Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Мышиных дистальной колостомы, Роман модель колита утечки в мышей C57BL/6

13K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57616

⸱

12 июля 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General Surgery, Visceral, Thoracic and Vascular Surgery, Universitätsmedizin Greifswald, 2Institute of Pathology, Universitätsmedizin Greifswald

В этой статье

Краткое содержание

Мышиных дистальной колостомы предоставляет мышиных модель для человека утечки колит, преимущественно лимфоцитарный колит в сегменте кишки, исключены из фекальных поток.

Аннотация

Утечки колит (DC) является частым клинического состояния, происходящие в больных с сегментами кишечника, исключены из фекальных поток вследствие отвлечения enterostomy. Этиология этого заболевания остается нечетко, но представляется, отличается от классической воспалительных кишечника таких заболеваний, как болезнь Крона и язвенный колит. Исследования, направленные расшифровать патофизиологические механизмы, ведущие к развитию этого заболевания серьезно затрудняется отсутствием соответствующей мышиных модели. Этот протокол создает модель мышиных DC, что облегчает изучение роль иммунной системы и ее взаимодействия с микрофлора в развитии DC. В этой модели, с использованием животных C57BL/6 дистальной части толстой кишки исключены из фекальных поток, создавая дистальной колостомы, вызывая развитие легкой до умеренной воспаления в сегментах исключенных кишечника и воспроизводя признаком поражения человека Постоянного тока с умеренной системного воспалительного ответа. В отличие от модели крыса большое количество генетически модифицированные мышиных моделях на фоне C57BL/6 доступны. Сочетание этих животных с нашей моделью позволяет потенциальной роли отдельных цитокинов, chemokines или рецепторов биоактивных молекул (например, интерлейкина (IL) -17; IL-10, хемокиновых CXCL13, хемокиновых рецепторов CXCR5 и CCR7 и рецептор сфингозин-1-фосфата 4) следует оценивать в патогенезе DC. Наличие congenic мыши штаммов на фоне C57BL/6 во многом облегчает передачи эксперименты по созданию ролей типов различных клеток, участвующих в этиологии DC. Наконец, модель дает возможность оценить влияние местных вмешательств (например, модификация местных микрофлора или местных противовоспалительная терапия) на иммунитет слизистой кишечника, подверженных и не подверженных сегментов и по системного иммунного гомеостаза.

Введение

В последние годы значительное число субъектов колит неинфекционной, отличается от классической воспалительные заболевания кишечника (IBDs; т.е., ulcerosa колит или болезнь Крона) histopathologically и клинически характеризуется в организме человека. Патофизиологические механизмы, ведущие к развитию этих форм колит не поняты полностью частично потому, что соответствующие Животные модели являются скудными. Колит утечки является одним из этих недавно описан сущностей. Хотя термин был придуман в 1980 году Glotzer1, первоначальное описание подобный фенотип было дано в 1972 Morson2. Болезнь развивается в 50% до 91% больных с отвлечения enterostomy и интенсивности ее клинические меняется3,4. Учитывая ежегодной заболеваемости около 120000 колостомы больных в Соединенных Штатах Америки, эта болезнь сущность является важной проблемой здравоохранения.

Общая цель разработки этого протокола был предоставлять мышиных DC модель опирается на триггер колит, аналогичного тому, которое наблюдалось в человека DC и что воспроизводит основной Гистопатологические особенности заболеваний человека. В отличие от других моделей мышиных колит, колит индукции в нашей модели не требуют генетически измененных животных (например, IL-7 трансгенных мышей, N-Кадгерины доминирующей негативные мышей или TGFβ- / - мышей), применение химически раздражающие вещества (например, декстран сульфата натрия (DSS) - индуцированного колит или ТРИНИТРОБЕНЗОЛ перфтороктановой сульфоновой кислоты (ТНБ) - индуцированной колит), или перемещение населения конкретных клеток в иммунной несовершенным мышей (как ввысокой передачи CD45RB модель колита) (обзор, см.5). В отличие от других моделей неповрежденной иммунной системы нашей модели постоянного тока позволяет оценки иммунологического механизма участвуют в развитии DC. Ограничение воспаления слизистых оболочек в сегмент исключенных кишечника позволяет оценить его последствия на слизистой иммунитета в других частях желудочно-кишечного тракта, на иммунного гомеостаза в другие иммунные отсеках кишечного тракта (например , Патчи и mesenteriale лимфоузлы Peyer) и на иммунного гомеостаза всего организма. Наконец наша модель представляет собой соответствующий инструмент для изучения механизмов, контролирующих местных воспалительных раздражителей, возникая от изменений в нормальных местной окружающей среды для как местные микрофлора, а также пищевых антигенов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все методы, описанные здесь были одобрены ветеринарные власти (шведским für сельского хозяйства, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Мекленбург-Передняя Померания, LALLF M-V).

