Method Article

Количественный анализ микро CT Aortopathy в мышиной модели β-aminopropionitrile индуцированной аневризмы аорты и рассечение

DOI:

10.3791/57589

⸱

July 16th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Vascular and Inflammatory Diseases, University of Maryland School of Medicine, 2Department of Diagnostic Radiology and Nuclear Medicine, University of Maryland School of Medicine, 3Division of Vascular Surgery, University of Maryland School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта статья описывает подробно методика с использованием контрастного вещества на основе свинца силиконовая резина для perfuse мышиных сосудистую для количественного определения диаметра аорты в мышиной модели аневризмы аорты и рассечение.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Аневризма аорты и рассечение ассоциируется с значительным заболеваемости и смертности населения и может быть высокой летальностью. Хотя существуют Животные модели аортальной болезни, в естественных условиях изображений сосудистую был ограниченным. В последние годы, Микро Компьютерная томография (микро CT) стала предпочтительным методом для визуализации больших и малых судов как в естественных условиях , так и ex vivo. В сочетании с методом литья сосудов мы успешно использовали микро CT для характеристики частоты и распределение патологии аорты у мышей C57/Bl6 β-aminopropionitrile лечение. Технические ограничения этого метода включают изменения в качество перфузии, представленный бедных животных подготовки, применение надлежащей методологии для количественного определения размера судна и живучести этой процедуры. Эта статья подробно описывает методологию для внутрисосудистого перфузии на основе свинца рентгеноконтрастных силиконовая резина для количественной характеристики aortopathy в мышиной модели аневризмы и рассечение. В дополнение к визуализации патологии аорты, этот метод может использоваться для изучения других сосудистых кровати в естественных условиях или сосудистая кровати удалены посмертные.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Частота аорты составляет 3 случаев на 100000 в год1. Аорты и аневризмы заболеваний приходится свыше 10 000 смертей в Соединенных Штатах каждый год, приходится на 1-2% всех смертей в западных странах2. Аорты инициируется слеза в слое интимы судна с распространением крови через слои аорты стены под физиологического давления. Давление повышенный пульс пациента связаны с увеличение случаев вскрытие и осложнений. Увеличение стены касательное напряжение связано с расширение аорты стены приводит к формированию аневризмы3,4. Последствия аорты включают непроходимость потока крови в отдаленные органы, в том числе мозга, почек, кишечника и конечностей, формирования хронической аневризм, разрыв или смерти5,6,7.

В настоящее время биохимических и клеточных процессов, участвующих в начало и развитие аневризмы аорты и вскрытия еще плохо поняты. Воспроизводимые Животные модели аневризмы аорты и рассечение являются ключом к пониманию их патофизиологии. Β-aminopropionitrile (BAPN) – это ингибитор оксидазы лизил, который предотвращает cross-linking эластина и коллагена и было показано, значительно изменить структуру судна стены внеклеточного матрикса и его биомеханической целостности6, 8. Грызуны, относились с BAPN были использованы как общей животной модели аневризмы аорты и рассечение9,10.

Сосудистые визуализации формы играют важную роль в выявлении сосудистой патологии, подтверждающие судно проходимость и оценке орган перфузии. Недавно Микро Компьютерная томография (микро CT) использовались для изучения сосудистую мышей, и аналогичным образом размера животных. В отличие от кости осевой томографии кровеносных сосудов, компьютерная томография ограничено, как кровь внутрипросветная изначально относительно radiolucent. В сочетании с внутривенного контрастного вещества, однако, микро КТ позволяет подробный трехмерной реконструкциями животных vasculatures для изучения макро анатомических сосудистой патологии11.

