Методическая статья

Изоляции нижнечелюстной железы водохранилище содержимого из Bornean ' взрывающаяся муравьи (Formicidae) для анализа Volatilome GC-MS и MetaboliteDetector

DOI:

10.3791/57652

⸱

26 августа 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Analytical Chemistry, Department of Agrobiotechnology (IFA-Tulln), University of Natural Resources and Life Sciences Vienna (BOKU), Austria, 2Institute of Chemical, Environmental and Biological Engineering, TU Vienna, Austria, 3Department of Computational Biology of Infection Research, Helmholtz Centre for Infection Research, Germany, 4Institute for Biochemistry, Biotechnology and Bioinformatics, University of Technology (TU) Braunschweig, Germany, 52nd Zoological Department, Natural History Museum Vienna, Austria, 6Chemical Sciences, Universiti Brunei Darussalam, Brunei, 7Environmental and Life Sciences, Universiti Brunei Darussalam, Brunei

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Небольшие рабочие муравьи Colobopsis explodens разделяются изолировать воск как контент хранится в их гипертрофированной нижней челюсти железы резервуары для последующего жидкостной экстракции и анализа газовой хроматографии и масс-спектрометрии. Также описывается аннотации и определение летучих компонентов с открытым исходным кодом программного обеспечения MetaboliteDetector.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель этой рукописи – представить протокол описания Метаболомные анализ Bornean «взрывающаяся муравьи», принадлежащие к группе Colobopsis цилиндрический (COCY). Для этой цели модель вид C. explodens является используемым. Муравьи, принадлежащих к касте несовершеннолетнего работника обладают отличительной гипертрофированные челюсти желез (MGs). В территориальной бою они используют вязкой содержимое их расширенного нижнечелюстной железы водохранилищ (МИПР) убить соперника членистоногих в характерной суицидальных «взрывы» добровольное разрушение gastral кожного покрова (autothysis). Мы показываем рассечение рабочие муравьи этого вида для изоляции gastral часть содержания MGR воск как, а также список необходимые шаги, необходимые для экстракции растворителем в нем содержится летучих соединений с последующим газ хроматографии масс-спектрометрии (ГХ-МС) анализ и предполагаемым идентификации метаболитов, содержащиеся в экстракте. Рассечение процедура выполняется охлаждением условиях и без использования любого рассечение буферного раствора для сведения к минимуму изменений в химический состав содержимого MGR. После извлечения летучих метаболиты, содержащиеся в нем, на основе растворителя представлены необходимые шаги для анализа образцы через жидкость инъекция GC-MS. Наконец обработка данных и идентификации предполагаемого метаболит с использованием открытым исходным кодом программного обеспечения отображается MetaboliteDetector. С этим подходом профилирование и определение летучих метаболиты в МИПР муравьев, принадлежащих к COCY группы через GC-MS и MetaboliteDetector программного обеспечения станет возможным.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Общая цель процесса, представленные здесь является общее исследование химических составов в выделениях насекомых. Это делается с главной целью изучение экологической роли секреции в целом, или одного их соединений. Кроме того мы заинтересованы в расследовании метаболических, лежащие в основе соединений, которые содержатся в соответствующих выделениями. Особенно железы содержимое от муравьев (Hymenoptera, Formicidae) получили повышение интереса в последние годы, потому что они обеспечивают источники доселе неизведанное потенциально биологически активных соединений (клеи, противомикробных препаратов и т.д.)1, 2. небольшие рабочие муравьи некоторых видов, принадлежащих к группе COCY,3,,4 может предоставить такие соединения, содержащиеся в их гипертрофированной MGRs, которые простираются от ротовые Гастер5,6. Когда под угрозой предполагаемых врагов, незначительные работников C. explodens7 и некоторые связанные с этим, можно сделать видов использования их MGR содержание необычным способом: они пожертвовать собой сверлении их gastral стены, чтобы извлечь липкое содержание MGRs взрывом на противника, после чего предполагаемый противник находится под стражей и может даже умереть5,6,8,9. Цель развития и использование методов представленный здесь было помочь улучшить понимание химического состава и характера предварительно токсичных компонентов этой муравей секреции.

С этой целью мы представляем протокол для рассечения C. explodens рабочие муравьи получить gastral часть их содержания MGR воск как с последующим жидкостной экстракции и анализ GC-MS.

GC-MS анализ является одним из устоявшихся методов для профилирования и определения летучих метаболиты (volatilome) от насекомых. Типичный аналитов интереса к муравьи включают кутикулярного углеводородов10, semiochemicals11и в целом, соединений с биологической активности12. Образцы можно получить из всего животных или частей тела и жидкости, изолированные через рассечение насекомых13,14. Образец подготовки методы включают извлечение нем содержится метаболитов с использованием растворителей14 или headspace твердых фаза микроэкстракция (HS-SPME)15.

Метаболомные исследования важно, что образцы замораживаются быстро непосредственно после отбора проб, с тем чтобы свести к минимуму изменений в химический состав и количество соединений. Муравьи, используемые для этого исследования были убиты быстрое замораживание на месте в прохладном мешок с глубокой заморозки холодные компрессы. Образцы были затем хранить в морозильной камере-20 ° C, с помощью ориентированных на генератор электричество, прежде чем они были доставлены в лабораторию на сухой лед. Представленные здесь процедура диссекции предлагает возможность изолировать MGR содержимое без анализа всей ant или Гастер в целом, как это было сделано раньше для различных видов16,COCY17,18. Кроме того представленные протокол также позволяет прямой доступ и анализ окружающих желез и тканей, как яд желез (VG)5,8, Dufour железы (ГД)8или кишечника в другие биологические исследования, или Проверка возможных кросс загрязнений во время обработки или рассечение муравьев. Для сведения к минимуму изменений в химический состав MGR содержимого во время вскрытия, оттаивания образцов либо с помощью химических веществ, осуществляться на холодный компресс (-20 ° C), без использования каких-либо дополнительных буферов, был оптимизирован процесс вскрытия моющих растворов, или растворители. Образцы, полученные через этот метод подходит для ответа на количественные и качественные вопросы.

Анализ данных для целей предполагаемого метаболит аннотацию и идентификации осуществляется через открытое программное обеспечение MetaboliteDetector19, который был разработан для автоматического анализа данных на базе GC-MS метаболомики. Он обнаруживает один Ион пиков в хроматограм, выполняет шаг деконволюция и извлекает deconvoluted массы спектры химических соединений, содержащихся в анализируемых образцов. Предполагаемый идентификации соединений с MetaboliteDetector основано на индексе определяется удержания (RI; Kovats ри может рассчитываться автоматически программным обеспечением) а также сходство спектров deconvoluted массы. Ри и спектральные матч фактором может быть перепроверены против либо существующих справочных библиотек, (которые могут быть импортированы, если они находятся в общем формате NIST), или установленных собственную библиотеку. Это в соответствии с руководящими принципами (предполагаемый) составные идентификации предложила, например, путем химического анализа Рабочая группа (РГКА) метаболомики инициатива стандартов (MSI), где как минимум двух независимых и ортогональных данных по отношению к подлинным соединение (здесь срок хранения /RI (RT) и массовые спектр) проанализированы под одинаковых экспериментальных условиях предлагается при необходимости подтвердить Роман-метаболит идентификаций20.

Полный эксперимент проводится на содержание MGR видов модели COCY C. explodens, но шаги рассечение также может быть адаптирована к изолировать других желез, присутствующих в Гастер муравей. Кроме того хотя мы представляем протокол для всестороннего анализа volatilome MGR содержание, более общие части рабочего процесса, описывая добыча, GC-MS измерения и оценки данных может также использоваться для анализа и (предполагаемый) определение летучих метаболиты в целом.

