Методическая статья

Эффективное поколения поджелудочной железы/двенадцатиперстную кишку гомеобокс белка 1+ задняя прародителями Передняя кишка/поджелудочной железы от hPSCs в культурах адгезии

5.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57641

⸱

27 марта 2019 г.

 ,  ,  , 
1Center for iPS Cell Research and Application (CiRA), Kyoto University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем подробный протокол дифференцировать человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) в поджелудочной железы/двенадцатиперстную кишку гомеобокс белка 1+ (PDX1+) клетки для поколения поджелудочной железы линий на основе роста монослоя-колонии типа отделить одиночных клеток. Этот метод подходит для производства однородных клеток hPSC производные, генетические манипуляции и скрининг.

Аннотация

Человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC)-производных клеток поджелудочной железы являются перспективный источник клеток для регенеративной медицины и платформу для изучения процессов человеческого развития. Шагам направлены дифференциации, резюмирует процессов развития является одним из основных способов создания клеток поджелудочной железы, включая поджелудочной железы/двенадцатиперстную кишку гомеобокс белка 1+ (PDX1+) поджелудочной железы прогениторных клеток. Обычные протоколы инициировать дифференциация с небольшими колониями вскоре после прохождения. Однако, в состоянии колоний или агрегатов, клетки подвержены неоднородностей, которые могут препятствовать дифференциации PDX1+ клеток. Здесь мы представляем подробный протокол дифференцировать hPSCs в PDX1+ клеток. Протокол состоит из четырех этапов и инициирует дифференциация по посевной диссоциированных одиночных клеток. Индукции SOX17+ окончательного эндодермы клеток последовал выражение двух примитивных кишки трубки маркеров, HNF1β и HNF4α и возможной дифференциации в PDX1+ клеток. Настоящий Протокол обеспечивает удобство в обращении и может улучшить и стабилизировать эффективность дифференциации некоторые hPSC линии, которые ранее были обнаружены неэффективно дифференцироваться в эндодермы линий или PDX1+ клеток.

Введение

Поджелудочной железы в основном состоит из эндокринной и экзокринной клеток, и его дисфункции или перегрузка вызывает несколько заболеваний, таких как панкреатит, сахарный диабет и рак поджелудочной железы. Для выяснения патогенеза pancreatopathy, это необходимо для анализа процесса развития и функции клеток поджелудочной железы. Кроме того стабильные ячейки поставок с надежным качеством требуется учредить терапия добавок ткани клеток. Человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC)-производных поджелудочной железы клетки перспективный источник клеток для этих целей, и дифференциация протокол к клеток поджелудочной железы был интенсивно изучали1,2,3, 4. Последние достижения в в пробирке генерации клеток поджелудочной железы β имитировать генерации β-клеток взрослого человека, и эти клетки шоу терапевтической эффективности после имплантации в диабетической модели мышей2,3. Кроме того анализ β-клеток, генерируется индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) здоровых и тип 1 диабет пациентов доноров показал не функциональные различия, включая когда в условиях стресса5. Кроме того болезнь фенотипов были частично воспроизведены в искусственных клеток поджелудочной железы с пациента производные iPSCs или hPSCs, укрывательство генетические мутации в том же сайте, что пациенты6,7.