Выбранный контрастного вещества (см. Таблицу материалов) является рентгеноконтрастных силиконовая резина, содержащий хромат свинца и сульфат свинца. После перфузии в присутствии катализатора, он быстро затвердевает сформировать литой сосудистую с минимальными изменениями в макро анатомических архитектуре сосудов, делая сосудистую высоко контрастного вещества в отличие от фона тканей при изучены рентгенологически. Этот контраст агент выгодно, потому что он прост в обращении и избегает ткани деградации и гибели судна из-за поломки часто ассоциируется с сосудистой литой коррозии. Как он лечит с минимальной усадкой12, сосуды, очищенные от крови остаются патентных и позволяют для точной оценки животных макро сосудистую в экспериментах-выживание. Предыдущая работа успешно использовала рентгеноконтрастных силиконовая резина контраст в различных исследованиях на животных. В частности было показано применимость в визуализации коронарных, клубочковых, плаценты и мозгового тиражи11,12,13,14,15 . В этой статье мы подробно методологии открытого левой вентрикулярной пункции для внутрисосудистого перфузии на основе свинца рентгеноконтрастных силиконового каучука количественно характеризовать BAPN-индуцированной патологии аорты в мышиной модели по микро CT.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протоколы для обработки животных были утверждены институциональный уход животных и использования Комитетом университета штата Мэриленд Балтимор (номер 0116024 животных протокол) и проведены согласно АААЛЖ международных стандартов.

1. Подготовка реагентов

  1. Гепарин
    1. Разбавляют 250 мкл 1000 ед/мл гепарина сульфат 50 мл фосфата буфер солевой раствор, чтобы сделать окончательный концентрации 5 ед/мл.
    2. Теплый гепаринизированным (5 ед/мл) фосфат буфер солевой раствор, который заменит кровь в сосудистую на водяной бане, равным 37 ° C.
    3. Подготовка под контролем давления насоса, подключив необходимые трубы и 2 пустые шприцы 10 мл, 1 для буфера гепаринизированным солевых и 1 для контрастного вещества.
    4. Заполнить трубы с теплой гепаринизированным фосфатный буфер и удаления пузырьков воздуха из труб давление насоса.
  2. Контрастное вещество
    Примечание: Обратитесь к Таблице материалов для составляющих комплект агента контраст.
    1. Смешайте пигментированной соединение с помощью разбавителя для достижения 1:6 краска, разбавитель соотношение.
    2. Непосредственно перед использованием (шаг 2.3.12) добавьте 200 мкл отвердителя для каждого Алиготе 5-мл разбавленной пигментных соединения и смеси, их хорошо (4% по объему).
      Примечание: Производитель сообщили, что рабочее время – 40 мин. Силиконовая резина контрастное вещество начинает полимеризоваться 20 мин после добавления отвердителя, важно подготовить решение непосредственно перед его инфузии.
  3. BAPN питьевой воды
    1. Растворите в питьевой воде для создания конечной концентрации 3 г/Л (адаптировано из протоколов, ранее описанных в литературе)9,,1617β-aminopropionitrile (BAPN).
    2. Администрирование BAPN-содержащих питьевой воды к группе мышей после того, как они являются 4 недель возраста до времени перфузии для микро CT.