Поскольку эксперименты, описанные в этой рукописи осуществляется на насекомых, не этические утверждения требуется. Полевые работы, выборки муравьев, а также их использования для публикации находятся в соответствии с руководящими принципами регулирования этот проект через Universiti Бруней, Бруней исследований и инновационный центр и Бруней Департамент лесного хозяйства, Бруней Даруссалам.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. сбор муравьев

  1. Соберите небольшие рабочие муравьи с использованием аспиратор (рис. 1).
  2. Сразу же после выборки, исправить муравьи путем быстрого замораживания при температуре-20 ° C и хранить их в этой или более низкой температуры до анализа.

2. изоляция MGR содержания и ГД от муравьев

  1. Перед рассечение муравьев Подготовьте следующие:
    1. Очистите стекло Петри и рассечение инструментов, с помощью смеси метанола воды (метанола/H2O; 1 + 1 v/v) и тканей.
      Предупреждение: Метанола является токсичным для людей. Всегда носите соответствующие перчатки, лабораторный халат и очки и выполнить очистку под вытяжного шкафа.
    2. Замораживание холодной пакет и стекла Петри до-20 ° C.
    3. Определение массы 1,5 мл флаконы короткие нити включая колпачки с перегородками силиконовые/политетрафторэтилена (ПТФЭ) и держать их на льду непосредственно рядом с микроскопом.
      Примечание: Выбор флакон образца является необязательным. Здесь MGR содержимое помещается непосредственно в охлажденный 1,5 мл флаконы из стекла. Пластмассы могут содержать соединений (например, фталаты), которые могут вызвать артефактов, которые мешают сигналы целевых метаболитов.
    4. Поместите пакет замороженных холодной в коробку из экструдированного пенополистирола. Поместите Петри блюдо на вершине холодной пакет и положить замороженные муравей в блюдо. Установите поле под микроскопом стерео. Настройте масштаб (20 – 40 X) и фокус до тех пор, пока весь муравьёв можно видеть ясно.
  2. Проверьте замороженных ant для целостности его gastral отсеков. Для вскрытия принять только муравьи с нетронутыми Гастер региона (рис. 2A, B). Исключите муравьи с плоскими gasters или следы закаленной MGR содержание на их поверхностях тела от дальнейшего анализа (рис. 2 c, D).
  3. Захватить выбранный муравей с одной парой штраф наконечником щипцы на propodeum (первый абдоминальный сегмент) и с другой парой щипцами в черешок (второй брюшной сегмент). Отсоедините регионе Гастер, осторожно потянув его от остальной части тела муравья (рис. 3A).
  4. Исправление Теперь разлученных муравей Гастер, удерживая его с острым концом щипцы на хвостике 4. С другой парой острым концом щипцов захватить хвостике 1 (расположен рядом с черешком) и осторожно удалите его, шелушение (рис. 3B). Повторите это также для тергитов 2 и 3 (рис. 3 c, D) до gastral часть МИПР (желтого цвета в C. explodens рабочие муравьи, но цвет мг содержание может варьироваться от белого над желтого до красного в других видов) является видимым для наиболее часть.
    Примечание: Путем удаления экзоскелет, мембраны MGR будут также частично удалены.
  5. С помощью иглы рассечение аккуратно удалите воск как содержимое парных MGRs, царапая их из gastral отсека (Рисунок 3E). Удаляйте только те части содержания MGR, которые могут быть изолированы без разрыва других желез, присутствующих в Гастер муравей. Если больше силы или усилия должны применяться для получения MGR содержание в целом, примите его неполного удаления (рис. 4).
  6. Возьмите содержимое MGR нежно прикасаясь к ним с кончика иглы рассечение, до тех пор, пока они держатся на него. Затем перенесите MGR содержимое в охлажденную 1.5 короткие нити флакон с известными масса.
    1. Чтобы удалить липкий MGR содержимое от кончика иглы рассечение, переместите кончик иглы к стенке флакона образца и смазать их на стену. Закройте флакон и поместите его на льду, до тех пор, пока следующий содержимое MGR изолированы.
  7. Чтобы позже проверить возможности перекрестного загрязнения образца содержимого MGR, соединений, поступающих из соседних ГД (раздел 6), соберите ГД от муравьев, в которых они до сих пор нетронутыми (Рисунок 4) и положить их в отдельном флаконе ВЭЖХ.
  8. Всегда очищайте Петри и рассечение инструментов с метанола/H2O (1 + 1 v/v), при изменении железы железы или муравей муравей.
  9. Для одного аналитической пробы объединить содержимое резервуара или железы несколько муравьев.
    Примечание: Количество желез или их содержимое, используется для одного аналитической пробы могут варьироваться в зависимости от планирования эксперимента. Здесь MGR содержимое или АРД пяти муравьев были объединены для получения одного аналитической пробы.

3.-экстракции растворителем изолированных железы содержимого

  1. Определение массы аналитической пробы (здесь, MGR содержимое или прилегающих желез пуле из пяти муравьев).
  2. Добавить ледяной высокой чистоты этилацетат (EtOAc) в постоянном соотношении 1:14 w/v и вихревой образцы для 5 минут охлаждения условиях; Здесь выступила на 7 ° C в термостатируемый лаборатории.
  3. Центрифугуйте образцы на 10 мин на 3820 g x 7 ° c и передачи supernatants (около 55 – 75 мкл для MGR контента получили выписку из пяти муравьев) в предварительно охлажденным 1,5 мл короткие нити флаконы содержащие 0,1 мл микро вставок. Плотно запечатать флаконы с колпачки, содержащих отверстия и красный резиновый/PTFE перегородками.
    Примечание: Если анализ не может осуществляться непосредственно, держите экстракт-80 ° c до анализа, но это рекомендуется для анализа образцы сразу же после подготовки для сведения к минимуму риска химических изменений во время цикла замораживания/оттаивания.

