Инъекции липополисахарида в мышей, чтобы имитировать вход микробной производных продуктов после нарушения кишечного барьера

Кишечнике человека колонизировали с большой консорциум микроорганизмов, образует микробиоты, который разработал взаимовыгодные отношения с принимающей страны в ходе эволюции. В этой связи принимающей предоставляет безопасную нишу для микробиоты, тогда как микробиоты обеспечивает витаминов, питательных пищеварение и защиты от патогенных микроорганизмов на хост, где микробиоты проживает¹. Когда нарушается этот выгодные отношения между принимающей и микрофлору, могут развиваться заболеваний, таких как воспалительные заболевания кишечника (IBD). IBD является многофакторной хроническим воспалительным заболеванием кишечника, вызванных генетических и экологических факторов, которые происходят в двух основных формах, болезнь (CD) крона и язвенного колита (UC). Несмотря на сходство между двумя формами IBD они характеризуются некоторые различия в местонахождение и характер воспалительных изменений. CD является рецидивирующего Трансмуральное воспалительных расстройство, которое потенциально может распространяться на любую часть желудочно-кишечного тракта, в то время как UC является не Трансмуральное и ограничивается толстой кишки. Кроме того мутации в нуклеотидных-олигомеризации домена содержащих белок 2 (NOD2), рецептор признание шаблон (ПРР), которая признает muramyl дипептид (ПРУ), компонент клеточной стенки наиболее грамположительных и - отрицательных бактерий, является связанные с CD². Кроме того Escherichia coli (E. coli), Listeria и стрептококки и их продукты были найдены внутри макрофагов в CD пациентов, которые вступили узел после того, как барьер нарушение³. Когда бактерии или их продукции введите хост во время разработки CD, иммунная система развивается реакции, ведущие к производству циркулирующих антител анти-бактериальное⁴. Возможно наиболее убедительные доказательства для роли микрофлору в патогенезе IBD проистекает из моделей мышей. Когда животные лечатся антибиотиками, или когда мыши находятся в стерильных условиях (GF), тяжести заболевания уменьшается в большинстве колит моделей, таких как в Ил-10-/ мышей, которые не развиваются колит в GF зал^5,6. Кроме того колит также тревожит состав микрофлору, которая характеризуется несбалансированный состав и снижение богатство, называется дисбактериозом⁷. Следствием IBD может быть повышенной проницаемости кишечника, которые могут привести к входу микробов и микробных производные продукты в хозяина.

В животных применение декстран сульфат натрия (DSS) индуцирует кишечного эпителия нарушение приводит к повышенной проницаемости эпителиальных барьер⁸. Портал LPS концентрации повышаются в животных с DSS колит⁹. Интересно, что животные не хватает C тип Лектин рецептор конкретных внутриклеточных адгезии молекулы-3 захвата nonintegrin связанных с гомолога 1 (знак-R1) защищены от DSS колит и LPS-индуцированной эндотоксемии¹⁰. Для дальнейшего распространения в хозяина, бактерии или бактерии производные продукты должны пройти сосудов барьер¹¹, брюшной полости, в которой расположен маленький и большой intestine, брыжеечный лимфатических узлов и/или печени¹². Чтобы уменьшить сложность этой системы, был использован определенных бактериальных производные соединения. LPS, которые вызывает эндотоксемии после внутрибрюшинного (и.п.) или внутривенно (и.в.) инъекций¹³ было впрыснуто в мышей, изучение выражение интерлейкинов Il6 и Ilb и цитокина Tnfa в ответ на ЛПС.

LPS является патоген связанные молекулярные шаблон (PAMP) выраженный компонент клеточной стенки грамположительных бактерий, который состоит из липидов A (главный PAMP в структуре ПЛАСТИНОК), олигосахариды ядро и O боковой цепи¹⁴. Толл подобный рецептор 4 (TLR4), выраженные дендритные клетки, макрофаги и эпителиальных клеток признает LPS¹⁵, что требует совместного рецепторов для соответствующую привязку. Острая фаза LPS-привязки протеин (LBP) связывает LPS сформировать комплекс, который передает LPS в кластер дифференцировки 14 (CD14), glycosylphosphatidylinositol якорь мембранный белок. CD14 далее челноков LPS лимфоцитов антигеном 96, или также известный как MD-2, который связан с внеклеточного домена TLR4. Связывание LPS в MD-2 облегчает Димеризация TLR4/MD-2 побудить конформационные изменения набора молекул внутриклеточных адаптер для активации течению сигнальный путь¹⁴, который включает миелоидного дифференциации первичной ответ гена 88 (MyD88) - зависит от пути и МДП домена содержащих вызывая адаптер интерферона β (TRIF) - зависимых путь¹⁶. Признание LPS, TLR4 затем активирует NF-κB путь и Индуцирует экспрессию провоспалительных цитокинов, таких как TNFα, IL-6 и IL-1β¹⁷.

