист бутилкаучука между каждого компонента.
   3. Добавление 4.0 мл дм, дополненные лактат 10 мм и 0,5 г/Л дрожжевой экстракт в электрохимических реактора.
   4. После подтверждения, что нет никакой утечки из электрохимических реактора, поток газ азот в электрохимических реактора более 20 мин для поддержания анаэробных условий внутри электрохимических реактора.
      Примечание: Для предотвращения загрязнения с другими микробами, газ должны быть отфильтрованы прежде, чем она впадает в электрохимических реактора.
   5. Подключите электрохимических реактора к потенцио и применять 0,4 V (по сравнению с стандартным водорода электрода, она) к электроду Ито, сохраняя температуру электрохимических реактора при 30 ° C, с помощью системы циркуляции воды внешнего.
      Примечание: Чтобы предотвратить эффект внешнего электрического поля, электрохимических реактора должны помещаться в клетку Фарадея.
3. Электрохимические культивирования клеток S. oneidensis MR-1 (рис. 1 и рис. 2)
   1. Отрегулируйте плотность ячеек подвески, полученные на этапе 1.1 оптической плотности 1.43 600 Нм (₆₀₀OD) с DM, дополнен 10 мм молочной кислоты и 0,5 г/Л дрожжей экстракт.
      Примечание: Чтобы получить правильный ОД₆₀₀, примените суспензию клеток ОД₆₀₀ ≤ 0,8 UV-vis-спектрометр до корректировки ОД₆₀₀ до 1,43.
   2. Добавление 0,3 мл суспензии клеток в электрохимический реактор через порт впрыска, с помощью шприца: OD₆₀₀ в реакторе изменяется до 0,1.
      Примечание: Добавление 0,3 мл суспензии клеток с ОД₆₀₀ = 1.43 в электрохимических реактора, содержащие 4.0 мл средние результаты в 4.3 мл раствора с ОД₆₀₀ = 0.1. При использовании других реакторов с различными объемами, расчет плотности ячейки не требуется.
   3. Продолжить потенциальное применение на 0,4 V (или она) Ито электрод для 25 ч.
      Примечание: Для образования монослоя биопленки на Ито электрода, убедитесь, что произведенные ток exhibits отклонение меньше, чем 50% из рисунка 2.

2. Замена супернатант со свежими DM средний с лактат 10 мм (рис. 3)

1. Остановить потенциальное применение и отсоедините электрохимический реактор от потенцио и системы циркуляции воды.
2. Замена супернатант со свежими DM средний с 10 мм лактата
   1. Поток газа азота в бутылку, содержащие DM с 10 мм лактата более 20 мин для удаления кислорода из среды.
   2. Медленно извлеките все супернатант внутри электрохимических реактора с помощью шприца, под проточной газ азот (Рисунок 3А, b).
      Примечание: Чтобы избежать нарушения биопленки на электроде Ито азот газ, газ должна течь над поверхностью жидкости.
   3. Добавление 4.0 мл свежего дм, содержащие 10 мм лактат, с помощью шприца (рис. 3 c).
      Примечание: Чтобы избежать нарушения биопленки на электроде Ито, медленно вводить среднего вдоль стены электрохимических реактора. Чтобы сохранить влажные биопленки, носитель следует добавить сразу же после удаления супернатант. Инъекции средних по 1 мин после удаления супернатант не влияет на текущее производство от биопленки S. oneidensis MR-1.
   4. Наклонной электрохимических реактора для удаления всех супернатант прикреплена к стене электрохимических реактора.
   5. Повторите шаги 2.2.2-2.2.4 три раза в общей сложности.
3. Остановить поток газа и подключить электрохимических реактора к потенцио снова, применяя 0,4 V (или она) к электроду Ито в 303 K.