Для генерации клеток поджелудочной железы от hPSCs, используется поэтапный направленного дифференцирования, которая повторяет процессы развития. Поджелудочной железы является производным из энтодермы слоя раннего эмбриона, который выражает секс определение региона Y-бокс 17 (SOX17) и forkhead ящик А2 (FOXA2)8. Основываясь на исследованиях мыши, эндодермы слой образует примитивных кишки трубка, которая характеризуется выражением гепатоцит ядерного фактора 1-бета (Hnf1β) и гепатоцит ядерного фактора 4-альфа (Hnf4α). Примитивных кишки трубка удлиняется и развивается в органов дыхания и желудочно-кишечного тракта. После удлинения, передняя задняя кишка область становится регионе предполагаемого поджелудочной железы, как отмечено выражением transcriptional фактор поджелудочной железы/двенадцатиперстную кишку гомеобокс белка 1 (PDX1)8,9,10. Спинной и брюшной части PDX1+ кишки трубы утолщаются формы поджелудочной железы почки, которые отмечены одним выражением поджелудочной железы транскрипционного фактора 1 субблок альфа (PTF1A) и НК6 гомеобокс 18,(NKX6.1)11. Это выражение началу морфологических поджелудочной железы органогенеза. Поджелудочной железы эндодермы клеток, которые являются компонентами поджелудочной железы бутоны, формируют разветвленную сеть трубчатых эпителиальных структур12 и в конечном итоге дифференцироваться в эндокринной и экзокринной клетки, в том числе секреции инсулина β-клетками и Глюкагон секретирующих α-клетки. Выражение PDX1 обнаружен первый в регионе предполагаемого поджелудочной железы, который затем наблюдается на протяжении всего развития поджелудочной железы и показывает локализации для β - и δ-клетки9,,1314. Хотя Pdx1+ область ячейки, которая не выразить Ptf1a или Nkx6.1 отличает в желудка антрального, двенадцатиперстной кишки, кишечной клетки в середине на поздней стадии развития в мышей9, PDX1 и внепеченочных желчных протоков+ клетки, считаются прародителями поджелудочной железы на ранней стадии развития в организме человека.

Здесь мы представляем подробный протокол дифференцировать hPSCs в PDX1+ клетки для поколения поджелудочной железы линий. Дифференциация инициирует протокол путем заполнения отрыве одной клетки15,16,17. Как правило недифференцированные hPSCs поддерживаются как колоний или агрегаты клеток в суспензии или адгезии. В результате большинство протоколов инициировать дифференциация вскоре после пассированый. Однако, в состоянии колоний или агрегатов, клетки подвержены пространственных и transcriptional неоднородностей18,19,20,21,22, которые могли бы воспрепятствовать Первый шаг дифференциации в окончательное энтодермы следуют неэффективных дифференциации в PDX1+ клеток. Настоящий Протокол может предложить управляемость улучшить и стабилизировать эффективность дифференциации некоторые hPSC линии, которые были ранее признаны дифференцировать неэффективно эндодермы линий и PDX1+ клеток23, 24 , 25.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эксперименты с использованием hPSCs были утверждены Комитетом по этике Департамента медицины и высшая школа медицины, Университет Киото.

1. Подготовка материалов

Примечание: Подготовьте все средства массовой информации и реагенты для культуры клеток в стерильных условиях. Разминка базовой культуры СМИ до комнатной температуры (RT) перед использованием. Средний для дифференциации используется в течение 6 часов на RT. детали реагентов, перечислены в Таблице материалов.

  1. Дифференциация (рис. 1A)
    1. Средний этап 1A: передачи среднего RPMI 1640 в трубку с помощью пипетки. Добавьте сыворотки бесплатные дополнения, activin A, CHIR99021 и Y-27632 в концентрации 1 x, 100 нг/мл, 3 мкм и 10 мкм, соответственно.
    2. Средний этап 1B: передачи среднего RPMI 1640 в трубку с помощью пипетки. Добавьте в сыворотке бесплатные дополнения, activin A и CHIR99021 в концентрации 100 нг/мл, 1 x, ≤1 мкм, соответственно.
      Примечание: Концентрация CHIR99021 должна быть ниже, чем средний этап 1A и добавление не является необходимым, но она увеличивает номер ячейки.
    3. Средний этап 2: средний MEM улучшение передачи (ИМЭМ) в трубку с помощью пипетки. Добавьте сыворотки бесплатные дополнения и фактор роста кератиноцитов (кгс) в концентрации 0,5 x и 50 нг/мл, соответственно.
    4. Средний этап 3: ИМЭМ теплоносителя в трубку с помощью пипетки. Добавить сыворотки бесплатные дополнения, кгс, БАШКА, 3-кето-N-аминоэтил N'- aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (CYC) и 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic кислоты (TTNPB), очистка концентрации 0,5 x, 50 нг/мл, 100 нг/мл, 0,5 мкм и 10 Нм, соответственно.
  2. Проточная цитометрия (FCM)
    1. 1 x Permeabilization/мыть буфера: передачи воды в трубку с пипеткой. Добавьте Permeabilization/мыть буфера, пипетки в концентрации 1 x.
    2. ТСМ, преграждая разрешение: передачи 1 x Permeabilization/мыть буфера в трубку с пипеткой. Добавьте осла сыворотки, пипетки в концентрации 2% (vol/vol).
  3. Иммуноокрашивания
    1. Блокирование решение: передача Дульбекко Phosphate-Buffered солевой (DPBS) в трубку с пипеткой. Добавьте осла сыворотки и Тритон X, пипетки в концентрации 5% (vol/vol) и 0,4% (vol/vol), соответственно.