2. хирургическая процедура

  1. Подготовка животных
    1. Отучить мышей на 3-недельного возраста, поддерживать их на свет/12 12 h h темные цикла и кормить их стандартных грызунов Чоу. Для BAPN-лечение группы управлять свежеприготовленный BAPN питьевой воды для 16-26 недель ad libitum. Обеспечивают управления животных с стандарт питьевой воды ad libitum.
  2. Цистит техника
    Примечание: за 24 часа до анализа CT, следующая процедура выполняется. Хирургические процедуры выполняются подготовить образец посмертных внутрисердечной перфузии.
    1. Побудить анестезии через индукции резервуар с 100% O2 и 3% изофлюрановая, доставлено через испаритель точности. После индукции анестезии прекратить изофлюрановая и потолочные камеры с O2. Поддержание анестезии с 2-2,5% изофлюрановая и 1 Л/мин2 O через носовой конус.
    2. Придаем зале индукции и маску уголь приспособления для адсорбции отходящих газов для защиты персонала. Обеспечение адекватной анестезии плоскости, продемонстрировав, что нет ответа на вредных раздражителей (мыс сжатие).
    3. Подготовка операционного поля, состоящий из хирургической лоток и необходимых хирургических инструментов.
    4. Передать животное хирургических поле и поместите его в спинной recumbency.
  3. Постановляющей части техника
    1. С помощью ножниц, сделайте срединной линии разреза через кожи и мягких тканей от посередине между лобковой симфиза к грудной вырез, проходящий через кожи и мягких тканей, обволакивающие грудины.
    2. С помощью ножниц, создайте отверстие в диафрагме на мечевидный процесс войти в грудной полости.
    3. Используйте ножницы, чтобы вскрыть диафрагмы брюшной грудной стенки, на двусторонней основе.
    4. Прорезать реберного хряща для разделения ребер от грудины на право грудинного границе.
    5. Применить штраф гемостатический зажим к кончику грудины (возле мечевидного отростка) и переместить кровоостанавливающий краниально, так что он позиционируется на голову мыши. Это будет отзывать тимуса и грудины от сердца, сердца и магистральных сосудов для дальнейших манипуляций.
    6. Резко рассекать любые вложения между сердцем и грудной стенки.
    7. Подключите 27-иглы IV катетер к шприцу, предварительно загружаются с 10 мл гепаринизированным фосфатный буфер (5 ед/мл) и заполнить все трубки с буфером для удаления пузырьков воздуха из трубы давление насоса.
    8. Осторожность при подготовке жидкость, как пузыри в строке жидкости могут препятствовать заполнению небольших судов. Ограничьте количество судов, которые были повреждены в ходе подготовки животных, поскольку это вызовет контрастного вещества к утечке из разорвала сосуды, изменяя объем, необходимый для полного заполнения и представляя артефакты для окончательного изображения.
    9. Пункции левого желудочка с 27-иглы, стабилизируется с углом зажим. Сразу же надрезать правого желудочка или нижней полой вены для слива раствора гепарина и крови.
      Примечание: Гепарин используется как антикоагулянт для предотвращения крови от свертывания крови в сосудах после смерти животного.
    10. Perfuse животное с постоянной скоростью 2 мл в минуту с помощью одного шприцевой насос. Обратите внимание на видимые бланширования органов. До тех пор, пока perfusate, слив от венозного кровообращения бесплатно крови (около 5-6 мл) по-прежнему перфузии. Остановите насос.
    11. Отключите трубки катетера IV от 10-мл шприц, стараясь не нарушить положение иглы в левый желудочек.
    12. Сразу же после полного обескровливания, отдельные решения агент контраст в 5-мл аликвоты и добавления отвердителя на данный момент (см. шаг 1.2). Хорошо перемешайте их. Составить 5 мл смеси агент контраст в 10-мл шприц и perfuse животное с ним.
    13. Для полного заполнения сосудов (артерий и вен), продолжить вливание мимо точки, когда можно увидеть, выход венозной решения. Ищите признаки успешной перфузии, включая визуализацию литья агента в коронарных артерий, легочной артерии, ЖКТ и печени сосудистую.
    14. Контрастное вещество будет вылечить после примерно 20 минут при комнатной температуре. После отверждения, урожай отдельных органов, при необходимости и исправить их в нейтральных буферизации формалина 10%. Исправьте все туши, если образцы не используются для микро КТ сканирование на следующий день. Если туши будет использоваться в последующих дня, расположите их на подносе металла и поместите их в холодильник на 4 ° C для лечения на ночь.

3. микро КТ сканирование и параметры

Примечание: Параметры приобретения конкретного изображения будет зависеть машины в использовании.