3. добавление воды дейтерия для измерения KIE на процесс EET (рис. 4)

1. Убедитесь, что текущее производство от биопленки монослоя S. oneidensis MR-1 является стабильным и не быстро увеличиваться. Если ток резко увеличивается, подождите, пока тока стабилизируется в течение 5% увеличение свыше 10 мин.
   Примечание: Формирование монослоя биопленки на Ито электрода без загрязнения других микробных штаммов был подтвержден рДНК последовательности и сканирования электрона микроскопических изображений биопленки на Ито электрода, как сообщалось ранее,⁴. Для подтверждения ставки ограничения в процессе EET контролировать эффект добавления челночные электрона посредников например 100 мкм присутствии антрахинона-1-сульфонат (α-AQS). В разделе Представитель результаты и ссылки¹⁵ для более подробной информации.
2. 40 мкл аноксии 50% (v/v) D₂O, в электрохимический реактор с помощью шприца, таким образом, чтобы концентрация составляет 0,5% (v/v) D₂O в реакторе.
   Примечание: Чтобы предотвратить повреждение биопленки добавлением D₂O, придать D₂O каплям.
3. Подождите для тока стабилизации и впоследствии добавить Д₂O до 4,0% (v/v).
   Примечание: Чтобы получить значение Ки (отношение текущего производства при наличии D₂O и H₂O), проверьте эффект такой же объем H₂O Добавление текущего производства.

После 25 h потенциальных приложений на 0,4 V (или она) однослойная биопленки был сформирован на рабочем электроде стекла ITO, который ранее был подтвержден confocal микроскопии4или растровая электронная микроскопия. Представитель время курс текущего производства во время образования монослоя биопленки от S. oneidensis MR-1 показано на рисунке 2. Хотя текущий изменяет в каждом измерении, производимых ток не exhibit отклонение более 50% от стоимости на рисунке 2 , если равномерно формируется монослой биопленки.

После замены супернатант с свежими DM с 10 мм лактат максимально увеличить скорость метаболических процессов и мыть монослоя биопленки (рис. 3) под 0,4 V (по сравнению с она может наблюдаться стабильной анодного тока (около 5% увеличение в 10 мин) ) приложения (рис. 4a). Если анодного тока резко увеличивается, подождите, пока тока стабилизируется. Это весьма возможно, что процедуры супернатанта замены, описанные в разделе 2 может повредить биопленки и реконструкции может произойти.

Сплошная линия в рисунке 4a является представителем результат для микробной текущие изменения, вызванные добавлением2O D. Добавление 1,0% (v/v) D2O резко снизился микробной ток в течение 10 сек, в то время как почти не текущее снижение наблюдалось путем добавления H2O (пунктирная линия на рисунке 4a)15. Такая же тенденция был воспроизведен в по меньшей мере четыре отдельных экспериментов. Последовательное Добавление D2O в окончательном концентрациях от 0,5% до 2,0% (v/v) явно выставлены сильное подавление в текущем производства (рис. 4a)15. Потому что микробной текущего производства постепенно восстановился вероятно из-за физиологического эффекта19,20, Ки следует назначить текущее снижение вскоре после добавления D2O. В предыдущем докладе мы собрали текущего производства в примерно 10 мин после добавления D2O для вычисления значения KIE15.

С помощью двух методов, мы подтвердили, что наблюдаемое уменьшение текущей путем добавления2O D объясняется KIE на EET через ом c- Cyts комплекс. Во-первых мы добавили 1 мкм рибофлавин (RF) или Флавинмононуклеотид (FMN) в электрохимических реактора до и после добавления D2O, которые могут быть использованы для изучения EET в S. oneidensis MR-1. В случае S. oneidensis MR-1, flavins специально ускорить процесс EET путем связывания с ом c- Cyts в течение нескольких секунд, потому что flavins функционировать как non ковалентные связывание кофакторов21,22, 23. Таким образом, мгновенное анодное нарастание добавлением Флавин указывает ограничение скорости EET процессом через ом c- Cyts (рис. 5). Мы далее подтвердил эффект челночные электрона посредников на ки. Редокс малых молекул, например, присутствии антрахинона-1-сульфонат (α-AQS), завершить процесс EET, диффундирующих от микробной электрон-транспортной цепи к электроду, вместо прямого переноса электронов через ом c- Cyts15 , 24. здесь, помимо 100 мкм α-AQS расширение текущего производства с более чем 5 раз (рис. 4b), который указывает, что кинетика метаболических реакций достаточно быстро, чтобы сделать процесс ограничения скорости шаг EET. Последовательно текущее производство, при посредничестве α-AQS остались незатронутыми D2O сложения (Рисунок 4b), демонстрируя, что потенциальные задержки в метаболических реакциях, D2O не вызывает больших KIE, наблюдается в рисунок 4a .