2. hPSC дифференциации в задней прародителями Передняя кишка клеток/поджелудочной железы (PDX1+ клеток)

Примечание: Провести все процедуры с использованием стерильных методов. hPSCs ведутся на 6-ну плиты, покрытой синтетические поверхности материала для hPSCs с hPSC среднего обслуживания согласно инструкции производителя17,26. Когда клетки достигают 50-80% confluency (Стадия 0) использовать их для дифференциации.

  1. Подготовка матрицы, покрытыми базальной мембраны.
    1. Передачи 6 мл RPMI 1640 (4 °C) в пробирку охлаждают до 4 °C на льду. Добавить 2 мг базальной мембраны матрицы (4 °C) с охлаждением 1 мл-наконечники и перемешать хорошо, нежный закупорить сделать матрица базальной мембраны 0,33 мг/мл.
    2. Переводом 2 мл разбавленной базальной мембраны матрицы для каждой скважины 6-ну клетки культуры пластин пипетки. Поместите пластины при 37 °C 60-90 мин в инкубаторе. Потом Держите пластины на RT до использования (в течение 3 ч).
  2. Семена hPSCs и инициировать дифференциация для окончательного эндодермы (стадия 1A).
    1. Аспирационная используемым средством и добавьте 2 мл 0,5 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (RT) за хорошо дозатор мыть hPSCs культивировали в 6-ну пластины.
    2. Аспирационная 0,5 мм ЭДТА и добавить 2 мл 0,5 мм ЭДТА в колодец с пипеткой. Инкубируйте пластины при 37 °C за 5 мин.
    3. Аспирационная 0,5 мм ЭДТА и добавьте 1 mL hPSC обслуживания среды на RT, дополнена 10 мкм Y-27632 на хорошо с пипеткой. Пипетка аккуратно, но быстро сдуть придает клетки на тарелках и разъединять скомканным клетки в одной клетки. Не пузырь суспензию клеток во время закупорить.
    4. Передача суспензию клеток в 50 мл пластиковых пробирок, содержащих 4 мл hPSC обслуживания среды на RT, дополнена 10 мкм Y-27632. Аккуратно Пипетка суспензию клеток.
    5. Подсчет клеток в суспензии клеток, используя процедуру исключения пятно Трипановый синий.
      1. Смесь 15 мкл суспензии клеток и 15 мкл Трипановый синий в трубку.
      2. Передача 10 мкл суспензии клеток, разбавляют Трипановый синий ячейку подсчета слайдов в двух экземплярах по 10 мкл пипетки.
      3. Подсчитать ячейки номер с автоматической клеток счетчиком и рассчитать плотность клеток в суспензии клеток. Обычно является жизнеспособность > 98%.
    6. Алиготе суспензию клеток в пластиковых пробирок 50 мл на 1-1,5 х 106 клеток на хорошо 6-ну пластин (1-1,5 x 105 клеток/см2).
    7. Центрифуга Тюбик 50 мл на 200 x g на RT на 5 мин.
    8. Аспирационная супернатанта, с помощью пипетки и Ресуспензируйте клеток в 1 мл средний этап 1A (RT) за хорошо. Аккуратно Пипетка суспензию клеток и добавить еще 1 мл этап 1A среднего (общего, 2 мл на хорошо).
    9. Аспирационная разреженных базальной мембраны матрицы в скважинах пластин культуры клеток, подготовленный на шаге 2.1.2 1000 мкл пипетки. Немедленно приступить к следующему шагу.