В частности когда LPS впрыскивается в животных, концентрация ПЛАСТИНОК для животных, генетический фон животного и диета должна рассматриваться. Высокие концентрации LPS приводит к септический шок, характеризуется гипотензии и несколько орган неудач и наконец до смерти¹⁸. Мышей менее чувствительны к ЛПС, по сравнению с людьми, где концентрации LPS между 2-4 нг/кг веса тела (BW) способны вызвать цитокинов шторм¹⁹. Для мышей летальной дозы (ЛД50), которая вызывает смерть в половине мышей колеблется от²⁰ 10-25 мг/кг массы тела в зависимости от штамма мыши используется. Для часто используемых мыши штаммов, C57Bl/6 и BALB/c, смертельная доза 50% (ЛД50) – 10 мг/кг массы тела. В отличие от штаммов C3H/HeJ и C57BL/10ScCr защищены от ПЛАСТИНОК индуцированной эндотоксемии, который из-за мутации в Tlr4²¹. Следовательно Tlr4-недостаточным мышей, hyporesponsive для инъекций с ПЛАСТИНОК²². Другие генетически модифицированные мыши линии, такие как PARP1/мышей²³ устойчивы к LPS-индуцированной токсический шок.

Описанная модель мыши здесь использует сублетальных дозы LPS, ведении системно для имитации последствий распространения ПЛАСТИНОК после нарушения барьер тела поверхностей. Выбранной LPS концентрации (2 мг/кг массы тела) не вызывает смертности в C56Bl/6 мышей, но индуцированных релиз провоспалительных цитокинов.

Мышей были разведены и хранятся в определенных условиях возбудителя бесплатно (SPF) в объекте животных Департамента биомедицины, Университет Базеля (Базель, Швейцария). Все мыши эксперименты были проведены в соответствии с швейцарских федеральных и кантональных правил (номер 2816 [кантона Базель-Штадт] животных протокол).

1. Приготовление раствора LPS

1. Откройте запас LPS, очищенного от кишечной палочки 0111:B4 в стерильных условиях и восстановить его в воде с концентрацией 5 мг/мл.
2. Разбавьте LPS акций с стерильных фосфатный буфер (PBS) рабочей концентрации 0,2 мкг/мкл.

2. внутрибрюшинного введения ПЛАСТИНОК для мышей

1. Аспирационная LPS рабочего раствора в 0,5 мл шприц с иглой 30 G в ламинарного воздушного потока.
2. Весят самок мышей C57Bl/6 (шесть в возрасте 10 недель) и рассчитать количество ПЛАСТИНОК, которые будут вводиться: 10 мкл (2 мкг) / г веса тела.
   Примечание: например, если мышь весит 20 g, а затем 20 g x 10 мкл = 200 мкл LPS рабочих нужд раствор для инъекций.
3. Обрабатывать мыши, мягко, но твердо и удержать животное в одной руке. Убедитесь, что животное имеет возможность дышать нормально но не поворот и превратить во время сдержанность.
4. Наклона нос мыши слегка к полу подвергать живота для инъекций. Найдите средней линии живота и место инъекции в низкой части живота влево или вправо от средней линии. Inject PBS и.п. вместо ПЛАСТИНОК в мышах управления.
5. Свободной рукой, внедрить соответствующий объем (объем, рассчитанные на шаге 2.2) из ПЛАСТИНОК рабочего раствора. Убедитесь, что игла вошла брюшной полости в противном случае, неправильной инъекции в слой мышц живота может произойти. Тем не менее не вдаваться слишком глубоко с иглой в брюшной полости, чтобы избежать, ранив внутренних органов, расположенных в этом районе.
6. Вернуть животное тщательно клетка с до 5 мышей в клетке.