1. предоперационной помощи и подготовки животного

  1. По прибытии в объекте животных разделите группы аналогичного размера животных (C57Bl/6), клетку каждой группы вместе и держать группы постоянной на протяжении всех экспериментов.
    Примечание: Используйте животных одного пола. Описаны результаты были получены с мышей-самцов.
    Примечание: Если используются Мыжские животные, Кейдж групп вместе начиная когда они возрасте 7 недель, чтобы иерархия может быть создана, таким образом к минимуму риск агрессивного поведения во время экспериментов.
  2. По крайней мере за одну неделю до операции, переключитесь на высокой энергии (> 14 МДж/кг) и высоким содержанием белка (> 20%) канал, содержащий все основные микроэлементы и витамины (подробности см. в список материалов).
    Примечание: Заверить всех мышей весят по крайней мере 25 g, когда операция выполняется.
  3. Вызвать анестезия и анальгезия, внутрибрюшинного введения кетамин (и.п. 87 мг/кг) и ксилазина гидрохлорид (и.п. 13 мг/кг). Подождите, пока мышь допускает механическую стимуляцию, например мыс тангажа, без мотора ответа.
  4. Безопасный наркотизированного мышь с ленты в лежачем положении на подложку тепла, дислоцированные в операции стол, гарантируя стабильный позиционирования во время операции и избегая подавляющее потерю тепла тела.
    Примечание: Тепла подложки должны иметь температуру поверхности 36 ° C до 40 ° C; Температура должна быть 21 ° C.

2. дистальной колостомы операции

  1. Бритье волос живота. Перед началом операции, операции поле три раза с использованием спирта 70% и йодофора дезинфицировать. Драпировка поле операции, чтобы гарантировать для асептических условиях.
  2. Выполнение 15-мм средний лапаротомия с промо брюшных мышц и брюшины вдоль linea alba, таким образом минимизируя потери крови.
  3. Использовать два DeBakey атравматической щипцы, осторожно потяните слепой кишки, терминал подвздошной кишки и возрастания и поперечно-ободочной кишки от брюшной полости.
    Примечание: Будьте осторожны, чтобы строго ограничить механические манипуляции кишечника для предотвращения травмы верхней брыжеечной структурам.
  4. Идентифицировать сенситизации полюс, восходящей толстой и тонкой кишки (цифры 1a и 1b).
    Примечание: Корректная идентификация восходящей ободочной кишки имеет основополагающее значение для правильного размещения колостомы. В тех случаях, когда Анатомия Илеоцекальной области является неоднозначным наличие Пейера определяет тонкой кишки, и присутствие сформированных табурет характеризует толстой кишки.
  5. Использование линейки для определения позиции будущего колостомы. Она должна быть размещена 20 мм дистальнее илеоцекальной клапан для дистального колостомы.
  6. Сделайте второй 3-мм разрез в брюшной стенке в правом верхнем квадранте. Вытяните ранее выявленных сегмент толстой кишки через этот разрез в форме петли, соблюдая осторожность, чтобы не исказить цикла.
  7. Тщательно пройти 22-го калибра гибкие Внутривенный катетер через mesocolon. Будьте осторожны, чтобы не повредить брыжеечных сосудов структур.
  8. Возвращение intestine в брюшной полости.
  9. Исправьте обоих концах гибкие трубки на кожу с помощью простых швов и рассасывающимся швом (например, полиглактин 910 или polyfil 4-0 1/2 c).
  10. Перед закрытием лапаротомия, выполните жидкости реанимации с помощью внутрибрюшинной инъекции по 0,5 мл 0,9% физиологического раствора.
  11. Закройте брюшины и слой мышц с помощью непрерывного шва с помощью рассасывающимся швом (например, полиглактин 910 или polyfil 4-0 1/2 c). Закройте кожи с непрерывного шва с помощью рассасывающимся швом (например, полиглактин 910 или polyfil 4-0 1 / 2c).
  12. Откройте экстериоризируется петли кишки, выполнив Итого перерезка с помощью тонкой ножниц. Избегайте всех травм в брыжейке. Не разрез толстой кишки полностью.
  13. Исправления каждого открытия колостомы, используя три один полный Толщина швов на брюшине и кожи с использованием монофил, рассасывающиеся шовные (например, полидиоксанон или монофил 6-0 3/8s). Афферентные цикл, который является функциональной конце колостомы, и эфферентных цикл, который является слизи свищей, четко разделены в этой точке (рис. 1 c).
    Примечание: Время работы должно быть меньше 20 минут ограничить жидкости и тепловые потери.
  14. После окончания операции, дезинфекция инструментов, с помощью решения альдегида дезинфекции в ультразвуковой ванне согласно инструкциям производителя.