    10. Аккуратно Пипетка суспензию клеток в шаге 2.2.8 снова. Сразу же после перемешивания, передача суспензию клеток (2 мл) в каждый хорошо 6-ну плиты. Крышка с алюминиевой фольги для защиты пластину от света. Место пластину в чистой скамейке в РТ за 10-15 мин.
      Примечание: Не перемещайте пластины после посева.
    11. Осторожно поместите пластины в 37 °C, 5% CO2 инкубатора (увлажненные атмосферы) и культура за 24 ч.
      Примечание: Не трясите пластины после посева.
  3. Индуцировать дифференцировку в окончательное эндодермы (этап 1B).
    1. Аспирационная используемым средством и добавить 2 мл DPBS скважин, пипетки. Повторите аспирации и добавление DPBS один раз.
      Примечание: Чтобы удалить все мертвые клетки однослойная, осторожно встряхните пластину перед каждой аспирации.
    2. Аспирационная используется DPBS, пипетки и добавить 4 мл средний этап 1B (37 °C) за хорошо. Осторожно поместите пластины в инкубатора 37 °C (увлажненные атмосферу 5% CO2) и культуры за 48 ч.
    3. Аспирационная используемым средством и добавить 2 мл DPBS колодец, пипетки. Повторите аспирации и добавление DPBS один раз.
      Примечание: Удалите мертвые клетки от монослоя, мягкий сотрясение перед каждой аспирации.
    4. Аспирационная используется DPBS, дозаторов и добавить 4 мл средний этап 1B (37 °C) за хорошо. Осторожно поместите пластины в инкубатор (37 °C, увлажненные атмосферу 5% CO2) и культура за 24 ч.
  4. Индуцировать дифференцировку в примитивных кишки трубки (этап 2).
    1. Аспирационная используемым средством и добавить 2 мл DPBS колодец, пипетки.
      Примечание: Удалите мертвые клетки от монослоя, мягкий сотрясение перед каждой аспирации.
    2. Аспирационная используется DPBS, пипетки и добавить 4 мл 2 этап среднего (37 °C) в колодец. Место пластину в инкубатор (37 °C, увлажненные атмосферу 5% CO2) и культуру на 4 дня.
  5. Побудить дифференцировку в PDX1+ клеток (этап 3).
    1. Аспирационная используемым средством и добавить 2 мл DPBS колодец, пипетки. Повторите аспирации и добавление DPBS один раз.
    2. Аспирационная используется DPBS, пипетки и добавить 4 мл среды (37 °C) этап 3 за хорошо. Место пластину в инкубатор (37 °C, увлажненные атмосферу 5% CO2) и культуру для 3 дней.
  6. Индуцировать дифференцировку в эндокринных клеток поджелудочной железы.
    1. Выполните NKX6.1+ клеток индукции (этап 4, 8 дней) следуют эндокринных клеток индукции (этап 5, за 12 дней) с ранее описанные протоколы3,16,26. Характеризуют и проверить эндокринной клеточная дифференцировка иммуноокрашивания и количественных реального времени обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (qRT ПЦР) анализа.
      Примечание: Обратитесь к Тойода et al.16 и26 Кимура et al. подробное описание экспериментальных процедур. Обратитесь в таблице 1 для последовательностей праймера для qRT ПЦР анализа.