  1. Приобрести рентгеновская компьютерная томография изображения каждой мыши на следующий день после перфузии, с помощью микро КТ-сканера, с помощью рентгеновской трубки напряжение 55 kVp, тока 150 мА, системы кратность 2.19 и CCD камера пикселей биннинга фактор 2. Это дает эффективных пикселей размер 29 мкм.
    1. Положите мыши тушу лежа на таблице микро-томограф и получить разведчик рентгеновского сканирования.
    2. Детектор поля зрения 57,4 мм (осевой) x 37.1 мм (transaxial) сосредоточена на туловище изображений на всю длину аорты.
    3. Приобрести 180 проекции изображений с шаг поворота 2 градуса и раз в проекции 2800 МС.
  2. Реконструировать изображения, используя модифицированный алгоритм Feldkamp; Размер реконструированный voxel-29 x 29 x 29 мкм3 (ломтик толщина = 29 мкм) с использованием смешанных 3D визуализации плагин для программного обеспечения используется здесь.

4. пост-обработки и визуализации

  1. Преобразуйте данные КТ в формате DICOM, с использованием соответствующего программного обеспечения.
  2. Анализ изображения, чтобы определить, является ли аневризмы присутствовал. Измерьте диаметр малая ось в самом широком месте аорты, нисходящей грудной аорты, и брюшной аорты как описано18 (рис. 1).
    Примечание: В нашем исследовании, изображения были проанализированы два независимых наблюдателей (один ослепил) используя программу просмотра для определения ли аневризмы присутствовал. Малая ось диаметром измерялась в самом широком месте аорты, нисходящей грудной аорты и брюшной аорты как описано19 (рис. 1). Означает, что не аневризмы артериальных сегментов лечить BAPN мышей создан нормальный судно диаметров, выступающей в качестве значения элемента управления соответствует возрасту.
  3. Аневризм определяются как локализованного или диффузный дилатация аорты сегментов с диаметром больше чем 50% от диаметра ссылка. Найдите эти основанные на измерениях, выше.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для того, чтобы оценить этот протокол, 20 взрослых мышей-самцов, смешанного происхождения как описано19 и 20-30 недель, с или без BAPN лечения, были увлажненную с на основе свинца рентгеноконтрастных силиконовая резина (см. таблицу материалы ) с использованием протокола, подробно изложенных выше. Они прошли, микро КТ сканирование на следующий день (рис. 1 и Рисунок 2). С...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микро-КТ может использоваться для предоставления весьма подробные и трехмерной реконструкциями сосудистой патологии в животных моделях. Благодаря использованию внутрисосудистого контраст расширенные средства массовой информации-расширение мягких тканей, таких как просвета кровеносного сосуда, может быть продифференцированным от тех, которые являются повышение. Хотя лазера Doppler, microangiography, магнитно-резонансная ангиография, гистологии с микроскопией конфокальный, или двух фотон может использоваться для оценки сос...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить Марк Смит за его помощь в радиографические изображения. Работа выполнена при поддержке гранта NIH T32 междисциплинарных исследований в сердечно-сосудистых заболеваний (BOA), Американской ассоциации сердца (SMC) и низ Грант R35 (ДКС).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MicrofilFlow Tech, IncMV-122Мы используем желтый цвет, другой цвет можно заказать по желанию. В комплект входят MV-компаунд, MV-разбавитель и MV-отвердитель.
Гепарин (1000 Ед/мл)Sagent Pharmaceuticals25021-400-10
Фосфат буферизованный физиологический растворCorning21-031-CV
ИзофлуранVet One, MWI502017
3-аминопропионитрил фумарат сольSigma-AldrichA3134
Одношприцевой насосFisher Scientific14-831-200
27-калибр набор игл для измерения вен скальпаExel Int2670927G x 3/4", 12" трубка
Inveon Микрокомпьютерный томографSiemens Medical Solutions
Osirix MDPimxmeo SARLверсия 8.0.2
Inveon Research WorkplaceSiemens Medical Solutionsверсия 4.2
грызун ChowHarlan Teklad2018sx