4. GC-MS

  1. Для полной последовательности измерения GC-MS Подготовьте следующие решения, каждый в 1,5 мл флаконе короткие нити:
    1. Подготовка смеси calibrant ри путем разбавления коммерчески доступных алканов стандартных решений для конечной концентрации 8 мг/Л на соединение с помощью гексана.
    2. Подготовить растворителя пустой состоящий из чистого EtOAc.
  2. Место, флаконы, содержащие 1) растворителей пустой, 2) ри calibrant смесь, 3) MGR содержание экстракт и 4) DG содержание экстракта в охлажденный лоток (10 ° C) автоматический пробоотборник, в сочетании с газовый хроматограф (GC).
    Примечание: Это рекомендуется для сведения к минимуму промежуток времени, которое каждый флакон хранится в автоматический пробоотборник перед измерением. Для критических образцов, как образец содержимого MGR флакон могут помещаться в автоматический пробоотборник непосредственно перед анализом.
  3. Для каждого образца, придать 1 мкл аликвота GC-MS для хроматографического разделения на столбце подходит для целевых соединений (здесь: HP - 5 мс Пользовательского столбца).
    1. Установите соответствующие параметры GC, который может выглядеть следующим образом:
      1. Использовать гелий как газ-носитель и установить постоянный столбец потока 1 мл/мин набор печи температура пандуса, начиная от 40 ° C с удерживайте в течение 2 мин, следуют рамп 10 ° C/мин до 330 ° C, со временем удержания 7 мин набор температура на входе до 270 ° C.
      2. Выбор и если необходимо, отрегулировать Сплит соотношения для инъекций GC-MS, которые приводят к адекватной пик формы и интенсивности для соединений, представляющих интерес (рис. 5).
        Примечание: В примере представлена было необходимо измерить экстракт DG на Сплит соотношение 2:1 и Ри calibrant смесь в splitless режиме. MGR содержания экстракта был проанализирован в Сплит соотношение 2:1 и во второй раз на 50: 1.
      3. Установите вспомогательный температуру до 350 ° C.
    2. Установите параметры масс спектрометр (MS) следующим образом: MS Источник температуре 230 ° C, MS Quad температуре 150 ° C, диапазон сканирования от низкой массы 30 до высокой массой 500, растворителей задержки 4.1 мин (для растворителя пустой и экспериментальных образцов) или 6.1 мин (для Ри calibrant смеси) , соответственно. Установите частоту сканирования примерно 3 сканирований в секунду.
      Примечание: Параметры MS, особенно MS сканирования-, дискретизации и время цикла может повлиять на пик собирание и спектра деконволюция и необходимо учитывать при выборе параметров для оценки надлежащего данных с программным обеспечением MetaboliteDetector.
  4. После завершения измерения, экспортируйте данные в виде. ЗОС проекта (здесь выполняется с использованием анализа данных программное обеспечение поставляется с GC) файл на портативное устройство хранения данных.
    1. Выберите файл | Экспорт данных в формат ЗОС..., затем проверить создать новый каталог и нажмите кнопку ОК. Выберите место разыскиваемых хранения (например, флэш-накопитель USB) и нажмите кнопку Открыть. Выберите файлы для экспорта и нажмите значок ---> . Подтвердите, нажав процесса.

5. метаболит обнаружения и идентификации с использованием программного обеспечения MetaboliteDetector

  1. Перед началом анализа файлов данных, MetaboliteDetector, выберите инструменты | Параметрыи задайте необходимые параметры следующим образом (отдельные листы MetaboliteDetector указаны жирным шрифтом):
    1. В досье, внешний видзадайте шкала времени для мин и включите параметр метки осей.
    2. В листе деконволюция, установите параметры для настройки пик: пик порог: 10 и минимальная высота пика (шум единиц): 10. Снимите флажок Включение базовой регулировки. Установите параметры для обнаружения метаболитов: контейнеры/проверка: 10, ширина Деконволюция (сканирование): 5, требуемую интенсивность (% от базовой пик): 0 и требуемое количество вершин: 10.
    3. В окне идентификации, установите для параметра Библиотека поиска: составные Lib: «CalibrationLibrary_Alkanes» и NIST (NIST библиотека sqlite могут быть включены в формате .lbr). Установите параметры следующим образом: Макс. РИ разница: 10, отсечки Оценка: 0.9, чистая/Impure состав: 0.5, количество фрагментов: 2, минимальное количество идентичных фрагментов.: 1. Использование масштабируется lib: галочкой; Оценка подобия: Спец подобия; Масс-фильтра: m/z 207, 221, 281, 355 и 1147 (для известных загрязнителей, возникающих из стационарной фазы GC-колонки).
    4. В листе количественной оценки параметров: количество ионов количественной оценки: 3, минимальное расстояние между последующими ионов: 5 и минимально требуемого качества индекс: 1. исключить количественного определения ионов 207, 221, 281, 355 и 1147.
      Примечание: В случае высокого разрешения данных MS, дополнительно установите следующие параметры в таблице центроида для: начать пик порог: 10, порог конце пик: -5 и максимальная базовых расстояние: 30, FWHM: 0.5.
  2. Импорт файлов в. Формат CDF содержащихся в созданный. ЗОС файл проекта. NetCDF в MetaboliteDetector программное обеспечение, выбрав файл | Импорт | NetCDF импорта. Выберите значок папки в форме, а затем выберите файлы для выборки категорий для импорта и обработки: 1) растворителей пустой, 2) ри calibrants, 3) MGR содержания экстракта и 4) DG содержания экстракта. Подтвердите с помощью OK для начала обработки данных. После обработки, в появившемся окне выберите Закрыть .
  3. Для Ри калибровки и определения значения RI для соединения, содержащиеся в экстракте MGR, выберите файл | Открыть и выбрать файл, содержащий данные ри calibrants.
    1. После calibrant ри файл открыт, выберите значок увеличительного стекла . Подтвердите появившемся окне подтвердите с помощью OK.
    2. Для правильной калибровки ри проверьте диапазон обнаружению алканы в файле calibrant ри.
      1. Для этого выберите треугольник появляется под максимум первый пик, возникая от первого алканов (с низким РТ, рис. 6) обнаружено, один раз нажав на него.
      2. Проверьте хит с высоким спектра подобия (спец sim., максимальный балл = 1) по сравнению с алканов Библиотека записей (рис. 6).
      3. Чтобы проверить личность предлагаемые составные алканов, сравните его массовые спектр массовых спектр, в литературе, например, NIST химии WebBook22.
      4. Определите последний алканов, обнаруживаемая в смеси calibrant ри, считая до последнего пик алканов, появляясь в хроматограммы.
    3. Для калибровки ри, выберите инструменты | Мастер калибровки ри. Нажмите кнопку Далее.
    4. Нажмите на значок папки образный и выберите файл, содержащий Хроматограмма ри calibrant смеси. Нажмите кнопку Далее.
    5. Выберите библиотеку, содержащую записи для calibrants алканов в появившемся окне.
    6. Выберите Библиотека записей всех алканы обнаруживаемая в файле calibrant Ри и нажмите >> значок. После выбора >>, выберите Далее.
    7. Проверьте РТС, перечисленные для каждой обнаружению алканов в появившейся таблице. С этой целью проверьте РТС, изображенные в главном окне для каждого алканов, нажав на соответствующие треугольник (рис. 7). Если необходимо (рис. 8), исправить RT в таблице калибровки вручную, дважды щелкнув на соответствующем поле, выбрав в раскрывающемся меню и выбор правильного предложил RT. Альтернативно, тип RT с помощью клавиатуры ( Рисунок 9).
    8. Когда RT для каждого алканов является правильным, нажмите кнопку Далее. Нажмите кнопку следующий в появившемся окне показаны в таблице калибровки ри.
    9. Выберите символ, зеленый + в появившемся окне Выбора Хроматограмма , выбрать растворителя-пустой файл данных и файлы железы экстракты и выберите следующий. В появившемся окне задайте параметры параметра следующим: отключение базовой регулировки, пик порог: 5, минимальный пик высота: 5, контейнеры/проверка: 10 и деконволюция ширина: 5. хит следующий , а затем начать выполнять расчет ри соединения, содержащиеся в файлах выбранного образца.
  4. Для аннотации и идентификации выбранного метаболитов в MGR экстракт, откройте файл данных экстракта измеренных MGR контента, для которого были рассчитаны рис как описано выше (шаг 5.3.9), выбрав файл | Открыть и выбрав файл разыскиваемых данных.
    1. Выберите инструменты | Параметры | Деконволюция и измените порог пик, а также минимум пик высота (шум единиц) и на 5. Выберите значок увеличительного стекла и подтвердите снова с ОКпоявляется окно с предупреждением.
    2. Нажмите на треугольник появляется под максимальный пик интереса и сравните его массовые спектр с теми, хранящийся в библиотеке NIST, выбрав значок NIST .
    3. Выберите первый результирующий хит NIST-поиска (Рисунок 10).
    4. Если результирующий спектра подобия комплекса интересов выше показатель подобия выбранной спектра (здесь ≥ 0,9) по сравнению с NIST-вход (рис. 10), посмотрите вверх ри (для аналогичных стационарной фазы GC, толщина пленки, и столбца диаметр) для этого соединения в литературе (например, NIST химии WebBook22).
    5. Вычислите относительную разницу между ссылку на NIST ри (или усредненной RIs когда даны несколько значений ри) и экспериментально производных ри. Если разность равна или меньше, чем указанное пользователем максимальное допустимое значение (здесь, ≤ ±1%), назначить соединение как «заметки».
    6. Повторите шаги 5.4.2–5.4.5 для всех соединений интереса, содержащихся в файле примера MGR.
    7. Для составных идентификации, Сравните Ри и массовых спектр стандартных решений (например, 2-100 мг/Л) измеряется в тех же условиях, как описано в разделе 4 аннотированной соединений.
    8. Анализ стандарта, как описано в разделе 4 и обработать полученные данные, как описано для алканов и MGR данных содержание железа в шагах, 4.4 и 5.2.
    9. Калибровки данных, полученных от стандарта, выбрав инструменты | RI-калибровка мастер | Следующая и выбрать тот же ри calibrant файл используется перед. Нажмите кнопку Далее, затем снова следующее и выберите файл, содержащий данные полученные стандартное решение, щелкнув символ зеленый + . Нажмите следующий и затем начать вычисления RI для стандартного комплекса.
      Примечание: Если анализ стандарта не может быть выполнена незамедлительно после анализа образцов, рекомендуется проанализировать ри calibrants снова и выполнить новую калибровку Ри и вычисления для стандарта.
    10. Откройте файл стандарта на соответствующие и подтвердить свою идентичность путем сравнения его спектра с NIST-Библиотека, как описано в шаге 5.4.2.
    11. После подтверждения личности стандарта добавьте массовых спектр и Ри стандарта соединения в библиотеке отеля. Для этого нажмите на символ зеленый + и введите предпочтительное имя элемента библиотеки. Подтвердите нажатием OK , чтобы добавить массовые спектр и Ри стандартом соединения в библиотеку. Если новая запись не может рассматриваться в библиотеке, активируйте кнопку Обновить .
      Примечание: Если калибровка Ри была выполнена успешно, Ри, определяется MetaboliteDetector покажет вверх в соответствующие библиотеки записи. После создания библиотеки вход для стандарта, идентификация данного метаболита в мг экстракта на основе комбинации Ри и сходство спектров возможна.
    12. Снова откройте файл содержимого данных MGR. Выберите инструменты | Параметры | Идентификация. Теперь как ри стандартного комплекса рассчитывается и добавляется запись библиотеки, измените Показатель подобия от Спектра сходство Комбинированныйпоказатель.
    13. Нажмите на значок увеличительного стекла и выберите треугольник под соединение, которое было Аннотированная шаге 5.4.5.
    14. Нажмите на хит и проверьте значения, указанные для «общий показатель подобия» (ОСС, сокращенно метаболит-детектор, как «Общая simil.»), учитывая сочетание спектра подобия и Ри подобия Оценка (Рисунок 11).
      Примечание: Если удар был найден в библиотеке отеля, он будет отображаться в правой части главного окна.
    15. Если OSS выше определяемых пользователем порога (здесь ≥ 0.9, также обозначается зеленый цвет треугольника), назначить соединения как «выявленных» (Рисунок 11).