3. проточной цитометрии (FCM)

  1. Аспирационная используемым средством и добавить 2 мл 0,5 мм ЭДТА в колодец с пипеткой. Повторите аспирации и добавлением 0,5 мм ЭДТА один раз.
    Примечание: Встряхните пластину осторожно, чтобы удалить любые отмершие клетки от монослоя клеток перед каждой аспирации.
  2. Чтобы разбить ячейки (приблизительно 3-6 × 106 клеток в колодец), добавить 2 мл 0,25% трипсина, содержащий 0,5 мм ЭДТА в колодец. Инкубируйте пластины при 37 °C за 5-10 мин.
  3. Пипетка аккуратно, но быстро отделить скомканным клетки в одной клетки. Не пузырь суспензию клеток во время закупорить.
  4. Добавить 8-10 мл базовой среды (RPMI 1640 или ИМЭМ, RT) содержащий 0,5 x сыворотки бесплатные дополнения и 10 мкм Y-27632 за хорошо и перемешать суспензию клеток. Перенесите суспензию клеток в пластиковых пробирок.
  5. Центрифуга трубки на 300 x g на RT на 5 мин.
  6. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте клетки с 2 мл 0,5 мм ЭДТА (RT). Аккуратно Пипетка суспензию клеток.
  7. Центрифуга трубки на 300 x g на RT на 5 мин.
  8. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте клетки с 100 мкл буфера фиксации и permeabilization за 106 клеток под капотом. Аккуратно Пипетка суспензию клеток под капотом. Держите трубку на RT 30 мин.
  9. Центрифуга трубки на 400 x g на RT на 5 мин.
  10. Аспирационная супернатант под капотом и Ресуспензируйте клетки с 500 мкл ТСМ блокирования решения за 106 клеток. Аккуратно Пипетка суспензию клеток. Держите трубку на RT 30 мин.
  11. Передача 50 мкл суспензии клеток в трубку (приблизительно 1 х 105 клеток). Центрифуга трубки на 400 x g на RT на 5 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки с 100 мкл разбавленного основное антитело (см. Таблицу материалы) в FCM преграждая разрешение и Инкубируйте на 4 °C для > 16 h.
  12. Центрифуга трубки на 400 x g на RT 5 минут удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки с 180 мкл 1 x Пермь/мыть буфера.
  13. Центрифуга трубки на 400 x g на RT на 5 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки с 100 мкл разбавленного вторичные антитела (см. Таблицу материалы) в FCM, преграждая разрешение. Инкубировать клетки на RT 60 мин или на 4 °C для > 16 h с защитой от света.
  14. Центрифуга трубки на 400 x g на RT 5 минут удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки с 180 мкл 1 x Пермь/мыть буфера.
  15. Центрифуга трубку g 400 x на RT на 5 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки с 180 мкл 2% сыворотки осел в DPBS.
  16. Фильтр суспензию клеток путем передачи на 5 мл круглая труба внизу полистирола с ячейки сита (35 мкм нейлоновая сетка) и хранить при 4 °C с защитой от света до анализа.
  17. Анализировать доля положительно окрашенных клеток потока цитометр27.