3. Шам операции (Colotomy)

  1. Выполните шаги 1.1. через 2.4.
  2. Использование линейки для определения позиции будущего colotomy. Colotomy должен быть позиционирован на таком же расстоянии от клапана илеоцекальной колостомы в опытной группе.
  3. Откройте толстой кишки по крайней мере две трети его окружности с помощью тонкой ножницы.
  4. Закрыть colotomy с одним слоем, полная толщина прервана шовный материал с помощью монофил, рассасывающиеся шовные (например, полидиоксанон, монофил 6-0 3/8s).
    Примечание: Время работы должно быть меньше 20 минут для экспериментировали хирург, ограничение жидкости и тепловых потерь.
  5. Выполните шаги 2.10. , 2.11. и 2.14.

4. послеоперационный уход

  1. Возвращение в их клетках животных. Хорошо темперированный атмосферу 37 ° C (например, с инфракрасной лампой) до тех пор, пока мышей полностью проснуться. Затем Держите мышей в регулирование температуры и влажности окружающей среды (21 ° C, относительной влажности 30% ± 10%). Разрешить свободный доступ к продовольствию и питьевой воде. Чтобы облегчить усвоение жидкости, обеспечивают дополнительные водянистыми кормов для животных.
  2. Начать послеоперационное обезболивание путем инъекций 0,1 мг/кг тела вес бупренорфин s.c. когда животных показывают ответ на механической стимуляции. Будьте осторожны избежать угнетения дыхания.
  3. Дополнение питьевой воды с 1 мг/мл трамадол для продолжения анальгезии в течение первой недели после операции.
  4. Чтобы компенсировать снижение потребления жидкости из-за ограниченной подвижностью, Поставка твердых пить Pad в клетке в течение первой недели после операции.
  5. Вес животных и оценка поведения животных ежедневно в течение первой недели, каждый второй день, в течение оставшейся части первого месяца и каждый третий день в течение второго месяца, используя описанные в Kleinwort et al. оценка тяжести заболевания 6.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Хирургия хорошо переносится в экспериментальной (колостомы) и групп Шам (colotomy). Постоперационная смертность не должна превышать 10%, когда хирургии и периоперационной управление выполняется правильно. В течение первой недели после операции значительная потеря веса рассматривается в экспериментальных и Шам групп. Животные Шам группы достичь их вес Надир обычно на четвертый день после операции, но это происходит один день позже в опытной группе. Потеря веса более выражен в экспериментал...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мышиных модель DC, представленные в настоящем Протоколе надежно воспроизводит Гистопатологические особенности человека DC (например, de novo развитие лимфоидных фолликулов в подслизистой воспаление кишечника сегментов, склеп сокращения и сокращения Кубок числа клеток). Помимо этого преимущество эта модель индуцируется очень похожи пусковым фактором и представляет с клиническое течение средней и легкой степени тяжести, как это бывает в наиболее пострадавших людей.