3. контролировать мышей

1. Мониторинг животных во время инъекции и каждые 2 ч после инъекции на 8 ч для возникновения и тяжести эндотоксемии. Таким образом используйте судейскую (Таблица 1), который был адаптирован от ранее опубликованные рукописи ²⁴.
2. Оценка LPS вводили мышам для следующих параметров, перечисленных в таблице 1
   1. Проверка внешнего вида меха, которая обычно гладкая. Если мех трепал, колючие или опухшие мех, который указывает дискомфорт или боль, оценка их как 1, 2 или 3.
   2. Проверка для действия мыши.
      Примечание: Мыши обычно свободно перемещаться по всей клетке еды, питья, восхождение, но подавлены или ограничения деятельности может быть признаком боли.
   3. Проверьте уровень сознания.
      Примечание: Мышь очень любопытны, и они обычно движутся вокруг клетки, исследование окружающих. Отсутствие или снижение движение может предложить боль и дискомфорт.
   4. Проверка глаз.
      Примечание: Полностью открытыми глазами, как ожидается, в здоровых мышей, но полностью или частично закрытые глаза, возможно с секреторной функцией, может быть признаком боли.
   5. Проверка частоты дыхания.
      Примечание: Здоровых мышей обычно имеют нормальное и быстрое дыхание скорость, частота уменьшение дыхания может быть признаком дискомфорта).
   6. Проверка качества дыхания.
      Примечание: Затрудненное дыхание с или без затрудненное дыхание является признаком боли.

4. ткань выборки для извлечения рибонуклеиновой кислоты (РНК) и гомогенизации

1. Подготовить коллекцию/гомогенизации трубы: добавить 1 мл одноступенчатых РНК изоляции реагента в 2 мл трубы заполнено автоматически с керамическими сферами 1,4 мм.
2. В соответствующее время точках (до (0 h) и 2 h, 4 h и 8 ч после инъекции LPS) усыпить мыши с обезболивающий передозировки (изофлюрановая) следуют обескровливания и провести вскрытие.
3. Вырежьте кожу и мышцы слой, подвергая с внутренних органов брюшной полости с ножницами.
4. Тщательно анализировать селезенки, печени и кишечника, очистить органов от жира и храните их в PBS на льду.
5. Вырежьте небольшой кусок (около 0,5 см) от каждого органа с помощью ножниц или скальпелем.
   Примечание: Важно всегда взять кусок от примерно такой же частью этого органа в каждой мыши (же лепесток печени, проксимальных или дистальной части толстой кишки).
6. Вскоре сухой ткани на кусок бумаги ткани и поместите его в коллекции/гомогенизации трубку, убедившись, что он полностью погружен в РНК изоляции реагента.
7. Однородный ткани в гомогенизатор высокоскоростной benchtop. Для мягких тканей как селезенке, печени и кишечника используют 1 цикл гомогенизации скоростью 6,00 за 30 s.
8. Проинкубируйте образцы для 5 мин при комнатной температуре.
9. Осторожно поместите трубку в жидком азоте для прикрепления замораживание ткани lysate. Храните оснастки, заморожены lysate-80 ° c до изоляции РНК.

5. РНК добыча из ткани

Примечание: РНК изоляции реагентов, хлороформе и спиртов считаются опасными материалами. Выполняйте извлечение RNA под химические вытяжки. Использование сертифицированных бесплатно РНКазы реагенты и оборудование для поддержания свободной РНКазы среды.