4. иммуноокрашивания

  1. Аспирационная используемым средством и добавить 2 мл DPBS колодец, пипетки. Повторите аспирации и добавление DPBS один раз.
    Примечание: Осторожно встряхните пластину для удаления любых мертвых клеток из монослоя клеток перед каждой аспирации.
  2. Добавить 2 мл параформальдегида 4% (PFA) (4 °C) в колодец, Пипетка под капотом. Держите пластины на 4 °C в течение 20 мин.
  3. Удалите PFA, Пипетка под капотом. Добавьте 2 мл DPBS на RT в колодец, Пипетка под капотом. Повторите аспирации и добавление DPBS один раз.
  4. Добавить 2 мл раствора блокировки на хорошо и сохранить пластину на RT 30 мин.
  5. Аспирационная используемое решение и добавить 1 мл основное антитело (см. Таблицу материалы) в блокировании раствора на хорошо. Инкубируйте на RT 60 мин или на 4 °C для > 16 h.
  6. Аспирационная используемое решение, добавить 2 мл DPBS, содержащих 0,4% Тритон X-100 и Инкубируйте на RT на 10 мин повторить стремление, добавлением раствора и инкубации один раз.
  7. Аспирационная используемое решение и добавьте 1 mL вторичные антитела (см. Таблицу материалы) в блокировании раствора на хорошо. Инкубируйте на RT 60 мин с защитой от света.
  8. Аспирационная используемое решение, добавить 2 мл DPBS, содержащих 0,4% Тритон X-100 (RT) и Инкубируйте на RT на 5 мин с защитой от света. Повторите аспирации, добавлением раствора и инкубации в два раза.
  9. Возьмите микроскопии для изучения эффективности дифференциация под микроскопом флуоресценции28.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Распространение hiPSCs (585A129,30) конденсируются и образуют однородную монослоя (Рисунок 1B), который подходит для дифференциации. Недифференцированные hiPSCs (Стадия 0) отделить и вновь посеяны как единичных клеток при плотностях низкой ячейки (1-1,5 x 105 клеток/см2). В течение 1 ч клетки прикрепляются к пластине и начать, чтобы показать выступ. День 1 клетки распространились и хорошо распределены на 80-90% ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Поколение PDX1+ клетки состоит из нескольких шагов; Таким образом крайне важно для лечения клетки в соответствующее время. Среди шагов эффективности индукции окончательного энтодермы во многом влияет на окончательный индукции эффективность, возможно, помехи от других загрязняющих клеток линии (то есть, мезодермы и эктодермы), которые могут размножаться и/или выделяют факторы, которые нарушить конкретные различия. Если доля SOX17+ клеток ниже, чем 80% на день 4 (этап 1B), эффективной индукции к PDX1<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана в части финансирования от японского общества для поощрения науки (JSP) через Scientific Research (C) (JSP-страницы KAKENHI Грант Number15K09385 и 18 K 08510) т.т., и субсидий для страниц JSP научных сотрудников (JSP-страницы KAKENHI номер гранта 17J07622) а.к., и Японское агентство для медицинских исследований и развития (AMED) через его исследования «Основной центр iPS исследования клеток, исследовательский центр сети для реализации регенеративной медицины» предоставить K.O. Авторы благодарят д-р Питер Karagiannis для чтения рукопись.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
3-кето-N-аминоэтил-N′-аминокапроилдигидрокоричный циклопаминToronto Research ChemicalsK171000CYC
4-[(E)-2-(5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-2-нафталенил)-1-пропенил]-бензойная кислотаSanta Cruz BiotechnologySC-203303TTNPB
50 мл конические стерильные полипропиленовые центрифужные пробиркиThermo Fisher Scientific339652
Антитело против CDX2 [EPR2764Y]AbcamAb76541Anti-CDX2, × 1/1000 разведение
B-27 Supplement (50 ×)Thermo Fisher Scientific17504-044Бессывороточная добавка
BD FACSAria II Сортировщик клетокBD BiosciencesДля проточной цитометрии
Биомедицинский морозильникSANYOMDF-U538Для -30 ° C
Хранение Предметные стекла для подсчета клеток для счетчика клеток TC10/TC20, двухкамерныйBIO-RAD1450011Счетное стекло
МНОГОЛУНОЧНЫЙ ПЛАНШЕТ ДЛЯ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ, 6 ЛУНОК, PS, ПРОЗРАЧНЫЙGreiner Bio-one657165Для дифференцировочной культуры/6-луночный планшет
ЦентрифугаTOMYAX-310Для культивирования клеток
ЦентрифугаTOMYMX-305Для ОТ-кПЦР
CHIR99021Axon MedchemAxon 1386
CLEAN BENCHSHOWA KAGAKU S-1601PRVЧистый стенд
Corning CellBIND 6-луночный планшетCorning3335Для безфидерной культуры hPSCs/6-луночный планшет
Corning Matrigel Базальная мембрана Фактор роста Сниженный Corning354230Базальная мембранная матрица
Corning Synthemax II-SC SubstrateCorning3535Для безфидерной культуры hPSCs/синтетический поверхностный материал для hPSCs