6. Проверка MGR содержание экстракта для загрязнений на содержание ГД

  1. Откройте калиброванные файл образца ГД, для которых уже были рассчитаны RIs соединений с MetaboliteDetector (шаг 5.3.9).
  2. Наложение хроматограммы, полученные после измерения содержания примеры мг и ГД, выберите инструменты | Наложение хроматограммы и выбрать два соответствующих файлов через значок зеленый + . Подтвердите с помощью OK.
  3. Для просмотра наложения выберите появляясь Наложение хроматограммы лист в нижней части окна.
  4. Проверка совпадения соединений между содержанием MGR экстракт (рис. 12) и ГД содержание экстракта и исключить перекрытие соединений из дальнейшего анализа содержания MGR.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Схема рабочего процесса список экспериментальные шаги для идентификации предполагаемого метаболит в секреции железы C. explodens показано на рисунке 13. Кроме того Схематический обзор наиболее важных частей тела COCY работник муравьев для представленных эксперимента предоставляется как дополнительный S1 рисунок A, B. Основные шаги от рассечения муравьев до предполагаемого метаболит идентификации в содержании MGR проиллюстрированы в Дополнительный рисунок S2.

Чтобы изолировать MGR содержимое подходит для volatilome анализа, охлаждаемый государство сохранялся всей перевозки, хранения, а также в процессе вскрытия. С этой целью муравьи были заморожены сразу же после их сбора с использованием насекомых аспиратор (раздел 1 и Рисунок 1) в situ. После хранения в течение 2 дней в холодильнике-20 ° C муравей образцы были перевезены на сухой лед в Австрию, где они были сразу же поставили на-80 ° C до дальнейшего анализа. Муравьи, подходит для быть выбраны для изоляции их содержание MGR экспонат Гастер региона, который является круглая и нетронутыми (рисунок 2A) и в лучшем случае, хорошо укомплектованный с содержанием MGR, как указано в MGR видны между тергитов (рис. 2B). Рисунок 2 c, Dпоказаны gasters муравьев, которые не подходят для дальнейшего анализа. Основные шаги (шаги 2,3-2,6 участвует в процессе изоляции содержимого MGR от муравьев COCY) показано на рисунке 3. Изолированные MGR содержимое (желтый в случае C. explodens, но цвета могут варьироваться от белого к красному цвету в другие виды, принадлежащие к группе COCY) показано на рисунке 14.

Когда вскрывали муравьев для их содержание MGR, следует позаботиться не прокола или разрыва других желез или кишечника (шаг 2.5). На рисунке 4 показана Гастер расчлененных муравей, который по-прежнему содержит два других, нетронутыми желез (ГД и VG) после изоляции контента MGR. Пример видимые загрязнения содержимое кишечника ant показан на рисунке 15. Поскольку нельзя полностью избежать перекрестного загрязнения с содержимым ГД, расположенный под MGR, частью протокола изображен для анализа этих желез для сравнения результате сигналов с сигналы от содержания экстракта MGR (раздел 6). Когда процедура диссекции правильно сделано, это можно получить около 0,75-1,2 мг MGR содержания на муравья. Для протокола, описанные здесь MGR содержание пяти муравьев были объединены получать повторяющиеся образцы 3,9-5,9 мг каждая.