1. Разделение фаз
   1. Разморозить замороженные ткани lysate на льду.
   2. Центрифуга для образца на 1000 x g 5 мин при 4 ° C для пеллет оставшиеся частицы ткани, которые могут быть оставлены.
   3. Супернатант передать новой свободной от нуклеиназы 1,5 мл трубки.
   4. Добавить 200 мкл ледяной метилхлороформа за 1 мл РНК изоляции реагента и встряхнуть рукой за 10-15 s.
   5. Проинкубируйте 2-3 мин при комнатной температуре.
   6. Центрифуга 12, 000 x g 15 мин при 4 ° C.
      Примечание: Образец теперь будет содержать 3 фазы: Нижняя красный фенол хлороформ этап, интерфаза, а верхняя бесцветный водный. РНК присутствует в верхней водной фазе.
   7. Соберите верхний водной фазе (50% от общего объема) и передачи в новой свободной от нуклеиназы 1,5 мл трубку.
2. РНК осадков
   1. Добавить 0,5 мл ледяной изопропиловый спирт на 1 мл РНК изоляции реагента и осторожно перемешать, инвертирование трубки 5 - 6 раз.
   2. Проинкубируйте втечение 10-15 мин при комнатной температуре.
   3. Центрифуга на 12000 g x 10 мин при 4 ° C.
      Примечание: РНК Пелле должны быть видны на данном этапе.
3. Мойка РНК Пелле
   1. Полностью удалите супернатант, содержащую изопропанол не нарушая гранулы.
   2. Помойте лепешка с ледяной этанол 75% 1 мл на 1 мл РНК изоляции реагент, используемый для первоначального lysis.
   3. Вихрь образца кратко.
   4. Центрифугуйте образцы на 7500 (или 12 000) х g 5 мин при 4 ° C.
4. Растворяя РНК
   1. Полностью удалите этанола в надосадке не нарушая гранулы.
   2. Оставьте открытой трубки под химические вытяжки для 3-5 мин для воздушно-сухой Пелле РНК при комнатной температуре (не слишком сухой, как в этом случае будет трудно растворить РНК).
   3. Растворяют гранулы РНК в 20-50 мкл нуклеиназы свободной воды, тщательно закупорить вверх и вниз.
   4. Инкубируйте образца при 55 ° C для 10-15 мин для дальнейшего улучшения раствор РНК.
      Примечание: На данном этапе, РНК может храниться при температуре-80 ° C до дальнейшего анализа.

6. пищеварение оставшихся ДНК

1. Измерить концентрации РНК с спектрофотометр закупорить Алиготе (2 мкл) в спектрофотометра и приспособиться к рекомендуемая концентрация.
2. Запустите пищеварение загрязнять ДНК с макс. 10 мкг РНК в 50 мкл нуклеиназы свободной воды.
3. Добавьте 0,1 объема 10 x DNase буфере и 1 мкл rDNase я за образец и смешайте нежно, закупорить вверх и вниз.
4. Инкубируйте при 37 ° C для 20-30 мин.
5. Вихревой DNase инактивацию реагент и добавить 0,1 объема выборки, смешивая с пипеткой.
6. Инкубируйте 5 мин при комнатной температуре, иногда смешивая вручную.
7. Центрифуга на 10000 x g для 1,5 мин.
8. Передача супернатанта, содержащие РНК, ДНК бесплатно в новой свободной от нуклеиназы трубку.
9. Измерение концентрации РНК и качество, спектрофотометр.

7. Обратная транскрипция

1. Используйте имеющиеся дезоксирибонуклеиновой кислоты cDNA обратная транскрипция (RT) Комплект для обратной транскрипции.
   Примечание: Здесь, до 2 мкг РНК могут быть отменены транскрипции.
2. Вычислите объем, который содержит 2 мкг РНК. Пипетка 2 мкг РНК в новом ПЦР-пробирку.
3. Добавьте воды, свободной от нуклеиназы образца в ПЦР-пробирку на окончательный объем 10 мкл.
4. Готовить 2 x Мастер микс, смешивая следующие компоненты, перечисленные в таблице 2
5. Добавьте 10 мкл 2 x Мастер микс 10 мкл РНК для получения 1 x Мастер микс в общем объеме 20 мкл.
6. Закройте полимеразной цепной реакции (ПЦР) трубки и спин вниз образца кратко.
7. Поместите образцы в Термоциклер ПЦР и задайте параметры, перечисленные в таблице 3.
8. Сохраните созданный cDNA при-20 ° C для дальнейшего анализа.