Для получени...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Все авторы заявляют, что они имеют не конкурирующие интересы.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
><Материал для работы
Тепловая подложка, 6 ВтThermoLux, Witte + Sutor GmbH461265
Этанол 70% (с метилэтилкетоном)Аптека Университетской клиники Грайфсвальда
Деревянные аппликаторы, маленькая хлопчатобумажная головка односторонняя, деревянная палочка, длина 150 ммCentramed GmbH, Германия8308370для дезинфекции операционного поля
НожницыAesculap (BRAUN)BC064R
Атравматические щипцы DeBakeyAesculap (BRAUN)OC021R
ИглодержательAesculap (BRAUN)BM012R
Vasofix Safety i.v. канюля 22GBraun Melsungen AG, Германия4268091S-01
VICRYL Plus 4-0 фиолетовая оплетка; В-5 17 м 1/2с; 70 смETHICON, Inc.
ПДС II 6-0 монофил; В-18 13 мм 3/8с; 70 смETHICON, Inc.Z991H
BD Plastipak 1 мл (Шприцы с иглой со стерильной внутренней частью)BD Medical305501
Триацид-N (N-додецилпропан-1,3-диамин)АНТИСЕПТИКА, Германия18824-01дезинфекция хирургических инструментов в ультразвуковой ванне
<эм>Лекарства
кетамин 10%, 100 мг/мл (кетамина гидрохлорид)селектавет, д-р Otto Fischer GmbH9089.01.0087 мг/кг i.p.
Xylasel, 20 мг/мл (ксилазина гидрохлорид)selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH400300.00.0013 мг/кг i.p.
NaCl 0,9%Braun Melsungen AG, Германия6697366.00.00
Бупреновет 0,3 мг/мл (бупренорфин)Bayer, ГерманияPZN: 014988700,1 мг/кг s.c.
Tramal Drops, 100 мг/мл (трамадола гидрохлорид)Grü nenthal GmbH, Германия101168381 мг/мл питьевой воды
Ceftriaxon-saar 2 г (цефтриаксон) Cephasaar GmbH, ГерманияPZN: 0884425225 мг/кг массы тела i.p.
metronidazole 5 мг/млBraun Melsungen AG, ГерманияPZN: 0554351512,5 мг/кг массы тела i.p.
Food
ssniff M-Z Ereichssniff, Германия  V1184-3
Твердый напиток Dehyprev Vit BIO, пакетикиTripleATrading, НидерландыSDSHPV-75
оборудование
Nikon Eclipse Ci-LNikon Instruments Europe BV, Германиясветовая микроскопия
VetScan HM 5 Abaxis, США770-9000Ветеринарный гематологический анализатор 50 & микро; l венозная ЭДТА-кровь Bandelin
SONOREX (Ультразвуковая ванна)Bandelin electronics,Германия RK 100 Hдезинфекция хирургических инструментов
Software
NIS-Element BR4 программное обеспечениеNikon Instruments Europe BV, Германия
GraphPad Prism Version 6GraphPad Software, Inc.
VCP994H