Содержимое изолированного железы водохранилища были извлечены с EtOAc (раздел 3) и анализируются ГХ-МС (раздел 4). Измерение содержания мг экстракта C. explodens рабочие муравьи приводит Хроматограмма, состоящий из пиков и массовых спектры для десятки предполагаемых MGR содержание соединений (рис. 5). Два доминирующей метаболитов 1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)-ethanone (ID 4) и 5,7-dihydroxy-2-methylchromen-4-one (ID 5) в мг содержание экстракт вызвало столбец перегрузки, именно поэтому того же образца была проанализирована снова на более высоком Сплит соотношение прочитанных ( Рисунок 5, инкрустация). Например, возможное перекрестное загрязнение MGR содержания, составляющих ГД будет видна как дополнительные пики в GC-MS Хроматограмма, экспонируется конце РТС, начиная от примерно минуту 29 (Рисунок 12). Исключая хроматографических пиков и массовых спектров соединений также найдены в растворителя бланк, происходящих из стационарной фазы GC столбца или содержимое в муравей Гастер ГД и последующей обработки с MetaboliteDetector программное обеспечение в результате около 110 MGR содержание соединений с сигнал/шум соотношение контрастности ≥ 10. Для более поздних метаболит аннотации и идентификации с программным обеспечением MetaboliteDetector хроматограммы были откалиброваны и Ри значения были определены для измеренных образцов файлов (шаг 5.3 и суб шаги, Рисунок 7 Рисунок 6, , Рисунок 8 , Рисунок 9). Обнаруженных предполагаемых MGR содержание метаболитов были Аннотированная, основываясь на комбинации спектра подобия в NIST-библиотеку, которая образована неотъемлемой частью программного обеспечения MetaboliteDetector в представленных примером (шаг 5.4 и суб шаги, Рисунок 10 ). Кроме того, обнаружены значения ри в литературе для же или сопоставимой стационарной фазы, толщина пленки, диаметр колонны GC были рассмотрены и составные аннотации (шаги 5.4.4 и 5.4.5). После установки строгого соответствия критериям и подтверждения RIs и массовых спектры с использованием стандартов, как описано в разделе протокол для одного стандарта соединения (шаги 5.4.7-5.4.15 и Рисунок 11), можно было подтвердить личность около 10 % от обнаруженных метаболитов. Так как подробный отчет о volatilome MGR содержание C. explodens будут опубликованы в другом месте, настоящее исследование сосредоточено на этих метаболитов, которые уже были описаны в предыдущем издании Jones et al. 17 (видов здесь как KB02-108; см. также готовить и др. 23). в таблице 1 дается обзор этих выявленных соединений.

Схема экспериментальной установки сетчатой трубки с Т1 и Т2 в хроматографической системе.
Рисунок 1: схема, чертеж насекомых Аспиратор. В крышку, что тюлени флаконе или контейнера делаются два отверстия, где проходят два гибких трубок. Открытие одной трубы (T1), которая сталкивается с внутренней части флакона запечатан с сеткой достаточно тонкой блокировать насекомых. Кроме того отверстия сделаны в трубку для облегчения обмена воздуха. Конец трубки T2 тесно указывает на насекомых, которые всасываются в пробирку выборки, аспирационных через T1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Диаграмма сегментации брюшной полости муравьёв с мечеными тергитами Т1-Т5; Анализ под микроскопом в масштабе 1 мм.
Рисунок 2: без изменений по сравнению с сломанной Гастер. (A) нетронутыми Гастер подходит для рассечения. Нетронутыми Гастер (B) почти полностью заполнены с содержанием MGR, подходит также для рассечения. (C) и (D) сломанной муравей gasters с содержанием MGR выбрасывается и закаленные (желтый), возможно сломанной во время разрыв покровов Гастер во время выборки. Эти муравьи исключены из рассечение, извлечения и дальнейшего анализа. T: хвостике. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Процесс вскрытия брюшной полости насекомого, изображение с микроскопа, идентификация инструмента, меченые сегменты T1-T4.
Рисунок 3: основные этапы в процессе диссекции. (A) разделение Гастер региона от остальной части тела муравья. (B) отшелушивающим экзоскелет: хвостике 1, хвостике 2 (C) и хвостике 3, после чего содержимое парных желтого цвета МИПР почти полностью видна (D). (E) удаление липкое содержания MGR с помощью иглы рассечение. T: хвостике. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Микрографическое изображение препарированной анатомии дрозофилы с помеченными железами (DG) и везикулами (VG).
Рисунок 4: муравей Гастер после изоляции содержимого MGR. Два других желез присутствует в Гастер (VG: яд желез и DG: Dufour железы) можно увидеть. После удаления содержания MGR (левый кадр после изоляции можно увидеть в желтый) оба отделения по-прежнему должно быть нетронутыми. Эти железы могут быть проанализированы в так же, как содержимое MGR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Хроматографический график, показывающий обилие соединений в зависимости от времени удержания, выделяющий пики норейгенина.
Рисунок 5: представитель всего Ион текущего (TIC) Хроматограмма содержания экстракта MGR. Два наиболее распространенных GC-MS пиков привело к более симметричной формы хроматографических пиков, когда более высокий коэффициент разделения (50: 1) был выбран вместо регулярных соотношение 2:1 (см. вставку). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Результаты газовой хроматографии; Время удержания и спектральный анализ для алкановых соединений, м/з 128.
Рисунок 6: определение первой обнаружению алканов в Ри calibrant хроматограммы. Треугольник под пик максимума первый пик алканов выбран. Алкан elutes в 6.31 мин и показывает высокий спектр сходство (здесь, спец сим.) библиотека запись «Alkane_C09». Для подтверждения личности алканов, массовые спектр сравнивается с библиотекой (например, NIST химии WebBook22). В примере представлены Нонан идентифицируется по его Молекулярный ион с m/z значение 128. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Хроматографическая диаграмма с калибровочной таблицей; Анализ времени удержания при разделении компаундов.
Рисунок 7: ри калибровки с использованием стандартного смесь n алканов. РИ calibrant, который был открыт файл данных и выбрана функция «Ри-калибровка-мастер». Правильный подбор время удерживания для Ри, изображены в таблице калибровки должны быть проверены. RT 6.31 мин для alkane_C09 (Нонан) правильно отображаемые в таблице. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Анализ газовой хроматографии; Диаграмма времени удержания соединения и данные калибровки для алканов.
Рисунок 8: неправильно РТС отображаются в таблице калибровки. RTs не отображаются правильно (либо показано неправильное значение RT или отсутствующее значение RT отображается как -1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Хроматографический анализ; График ТИЦ; настройка калибровки; данные о времени хранения; масс-спектрометрия.
Рисунок 9: ручная коррекция неправильно РТС в таблице калибровки. Неправильные значения могут исправляться вручную, добавив правильный RT для соответствующих алканов, как показано здесь, для Alkane_C39. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Масс-спектрометрический анализ; ТИЦ и график спектров; Показан процесс идентификации соединений.
Рисунок 10: сравнение массовых спектр выбранного соединения NIST-Библиотека записей. После выбора, Пик максимального элюирующие 6,16 мин (ри 891) и активация функции «NIST-Поиск» (красный кружок), отображается спектра сходство 0.99 для 2-heptanone. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Хроматографическая диаграмма, ТИЦ, сравнение обнаруженных и библиотечных соединений для анализа спектрального сходства.
Рисунок 11: метаболит идентификации контента экстракт MGR. Массовые спектр и Ри, происходящих из составных элюирующие на 891 ри в Хроматограмма образца сравниваются с внутренней библиотеки записей, содержащих RIs и спектров измеренных стандартных соединений. Если «общий показатель подобия» (OSS, сокращенно метаболит детектор «Общая simil.» осуществление массовых спектр и РИ) между соединение в библиотеке отеля и комплекса в образце файла ≥ 0.9, соединение обозначается как «определены». Здесь OSS между внутренней библиотеки вход 2-heptanone и составные элюирующие на ри 891 — 0,96, который приводит к идентификации 2-heptanone в MGR содержание экстракта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Хроматографическая графа; экстракты дюфура и нижней челюсти; Сравнение пиков, анализ времени удержания.
Рисунок 12: наложение TIC Хроматограмма секций (мин 29 мин 35) DG содержания экстракта (красный) и содержание MGR экстракт (синий). Пик области, соответствующие перекрытия (предполагаемый) соединений выше в ГД, содержание, чем в содержании MGR экстракт; Эти соединения потенциально происходят из ГД и поэтому рассматриваются как экстракт (незначительные) загрязняющих веществ в содержании MGR. В случае содержимого экстракт MGR C. explodens хроматографических пиков, возникая от предполагаемого загрязнения ГД можно найти в приблизительно мин 29, и эта часть Хроматограмма могут быть исключены из дальнейшего анализа содержания MGR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Блок-схема анализа секреции муравьев; GC-MS, процесс идентификации метаболитов, этапы экстракции железы.
Рисунок 13: схема рабочего процесса от образцов муравей метаболит аннотации/идентификации в железе водохранилище содержание выдержки после анализа GC-MS. Протокола, представленные здесь объясняет все экспериментальные шаги, начиная от изоляции MGR содержимого через рассечение муравей и GC-MS анализа и оценки данных (указывается в черном). В качестве альтернативы насекомое секреции также может быть созданный и собранных в situ (указано в серый цвет). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Схема развития семян; сравнение в масштабе ~1 мм; Микроскопия для ботанических исследований.
Рисунок 14: изолированные восковой MGR содержимое до извлечения. (A) содержимое двух МИПР держаться вместе, но (B) они также могут быть разделены после изоляции. В C. explodensцвет содержимого MGR оранжево желто, но может варьироваться от белого к красному цвету в других видов группы COCY. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Образец ткани крупным планом (~1 мм) с ожоговыми повреждениями, использованный в судебно-медицинской экспертизе и тестировании материалов.
Рисунок 15: Иллюстрация изолированной MGR секреции, кросс загрязненных составляющих насекомых кишечника (коричневый). Эти типы MGR изолятов исключены из дальнейшего анализа и извлечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