8. Количественная ПЦР (ПЦР)

1. Выполните реакции ПЦР с коммерчески доступных комплект.
2. Самостоятельного проектирования и тестирования Интрон охватывающих грунтовки, перед использованием, с различной концентрации шаблон cDNA. Анализировать эффективность грунтовка, создавая калибровочной кривой и использовать грунты с высокой эффективности и правильный плавления кривых.
   Примечание: В таблице 2перечислены последовательности грунты, используемых в этом эксперименте.
3. Подготовьте количественные полимеразной цепной реакции (ПЦР) реакции в пластину 384-ну реакции установки, описанной в таблице 4.
4. Держите все решения и пластину на льду, с помощью алюминиевой фольги для предотвращения пластину промокания когда реакционную смесь готовится.
5. Выполните все реакции в triplicates.
6. Осуществляют реакции PCR на Термоциклер с использованием настроек, указанных в таблице 5.
7. Вычислить среднее значение Ct для всех реакций от triplicates. Нормализовать все генов-мишеней на уровень экспрессии glycerinealdehyde-3-фосфат дегидрогеназы (Gapdh) уборки гена в расчете 2^(-ΔCt).
   Примечание: Все целевых генов с средняя КТ > 35 были сочтены под предел обнаружения.

Для имитации последствий для принимающей страны после входа бактерий или бактериальной производные продукты, возникающая после нарушения кишечного барьера, LPS вводили мышей C57Bl/6 в сублетальных доз (2 мкг/г веса тела). Каждый мыши контролируется и забил за возникновение эндотоксемии с параметрами, перечисленных в протоколе, которая включает внешний вид мышей, деятельность животных, состояние глаз и частота дыхания и качества (Таблица 1) . Животных наблюдались клинические признаки заболевания, который достиг 6-10 ч после инъекции ПЛАСТИНОК и восстановлены в течение 24 ч (рис. 1). Отдельные мышей были пожертвовать 2 h, 4 h и 8 ч после инъекции ПЛАСТИНОК. Куски ткани были собраны из селезенки, печени и кишечника. РНК был изолирован от этих органов и обратной транскрипции cDNA. CDNA был использован как шаблон для ПЦР для определения уровней выражение Il6 (рисунок 2A) Il1b (рис. 2B), TNFa (рис. 2 c) и Il10 (Рисунок 2D) с праймерами для ПЦР перечисленные в таблице 6. Проявление ИЛ 6 пик 2 ч после инъекции в селезенке и толстой кишки и 4 ч после инъекции в печени. Выражение Il1b, TNFa, и Il10 пика 4 ч после инъекции в селезенке, печени и кишечника. В течение 8 ч после инъекции проявление ИЛ 6, Il1b, TNFa и Il10 вернулся в базовых уровней.

Рисунок 1: LPS инъекции (2 мкг/г веса тела) индуцированной клинических признаков, эндотоксемии в C57Bl/6mice. После инъекции 2 мкг/г веса тела LPS, отдельные мышей были проверены с Оценка болезнь, представлены в таблице 1, которая включает внешний вид и активность животных, открывая их глаза и их частота дыхания и качества каждые 2 ч для 12 h и 24 h кормовой ER LPS инъекций. Оценка по болезни (ось y) были смыты соответствующих времени (ось x). Средний ± SD для 4-5 мышей в каждый момент времени представлена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: LPS инъекции (2 мкг/г веса тела) Индуцирует экспрессию провоспалительных цитокинов в мышей C57Bl/6. Мышей были введены с 2 мкг/г веса тела ПЛАСТИНОК и уровни выражения Il6 (A), (B) Il1b , Tnfa (C) и (D) Il10 были проанализированы ПЦР в селезенке, печени и кишечника в назначенное время очков после инъекции. Уровни цитокина выражения были нормализованы по выражению Gapdh. Средний ±, проявленную SD для 4-5 мышей в каждый момент времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Таблица 1: болезнь Оценка лист для мониторинга мышей C57Bl/6 после инъекции LPS. Параметры, которые контролируются после инъекции ПЛАСТИНОК. Животные были контролироваться каждые 2 ч после инъекции в течение 12 ч, и оценки были даны для каждого отдельного параметра, перечисленных в таблице. Окончательная оценка для каждого животного представляет собой сумму всех индивидуальных очков. Это адаптированный ссылки24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Таблица 2: Реагенты используются для подготовки мастер смесь для обратной транскрипции.

Таблица 3: Термоциклер параметры, используемые для обратной транскрипции.

Таблица 4: Описание реакции PCR.

Таблица 5: Термоциклер параметры, используемые для ПЦР.

Таблица 6: используется в реакции ПЦР праймеры. Последовательность грунтовки используется для ПЦР для выявления цитокины мыши и уборки гена Gapdh.

Авторы не имеют ничего сообщать.