Ссылки

  1. Glotzer, D. J., Glick, M. E., Goldman, H. Proctitis and colitis following diversion of the fecal stream. Gastroenterology. 80, 438-441 (1981).
  2. Morson, B., Dawson, I. Gastrointestinal Pathology. , Blackwell Scientific Publications. London. (1972).
  3. Whelan, R. L., Abramson, D., Kim, D. S., Hashmi, H. F. Diversion colitis. A prospective study. Surg Endosc. 8, 19-24 (1994).
  4. Haas, P. A., Fox, T. A., Szilagy, E. J. Endoscopic examination of the colon and rectum distal to a colostomy. Am J Gastroenterol. 85, 850-854 (1990).
  5. Valatas, V., Bamias, G., Kolios, G. Experimental colitis models: Insights into the pathogenesis of inflammatory bowel disease and translational issues. Eur J Pharmacol. 759, 253-264 (2015).
  6. Kleinwort, A., Döring, P., Hackbarth, C., Heidecke, C. D., Schulze, T. Deviation of the Fecal Stream in Colonic Bowel Segments Results in Increased Numbers of Isolated Lymphoid Follicles in the Submucosal Compartment in a Novel Murine Model of Diversion Colitis. Biomed Res Int. 2017, 13(2017).
  7. Tangjarukij, C., Navasumrit, P., Zelikoff, J. T., Ruchirawat, M. The effects of pyridoxine deficiency and supplementation on hematological profiles, lymphocyte function, and hepatic cytochrome P450 in B6C3F1 mice. J Immunotoxicol. 6, 147-160 (2009).
  8. Soave, O., Brand, C. D. Coprophagy in animals: a review. Cornell Vet. 81, 357-364 (1991).
  9. Ebino, K. Y., Yoshinaga, K., Suwa, T., Kuwabara, Y., Takahashi, K. W. Effects of prevention of coprophagy on pregnant mice--is coprophagy beneficial on a balanced diet. Jikken Dobutsu. 38, 245-252 (1989).
  10. Babickova, J., Tothova, L., Lengyelova, E., Bartonova, A., Hodosy, J., Gardlik, R., Celec, P. Sex Differences in Experimentally Induced Colitis in Mice: a Role for Estrogens. Inflammation. 38, 1996-2006 (2015).
  11. Lee, S. M., Kim, N., Son, H. J., Park, J. H., Nam, R. H., Ham, M. H., Choi, D., Sohn, S. H., Shin, E., Hwang, Y. J., et al. The Effect of Sex on the Azoxymethane/Dextran Sulfate Sodium-treated Mice Model of Colon Cancer. J Cancer Prev. 21, 271-278 (2016).
  12. Angele, M. K., Pratschke, S., Hubbard, W. J., Chaudry, I. H. Gender differences in sepsis: cardiovascular and immunological aspects. Virulence. 5, 12-19 (2013).
  13. Brown, R. Z. Social Behaviour, reproduction, and population changes in the house mouse (Mus musculus L). Eccological Monographs. 23, 788-795 (1953).
  14. Poole, T. B., Morgan, H. D. R. Differences in aggressive behaviour betweeen male mice (Mus musculus L.) in colonies of different sizes. Animal Behaviour. 21, 788-795 (1973).
  15. Pasquarelli, N., Voehringer, P., Henke, J., Ferger, B. Effect of a change in housing conditions on body weight, behavior and brain neurotransmitters in male C57BL/6J mice. Behav Brain Res. 333, 35-42 (2017).
  16. Langgartner, D., Foertsch, S., Fuchsl, A. M., Reber, S. O. Light and water are not simple conditions: fine tuning of animal housing in male C57BL/6 mice. Stress. 20, 10-18 (2017).
  17. Nicholson, A., Malcolm, R. D., Russ, P. L., Cough, K., Touma, C., Palme, R., Wiles, M. V. The response of C57BL/6J and BALB/cJ mice to increased housing density. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48, 740-753 (2009).
  18. Buchler, G., Wos-Oxley, M. L., Smoczek, A., Zschemisch, N. H., Neumann, D., Pieper, D. H., Hedrich, H. J., Bleich, A. Strain-specific colitis susceptibility in IL10-deficient mice depends on complex gut microbiota-host interactions. Inflamm Bowel Dis. 18, 943-954 (2012).
  19. Nakanishi, M., Tazawa, H., Tsuchiya, N., Sugimura, T., Tanaka, T., Nakagama, H. Mouse strain differences in inflammatory responses of colonic mucosa induced by dextran sulfate sodium cause differential susceptibility to PhIP-induced large bowel carcinogenesis. Cancer Sci. 98, 1157-1163 (2007).
  20. Mahler, M., Bristol, I. J., Leiter, E. H., Workman, A. E., Birkenmeier, E. H., Elson, C. O., Sundberg, J. P. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274, 544-551 (1998).
  21. Mekada, K., Abe, K., Murakami, A., Nakamura, S., Nakata, H., Moriwaki, K., Obata, Y., Yoshiki, A. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58, 141-149 (2009).
  22. Sellers, R. S., Clifford, C. B., Treuting, P. M., Brayton, C. Immunological variation between inbred laboratory mouse strains: points to consider in phenotyping genetically immunomodified mice. Vet Pathol. 49, 32-43 (2012).
  23. Mills, C. D., Kincaid, K., Alt, J. M., Heilman, M. J., Hill, A. M. M-1/M-2 macrophages and the Th1/Th2 paradigm. J Immunol. 164, 6166-6173 (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Отведение фекальных массмодель колитахирургический протоколиммунная системавзаимодействие с микробиомомгистологические особенностилимфоидные фолликулы
Мышиных дистальной колостомы, Роман модель колита утечки в мышей C57BL/6
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.