IDМетаболитыТривиальное названиеСтрока InCHIФормула суммы
1Heptan-2-1InChI=1S/C7H14O/c1-3-4-5-6-7 (2) 8/ h3 - 6H 2, 1-2H 3C7H14O
2n УндеканInChI=1S/C11H24/c1-3-5-7-9-11-10-8-6-4-2/h3-11H2,1-2H3C11H24
3n-HeptadecaneInChI=1S/C17H36/c1-3-5-7-9-11-13-15-17-16-14-12-10-8-6-4-2/h3-17H2,1-2H3C17H36
41-(2,4,6-Trihydroxyphenyl)-ethanoneMonoacetylphloroglucinolInChI = 1S/C8H8O4/c1-4 (9) 8-6 (11) 2-5 (10) 3 - 7 (8) 12/h2-3,10-12H, 1H 3C8H8O4
55,7-Dihydroxy-2-methylchromen-4-OneNoreugeninInChI = 1S/C10H8O4/c1-5-2-7 (12) 10-8 (13) 3-6 (11) 4-9 (10) 14-5/h2-4,11, 13H, 1H 3C10H8O4

Таблица 1: метаболитов, определенных в EtOAc извлечь содержание MGR, изолированный от C. explodens небольшие рабочие муравьи. Представлены отдельные метаболитов.

Дополнительная цифра S1. В этой рукописи представлен обзор наиболее важных частей тела, принадлежащих к COCY муравьи (несовершеннолетних трудящихся). (A) MGRs показанными желтым. Их gastral часть используется для volatilome анализа. (B) gastral часть МИПР расположен под тергитов 1-3. T: хвостике. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная цифра S2. Схематический обзор представленных эксперимента. Приводятся основные шаги от рассечения муравей до предполагаемого идентификации в MGR содержание метаболитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой рукописи мы представляем полный протокол для анализа volatilome содержимое, найденное в гипертрофированной MGRs C. explodens небольшие рабочие муравьи. Так как муравьи, используемый здесь может «взрыв» и извлечь их содержимое MGR неконтролируемым образом при прикосновении с щипцами, рекомендуется использовать «мягкие» коллекции технику предусмотренных насекомых аспиратор (рис. 1). Для некоторых видов муравьёв, включая COCY муравьи может быть необходимо ограничить максимальное количество муравьев до пяти человек за флакон, 50 мл, поскольку в противном случае самостоятельной отравления муравьев (например, накопление муравьиной кислоты в headspace) может произойти. Для замораживания муравьев в поле, может использоваться прохладно мешок с глубокой заморозки холодные компрессы. Образцы должны быстро замороженных и хранятся в охлажденный условиях (например, -20 ° C, лучший на-80 ° C), но не рекомендуется, чтобы убить и хранить муравьи в жидком азоте, поскольку с помощью этого метода было отмечено увеличение ущерба их желез.

Методология представлена буфера и растворителя рассечение подходит для получения нижней челюсти железа воска как водохранилище содержимое, а также других желез в замороженных рабочие муравьи. Для volatilome анализа содержания MGR C. explodensосновные аспекты для рассмотрения в ходе вскрытия являются непрерывное охлаждение муравей (шаг 2.1.4) и минимизации кросс загрязнений мг образцов с другими железы содержимое/жидкости в муравей Гастер (шаг 2.5, Рисунок 4и рис. 15). Значительная часть замороженных муравьи могут быть повреждены, либо потому, что муравьи «взрыв» во время выборки или были повреждены во время транспортировки на сухой лед от места отбора проб в лабораторию. Если нарушается Гастер региона, эти муравьи не подходят для дальнейшего анализа (рис. 2 c, D). Если только усики и ноги отсутствуют или сломаны, эти муравьи по-прежнему может использоваться для извлечения содержимого MGR и дальнейшего анализа. Поскольку содержимое MGR охлаждением C. explodens муравьи имеют консистенцию воск как это прямо вперед, чтобы изолировать их с использованием рассечения иглы (шаг 2,5, 3E рисуноки Рисунок 14). Дополнительный уход необходимо принимать при обработке липкие MGR контента. Он может прилипнуть к чему-либо вступления в физический контакт с ним и также часто будет придерживаться рассечение щипцы, что увеличивает риск заражения других образцов. Это необходимо только коснуться MGR содержание с иглой диссекции и незамедлительно передать его в стеклянных флаконах, используемые для извлечения (шаги 2.5 и 2.6). Кроме того рекомендуется чистить оборудование рассечение смесью метанола/H2O при переключении между муравьи или железы типов (шаг 2.8).

Железы содержимое других видов муравьёв могут присутствовать в жидком состоянии даже во время охлаждения с холодные компрессы. В этом случае весь железы, включая мембраны может сначала быть изолированы и после прокола для получения содержимого. Секреции жидкости также могут быть получены с помощью тонкой капиллярные пипетки. С средняя тела длиной около 4-5 мм (без антенны) работники C. explodens принадлежат к меньше видов группы COCY. Их часто опухшим Гастер состоит из около 2-2,5 мм в длину и 1-1,5 мм в ширину. Работники пока крупнейший известных видов COCY группы могут достигать размера около 8 мм, длина тела Гастер размером около 3 мм в длину и 2,5 мм в ширину. Поскольку протокол хорошо подходит вскрыть и расследовать отдельные муравьи и gasters этого размера различных COCY видов, здесь используется рассечение инструментов и микроскоп может должны быть адаптированы для применяться для малых муравьев или небольших органов. Кроме того количество муравьев на аналитической пробы могут иметь также необходимо увеличить.