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meszaros, I., et al. Epidemiology and clinicopathology of aortic dissection. CHEST. 117 (5), 1271-1278 (2000).
  2. Kochanek, K. D., et al. Deaths: final data for 2009. National Vital Statistics Reports. 60 (3), 1-116 (2011).
  3. Li, J. S., Li, H. Y., Wang, L., Zhang, L., Jing, Z. P. Comparison of beta-aminopropionitrile-induced aortic dissection model in rats by different administration and dosage. Vascular. 21 (5), 287-292 (2013).
  4. Huffman, M. D., Curci, J. A., Moore, G., Kerns, D. B., Starcher, B. C., Thompson, R. W. Functional importance of connective tissue repair during the development of experimental abdominal aortic aneurysms. Surgery. 128 (3), 429-438 (2000).
  5. Wu, D., Shen, Y. H., Russel, L., Coselii, J. S., LeMaire, S. A. Molecular mechanisms of thoracic aortic dissection. Journal of Surgical Research. 184 (2), 907-924 (2013).
  6. Bruel, A., Ortoft, G., Oxlund, H. Inhibition of cross-links in collagen is associated with reduced stiffness of the aorta in young rats. Atherosclerosis. 140 (1), 135-145 (1998).
  7. Martinez-Revelles, S., et al. Lysyl oxidase induces vascular oxidative stress and contributes to arterial stiffness and abnormal elastin structure in hypertension: Role of p38MAPK. Antioxidants & Redox Signaling. 27 (7), 379-397 (2017).
  8. Kumar, D., Trent, M. B., Boor, P. J. Allylamine and beta-aminopropionitrile induced aortic medial necrosis: Mechanisms of synergism. Toxicology. 125 (2-3), 107-115 (1998).
  9. Ren, W., et al. β-Aminopropionitrile monofumarate induces thoracic aortic dissection in C57BL/6 mice. Scientific Reports. 6, 28149(2016).
  10. Kanematsu, Y., et al. Pharmacologically-induced thoracic and abdominal aortic aneurysms in mice. Hypertension. 55 (5), 1267-1274 (2010).
  11. Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. Jr Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging. J Vis Exp. (60), e3740(2012).
  12. Cortell, S. Silicone rubber for renal tubular injection. Journal of Applied Physics. 26 (1), 158-159 (1969).
  13. Bentley, M. D., Ortiz, M. C., Ritman, E. L., Romero, J. C. The use of microcomputed tomography to study microvasculature in small rodents. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 282 (5), R1267-R1279 (2002).
  14. Marxen, M., et al. MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging. Medical Physics. 31 (2), 305-313 (2004).
  15. Yang, J., Yu, L. X., Rennie, M. Y., Sled, J. G., Henkelman, R. M. Comparative structural and hemodynamic analysis of vascular trees. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (4), H1249-H1259 (2010).
  16. Jia, L. X., et al. Mechanical stretch-induced endoplasmic reticulum stress, apoptosis, and inflammation contribute to thoracic aortic aneurysm and dissection. The Journal of Pathology. 236 (3), 373-383 (2015).
  17. Kurihara, T., et al. Neutrophil-derived matrix metalloproteinase 9 triggers acute aortic dissection. Circulation. 126 (25), 3070-3080 (2012).
  18. Dillavou, E. D., Buck, D. G., Muluk, S. C., Makaroun, M. S. Two-dimensional versus three-dimensional CT scan for aortic measurement. Journal of Endovascular Therapy. 10 (3), 531-538 (2003).
  19. Muratoglu, S. C., et al. LRP1 protects the vasculature by regulating levels of connective tissue growth factor and HtrA1. Arterioclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33, 2137-2146 (2013).
  20. Badea, C. T., Dragova, M., Holdsworth, D. W., Johnson, G. A. In vivo small animal imaging using micro-CT and digital subtraction angiography. Phys Med Biol. 53 (19), R319-R350 (2008).
  21. Zhou, Y. Q., et al. Ultrasound-guided left-ventricular catheterization: A novel method of whole mouse perfusion for microimaging. Laboratory Investigation. 84, 385-389 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Micro CT AnalysisAortic AneurysmMouse ModelVascular CastingLead based ContrastImage QuantificationAortic DissectionBAPN TreatmentPerfusion ProtocolCT Scanning

Related Articles