КриостатLeicaLeica CM1510 SДля иммуноокрашивания агрегатов.
Cytofix/Cytoperm KitBecton Dickinson554714Perm/Wash buffer is  Буфер для пермеабилизации/промывки. Цитофикс/Цитопермский буфер является буфером фиксации и пермеабилизации.
Dako penDakoS2002Для иммуноокрашивания агрегатов
dNTP mix (10 mM)Thermo Fisher Scientific18427-088Для RT-qPCR
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Перекрестно-адсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA11055Вторичное антитело, × 1/500 разведение
Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Высокоадсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10036Вторичное антитело, × 1/500 dilution
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Высокоадсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10040Вторичное антитело, × 1/500 разведение
Сыворотка ослаMerck MilliporeS30Сыворотка осла
D-PBS(-) без Ca или MgNacalai tesque14249-95DPBS
Essential 8 MediumThermo Fisher ScientificA1517001Для безпитательной культуры hPSCs/среды для поддержания hPSCs
Falcon 5 мл с круглым дном Пробирка из полистирола, с сетчатым фильтром Защелкивающаяся крышкаCorning3522355 мл полистирольная трубка с круглым дном и сетчатым фильтром
Фильтрующий наконечник, 1,000 &; LWatoson124-1000SИспользование вместе с пипетками
Filter Tip, 20 & микро; LWatoson124-P20SИспользование вместе с пипетками
Filter Tip, 200 &; LWatoson124-P200SИспользование совместно с пипетками
Флуоресцентный микроскопKeyenceBZ-X700Для иммуноокрашивания
Forma Steri-Cycle CO2 инкубаторThermo Fisher Scientific370AИнкубатор
HNF-1β Антитело (C-20)Santa Cruz Biotechnologysc-7411Anti-HNF1β, × 1/200 разведение
HNF-4α Антитело (H-171)Santa Cruz Biotechnologysc-8987Anti-HNF4α, × 1/200 разведение
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570Для окрашивания ядра, × 1/200 разведение
общей РНК поджелудочной железы человекаAmbionAM7954Для RT-qPCR
Антитела человека PDX-1/IPF1 R& D SystemsAF2419Anti-PDX1, козий IgG, & 1/200 разведение
человеческого антитела SOX17R& D SystemsAF1924Anti-SOX17, × 1/200 разбавление
Улучшенный MEM Цинк Вариант средний ThermoFisher Scientific10373-017iMEM
Инкубационная камераCosmo Bio10DOДля иммуноокрашивания агрегатов
Латексные смотровые перчаткиAdachi
MAS с покрытием слайдовое стеклоСтекло Matsunami83-1881Для иммуноокрашивание агрегатов
MicroAmp Fast 96-well Реакционная пластинаApplied Biosystems/Thermo Fisher Scientific4346907Для ОТ-кПЦР
МикроскопOlympusCKX41N-31PHPДля культивирования клеток
МикропробиркаWatoson131-515CS
Моноклональный анти-&альфа;-фетопротеинSIGMAA8452Анти-AFP, &кратное разведение 1/200
Nanodrop 8000Thermo Fisher Scientificдля RT-qPCR
Oligo dTFASMACCustom Made Oligo Для ОТ-кПЦР последовательности используется "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT"
Параформальдегид, порошокNacalai tesque26126-54PFA, фиксатор, разведенный в DPBS
Фармацевтический холодильникSANYOMPR-514For 4° C хранение
PIPETMAN P ПипеткаGILSON
Рекомбинантная человеческая KGF/FGF-7R& D Systems251-KGKGF
Рекомбинантный человеческий NogginPeproTech120-10CNOGGIN
Рекомбинантный активин человека/мыши/крысы Активин А R& D Systems338-ACActivin A
ReverTra Ace (100 U/μ L)TOYOBOTRT-101для ОТ-кПЦР
РНКазный набор ДНКазы (50)QIAGEN79254для ОТ-кПЦР
RNeasy Mini KitQIAGEN74104для ОТ-кПЦР
RPMI 1640 с L-GLNNacalai tesque30264-85RPMI 1640
Герметизирующая пленка для реального времениTakaraNJ500для ОТ-кПЦР
Серологические пипетки 10 млCostar/Corning4488Для культивирования клеток
Серологические пипетки 25 млCostar/Corning4489Для культивирования клеток
Серологические пипетки 5 млCostar/Corning4487Для культивирования клеток
Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAbCell signaling3579SAnti-SOX2, × 1/200 разведение
StepOnePlusApplied Biosystems/Thermo Fisher ScientificFor RT-qPCR
SucroseNacalai tesque30406-25Для иммуноокрашивания агрегатов
TB Green
Premix Ex Taq II 		TakaraRR820Bдля RT-qPCR
TC20 Автоматизированный счетчик клетокBIO-RAD1450101J1Автоматический счетчик клеток
Tissue-Tek OCT соединение 4583 Sakura Finetechnical4583Для иммуноокрашивания агрегатов
Tissue-Tek Cryomold Molds/AdaptersSakura Finetechnical4566Для иммуноокрашивания агрегатов
Triton X-100Nacalai tesque35501-15
Trypan BlueBIO-RAD1450021
Ультрахолодный морозильникSANYOMDF-U33VДля -80 ° C хранение
UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher Scientific15575-038Разбавить DPBS для приготовления 0,5 мМ EDTA
Veriti Thermal CyclerApplied Biosystems/Thermo Fisher ScientificFor RT-qPCR
Y-27632Wako251-00514