Во время рассекает ant для содержимого MGR, важно, чтобы не повредить другие железы или кишечника - содержание которого могут кросс загрязнить образец (шаг 2.5, Рисунок 4 и рис. 15). В случае оптимального после извлечения содержимого MGR, ГД, а также VG заметно хранится нетронутыми (рис. 4). Загрязнений с содержимым DG, который расположен под МИПР, трудно полностью избежать. Причин для этого может также включать частичное нарушение целостности железы во время транспортировки на сухой лед из выборки сайта в лабораторию. Это также возможно, что ГД поврежден во время выборки или в процессе взрыва, как мы уже заметили для MGR в ряде обследованных муравьи. Поскольку содержимое DG могут быть проанализированы таким же образом, как MGR содержание (разделы 3 и 4), результаты можно сравнить с результирующие данные после анализа образцов контента MGR (раздел 6). В случае MGR контента экстракты, полученные из C. explodens муравьи соединений, также содержится в ГД начинают элюировать в конце Хроматограмма (Рисунок 12). Для предотвращения ошибиться DG соединений для MGR составляющие, соответствующие метаболиты могут быть исключены из дальнейшего анализа. Из исследования на другие виды муравьёв известно, что АРД может также содержать (высоко) летучих соединений1,24, который обычно элюировать в начале GC-хроматограммы.

В предыдущих исследованиях, касающихся химического состава MGR содержимое COCY муравьи, муравьи весь или их весь gasters были проанализированы16,17,18,23, тогда как содержание здесь MGR сами были получены через рассечение муравьев.

Анализ содержания расчлененных MGR позволяет следователям выполнять широкий спектр биохимических исследований, включая выявление метаболитов, содержащиеся в нем. После проведенного исследования здесь сосредоточена на определении летучих компонентов, содержащихся в MGR C. explodens, GC-MS был выбран для его анализа (раздел 4). Для этого экстракты идеально измеряется сразу же после подготовки или температуре-80 ° C до анализа. Следует отметить, что (расширенный) хранения может вызвать химические изменения экстрактов (см. примечания после шагов 3.3 и 4.2). Поскольку концентрация MGR содержимое может охватывать широкий спектр несколько порядков, это может быть необходимо проанализировать MGR экстрактов в Сплит соотношения различных GC. Поскольку два основных соединений в MGR содержания экстракта муравьев, принятых иллюстрируют протокол вызвал столбец перегрузки при использовании Сплит соотношение 2:1, этот образец был проанализирован во второй раз на более высокий коэффициент разделения 50: 1 (4.3.1.2and шаг Рисунок 5). Настройки параметров GC-MS, представлены в разделе 4 подходят для данных, получаемых с GC-MS устройств, указанных в Таблице материалов. Рядом с calibrants ри (шаг 4.1.1) растворитель пустой (шаг 4.1.2) также должны быть проанализированы признать небиологических артефакты и загрязняющих веществ во время последующего анализа данных. Для идентификации метаболит важно также для измерения аутентичные стандартов аннотированный соединений на тех же условиях GC-MS используется для анализа образца экстрактов (5.4.7and следующие шаги). Чтобы повысить точность и надежность окончательных данных, рекомендуется проанализировать все категории выборки (растворитель пустой, calibrants ри, образец выдержки и стандартов) в пределах одной и той же последовательности измерения. Кроме того подлинные стандартов должны быть проанализированы в концентрации сравнима с для образца экстрактов. Это позволяет повысить точность значений Ри и сходство между образцом и стандартных массовых спектрами, которые наконец приведет к более и более значимой метаболит аннотации/идентификации. С этой целью стандартов может неоднократно измеряется с помощью различных Сплит факторов.

Для идентификации метаболит, сложного программного обеспечения, MetaboliteDetector используется для спектры деконволюция и Ри и спектры сравнения реализована NIST-Библиотека также относительно установленных собственную библиотеку (раздел 5). Рекомендуется для запуска MetaboliteDetector на 64-битных LINUX на основе операционной системы (например, KUBUNTU) и скопировать сгенерированный *. CDF файлы данных (шаг 4.4) от портативное устройство хранения данных на локальном жестком диске. MetaboliteDetector способен импорта необработанных данных GC-MS в формате netCDF центроида или профиль. Программное обеспечение большинства GC-MS инструментов должны иметь возможность конвертировать записи необработанных данных в этот формат19. Перед началом анализа данных, рекомендуется читать литературу для предыдущих версий программного обеспечения MetaboliteDetector для ознакомления с функциями и графический пользовательский интерфейс19,25, 26.

Для калибровки Ри и последующий расчет стоимости ри составные вершины в образце экстракты используется библиотека, содержащая RIs и спектров ри calibrants (здесь, n алканов). Такая библиотека может быть либо самостоятельно установлены, или уже существующих («CalibrationLibrary_Alkanes») могут быть скачаны27. Библиотека calibrant предусмотренным по умолчанию содержит спектров для n алканов начиная от C09 C39, которые были проанализированы как описано в разделе 4 и рис. Предоставленный библиотека позволяет пользователям, работающим с детектором метаболит непосредственно начать с процесса калибровки своих данных. При необходимости, эта библиотека могут также распространяться дополнительные записи для дальнейшего алканы. Основываясь на подобии ведения и экспериментально производных RIs и массовых спектры (см. шаг 5.3 и суб шаги, Рисунок 7, рис, рис. 9), аннотации или идентификации соединений может быть выполнено (шаг 5.4 и суб шаги, Рисунок 11). Важно также, что после автоматической обработки данных с MetaboliteDetector, пользователь будет вручную проверить правильное пик собирание и спектра деконволюция проверив массового спектры, лежащие в основе «треугольник», для каждого предполагаемого соединения интереса. Кроме того в зависимости от инструментария GC-MS и настройки параметров, используемые для генерации данных, могут потребоваться приспособления представлены параметры MetaboliteDetector. MetaboliteDetector программное обеспечение может выполнять множество операций более полезным чем объяснить в этой рукописи, например, отображение извлеченных ионов, текущий (EIC) хроматограм, экспорт хроматограммы .csv, автоматический пакетный-количественная оценка соединения и многое другое.