Сочетание этих двух подходов к наблюдать KIE на переноса электронов с ом c- Cyts является критической точкой настоящего доклада, и конкретно, челночные электрона посредников могут быть применимы к другим Электроактивные биопленки. Кроме того, после того как мы подтвердили, что текущее изменение назначен процесс EET, мы могли бы оценить эффект частичного удаления мутантов ом c- Cyts или Флавин, связанные с ом c- Cyts на Протон денежных кинетики, сравнивая ки в обоих случаях15. Когда D2O был добавлен в присутствии ФМн привязки с ом c- Cyts, текущее снижение был сокращен таким образом, чтобы он был меньше, чем без ФМн, указывающее, что привязка ФМн изменены протонного транспорта путь и его кинетика (Рисунок 4 c)15.

Рисунок 1: электрохимический реактор, используемые в данном исследовании. Фотография для электрохимической ячейки до строительства () и после строительства (b). (c) схематическая иллюстрация электрохимических реактора после 25 h электрохимических прививка на 0,4 V против она. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: представитель текущее производство от S. oneidensis MR-1 во время образования биопленки монослоя на электроды ITO. Стрелка указывает время добавления суспензию клеток в электрохимических реактора. Такая же тенденция был воспроизведен в по меньшей мере пять отдельных экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: замена супернатант свежие определенный средний (DM) с 10 мм лактат. () газ азот потока над поверхностью жидкости. (b) удаление супернатант из электрохимических реактора. (c) Добавление 4.0 мл свежего DM содержащий 10 мм лактат. После среднего сложения реактор следует наклонные удалить супернатант прикреплена к стене реактора. Проводить эти процедуры (–c) три раза в общей сложности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: Эффект добавления2O D на текущее производство от биопленки монослоя S. oneidensis MR-1. Времени по сравнению с текущего производства для монослоя биопленки S. oneidensis MR-1 в электрохимические системы, содержащие 10 мм лактата (), дополнительные 100 мкм присутствии антрахинона-1-сульфонат (α- AQS) (b), или дополнительные 2 мкм Флавинмононуклеотид (FMN) (c). Такая же тенденция был воспроизведен в по меньшей мере четыре отдельных экспериментов. Стрелки указывают время добавления D2O (сплошная линия) или H2O (пунктирная линия). Данные, соответствующие пунктирной линии были нормализованы к точке данных перед добавлением D2O в сплошной линии данных. Указана концентрация D2O в электрохимических реактора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5: оценки определения ставки шаг в текущем производстве монослоя биопленки S. oneidensis MR-1 путем добавления flavins. Времени по сравнению с текущей добычи монослоя биопленки S. oneidensis MR-1 в присутствии 10 мм лактата (сплошная линия), 1,0 мм лактата (пунктирная линия) и 0,1 мм лактата (пунктирная линия). Стрелка указывает точку времени, в котором 1 мкм Флавинмононуклеотид (FMN) была добавлена в электрохимических реактора. При наличии 10 мм лактат, добавлением ФМн резко увеличился текущего производства, демонстрируя, что внеклеточного переноса электронов (EET) через c-типа цитохрома комплексы, встроенных в бактериальной внешней мембраны (OM c - Cyts) является определение курса. Менее лактат концентрация в электрохимических реактора вызванных меньше текущего повышение ФМн сложения, указывая, что электрон питания от вверх по течению метаболических реакций к ом c- Cyts постепенно стал медленнее, чем уровень EET. Такая же тенденция был воспроизведен в по меньшей мере два отдельных экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Авторы не имеют ничего сообщать.