Ссылки

  1. D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
  2. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  3. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  4. Kondo, Y., Toyoda, T., Inagaki, N., Osafune, K. iPSC technology-based regenerative therapy for diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 9 (2), 234-243 (2017).
  5. Millman, J. R., et al. Generation of stem cell-derived beta-cells from patients with type 1 diabetes. Nature Communications. 7, 11463(2016).
  6. Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
  7. Hosokawa, Y., et al. Insulin-producing cells derived from 'induced pluripotent stem cells' of patients with fulminant type 1 diabetes: Vulnerability to cytokine insults and increased expression of apoptosis-related genes. Journal of Diabetes Investigation. , (2017).
  8. Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
  9. Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
  10. Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
  11. Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
  12. Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
  13. Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochemical Journal. 310 (Pt 3), 997-1003 (1995).
  14. Riedel, M. J., et al. Immunohistochemical characterisation of cells co-producing insulin and glucagon in the developing human pancreas. Diabetologia. 55 (2), 372-381 (2012).
  15. Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367(2013).
  16. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  17. Toyoda, T., et al. Rho-Associated Kinases and Non-muscle Myosin IIs Inhibit the Differentiation of Human iPSCs to Pancreatic Endoderm. Stem Cell Reports. 9 (2), 419-428 (2017).
  18. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
  19. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  20. Nguyen, Q. H., et al. Single-cell RNA-seq of human induced pluripotent stem cells reveals cellular heterogeneity and cell state transitions between subpopulations. Genome Research. 28 (7), 1053-1066 (2018).
  21. Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121 (3), 1217-1221 (2011).
  22. Rosowski, K. A., Mertz, A. F., Norcross, S., Dufresne, E. R., Horsley, V. Edges of human embryonic stem cell colonies display distinct mechanical properties and differentiation potential. Scientific Reports. 5, 14218(2015).
  23. Torres-Padilla, M. E., Chambers, I. Transcription factor heterogeneity in pluripotent stem cells: a stochastic advantage. Development. 141 (11), 2173-2181 (2014).
  24. Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 14 (6), 357-368 (2013).
  25. Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
  26. Kimura, A., et al. Small molecule AT7867 proliferates PDX1-expressing pancreatic progenitor cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 24, 61-68 (2017).
  27. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010(2014).
  28. Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), (2015).
  29. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  30. Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 109 (31), 12538-12543 (2012).
  31. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  32. Suemori, H., et al. Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochemical and Biophysical Research Communication. 345 (3), 926-932 (2006).
  33. Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), e82076(2013).
  34. Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
  35. Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
  36. Kelly, O. G., et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).
  37. Hohwieler, M., et al. Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling. Gut. 66 (3), 473-486 (2017).
  38. Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture. Scientific Reports. 4, 4488(2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

PDX1

Похожие статьи