Протокол, представленный в этой рукописи может служить предложение для экспериментов, выполненных другими исследователями, упором на изоляции железы или железы содержимое от насекомых, volatilome анализ, а также идентификации метаболит.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Финансирование этого исследования была получена через вены науки и технологий фонд (WWTF) LS13-048 для ИСД. Особая благодарность Диана W. Дэвидсон (Университет штата Юта, сейчас на пенсии) для обмена своими знаниями о Bornean COCY муравьи с нами. Мы ценим администраций Куала Belalong области исследований центра (KBFSC) и Universiti Бруней Даруссалам (UBD) для утверждения проектов, а также Брунея Департамента лесного хозяйства и Бруней исследований и инновационный центр для разрешения для сбора муравьи и утверждение и выдача разрешений на экспорт. Особая благодарность персоналу UBD и KBFSC, особенно Мухаммад Абдулла бин Саллех Bat, Тедди Чуа Ви ли, Masnah Mirasan, Кахар Rafhiah, Roshanizah росли, Rodzay Вахаб, Чан Чин Мэй и кушанских Tennakoon для облегчения нашего исследования.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Туба 50 мл, 115 x 28 мм, плоское/коническое основание PPSarstedt62,559,001см. Иллюстрацию 1 в рукописной
трубке из ПВХRehau290 4489см. Иллюстрацию 1 в рукописной
сетке, нержавеющая сталь, размер ячеек 0,63 ммAntstore1000378см. Иллюстрацию 1 в
рукописной морозильной камереSeverinKS 9890 -20 ° C или нижняя
коробка из пенополистирола, внутренние размеры 155 мм x 100 мм x 45 ммThorsten Koch4260308590481
чашка Петри, стекло, 100 мм x 15 ммAldrichBR455742
Cold pack 150 мм x 100 ммElite Bags1998до -20 градусов; C
Ведро с колотым льдом
1,5 мл Флаконы с короткой резьбой, 32 x 11,6 мм, прозрачное стекло, 1-й класс гидролитики, широко открывающиесяLa-Pha-Pack11090500
Винтовые крышки для флаконов с короткой нитью 1,5 мл, закрытые, силиконовый белый/ПТФЭ красная перегородка, 55 градусов по Шору A, 1,0 ммLa-Pha-Pack9151799
стереомикроскопомBresser5806100
Щипцы, сверхтонкий наконечник изогнутыйMedizinische Instrumente May, Щипцы Norman MayPI-0005B
, сверхтонкий наконечник прямойсинийINOXBL-3408
игла для рассечения 140 мм, заостренная, прямаяHeinz Herenz Medizinalbedarf GmbH1110301
метанола, LC-MS CHROMASOLV, Honeywell Riedel-de Haë nFisher Scientific15654740
Дистиллированная вода
Rotizell-Tissue-Tü cherCarl Roth GmbH + Co.KG0087.2
Этиловый эфир уксусной кислоты ROTISOLV ≥ 99,8 %Carl Roth GmbH + Co.KG4442,1замерзание до -20 °° C
Vortex Genie 2neoLab7-0092
0,1 мл микровставки для флаконов с короткой нитью 1,5 мл, 31 х 6 мм, прозрачное стекло, 1-й класс гидролиза, наконечник 15 мм;La-Pha-Pack06090357
Винтовые крышки для флаконов с короткой резьбой объемом 1,5 мл, с отверстием, перегородка RedRubber/PTFE,  45° shore A, 1,0 ммLa-Pha-Pack9151819
стандартным раствором алкана C8-C20Sigma-Aldrich 04070
Стандартный раствор алкана C21-C40Sigma-Aldrich 04071
Гексан супрасольвMerck104371
ГХ-автосэмплер, например, MPS2XL-TwisterGerstel
Agilent Газовый хроматограф 6890 NAgilent
Гузячья шея без разъемаLiner Restek22406
Гелий (5.0 - F50)Messer102532501
ГХ капиллярная колонка HP-5MS UI 30 м & раз; 0,25 мм и раз; 0,25 & микро; mAgilent19091S-433UI
Масс-селективный детектор Agilent 5975BAgilent
MSD ChemStation Прикладное программное обеспечение Программное обеспечение Agilent
MetaboliteDetector (3.1.Lisa20170127Ra-Linux)Hiller Kскачать из:
http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 Калибровочная библиотека для MetaboliteDetectorHiller Kскачать из: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10
MD Conversion Tool для NIST-библиотекиHiller Kскачать из: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10
заморозка

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morgan, E. D. Chemical sorcery for sociality: exocrine secretions of ants (Hymenoptera: Formicidae). Myrmecol News. 11, 79-90 (2008).
  2. Betz, O. Biological adhesive systems. , Springer. 111-152 (2010).
  3. Laciny, A., Zettel, H., Druzhinina, I. Workers, soldiers, and gynes-morphometric characterization and description of the female castes of Camponotus singularis (Smith, 1858)(Hymenoptera, Formicidae). Deutsche Entomologische Zeitschrift. 63, 183(2016).
  4. Ward, P. S., Blaimer, B. B., Fisher, B. L. A revised phylogenetic classification of the ant subfamily Formicinae (Hymenoptera: Formicidae), with resurrection of the genera Colobopsis and Dinomyrmex. Zootaxa. 4072 (3), 343-357 (2016).
  5. Davidson, D. W., Salim, K. A., Billen, J. Histology of structures used in territorial combat by Borneo's 'exploding ants'. Acta Zoologica. 93 (4), 487-491 (2012).
  6. Davidson, D., et al. An experimental study of microbial nest associates of Borneo's exploding ants (Camponotus [Colobopsis] species). Journal of Hymenoptera Research. 18 (2), 341-360 (2009).
  7. Laciny, A., et al. Colobopsis explodens sp.n., model species for studies on "exploding ants" (Hymenoptera, Formicidae), with biological notes and first illustrations of males of the Colobopsis cylindrica group. ZooKeys. , (2018).
  8. Maschwitz, U., Maschwitz, E. Platzende Arbeiterinnen: eine neue Art der Feindabwehr bei sozialen Hautflüglern. Oecologia. 14 (3), 289-294 (1974).
  9. Davidson, D. W., Lessard, J. P., Bernau, C. R., Cook, S. C. The tropical ant mosaic in a primary Bornean rain forest. Biotropica. 39 (4), 468-475 (2007).
  10. Martin, S., Drijfhout, F. A review of ant cuticular hydrocarbons. Journal of chemical ecology. 35 (10), 1151(2009).
  11. Pickett, J. Chromatography and isolation of insect hormones and pheromones. , Springer. 299-309 (1990).
  12. Tragust, S., et al. Ants disinfect fungus-exposed brood by oral uptake and spread of their poison. Current Biology. 23 (1), 76-82 (2013).
  13. Menzel, F., Blüthgen, N., Schmitt, T. Tropical parabiotic ants: highly unusual cuticular substances and low interspecific discrimination. Frontiers in Zoology. 5 (1), 16(2008).
  14. Hogan, C. T., Jones, T. H., Zhukova, M., Sosa-Calvo, J., Adams, R. M. Novel mandibular gland volatiles from Apterostigma ants. Biochemical Systematics and Ecology. 72, 56-62 (2017).
  15. Augusto, F., Valente, A. L. P. Applications of solid-phase microextraction to chemical analysis of live biological samples. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 21 (6), 428-438 (2002).
  16. Davidson, D. W., et al. Nutrition of Borneo's 'exploding' ants (Hymenoptera: Formicidae: Colobopsis): a preliminary assessment. Biotropica. 48 (4), 518-527 (2016).
  17. Jones, T., et al. The chemistry of exploding ants, Camponotus spp.(cylindricus complex). Journal of chemical ecology. 30 (8), 1479-1492 (2004).
  18. Voegtle, H. L., Jones, T. H., Davidson, D. W., Snelling, R. R. E-2-ethylhexenal, E-2-ethyl-2-hexenol, mellein, and 4-hydroxymellein in Camponotus species from Brunei. Journal of chemical ecology. 34 (2), 215-219 (2008).
  19. Hiller, K., et al. MetaboliteDetector: comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS based metabolome analysis. Analytical chemistry. 81 (9), 3429-3439 (2009).
  20. Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).
  21. Stein, S. Retention indices by NIST mass Spec data Center. NIST Chemistry Webbook, NIST Standard Reference Base. (69), (2010).
  22. NIST Chemistry WebBook. NIST Standard Reference Database Number 69. , Available from: http://webbook.nist.gov/chemistry/ (2018).
  23. Cook, S. C., Davidson, D. W. Nutritional and functional biology of exudate-feeding ants. Entomologia Experimentalis et Applicata. 118 (1), 1-10 (2006).
  24. Abdalla, F. C., Cruz-Landim, C. d Dufour glands in the hymenopterans (Apidae, Formicidae, Vespidae): a review. Revista Brasileira de Biologia. 61 (1), 95-106 (2001).
  25. Hiller, K. MetaboliteDetector. Documentation. , Available from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/wiki/index.php/Documentation (2010).
  26. Nieke, C. MetaboliteDetector - Development Version. , Available from: http://md.tu-bs.de/system/files/Downloads/MD-Development-Version-Documentation.pdf (2012).
  27. Hiller, K., Koschnitzki, N. MetaboliteDetector. Download. , Available from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

MetaboliteDetector

Похожие статьи