Методическая статья

Метод подготовки эффективного образца для повышения углеводов Ион сигналов в Matrix с помощью лазерной десорбции/ионизации масс-спектрометрии

6.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57660

⸱

29 июля 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Genomic Research Center, Academia Sinica, 2Department of Chemistry, National Taiwan University

В этой статье

Краткое содержание

Протокол для укрепления сигналов Ион углеводов в масс-спектрометрия MALDI путем реформирования кристаллических структур во время процессов подготовки образца показано.

Аннотация

Подготовка образца — очень важный процесс в масс-спектрометрия (МС) анализ углеводов. Хотя при содействии матрицы лазерной десорбции/ионизации (MALDI) MS является методом выбора в анализе углеводов, плохой ионной сигнала и данных воспроизводимость углеводов образцов продолжают оставаться серьезными проблемами. Для количественного анализа углеводов необходим эффективный аналитический протокол, предусматривающий высшего качества. Это видео демонстрирует пример подготовка протоколов для повышения интенсивности сигнала и свести к минимуму изменения данных углеводов в MALDI-МС. После сушки и кристаллизации образца капель кристально-морфологии реформировать путем метанола перед масс-спектрометрических анализа. Повышение углеводного сигнала рассматривается с визуализации MALDI масс-спектрометрия (IMS). Экспериментальные результаты показывают, что кристалл Реформации регулирует кристаллических структур и перераспределяет аналитов углеводов. По сравнению с методом подготовки сушеные капелька в обычных MALDI-МС, реформирования морфологии кристалл углеводов с метанола показывает значительно лучше интенсивности сигнала, изображение распределения ионов и стабильность данных. Поскольку протоколы, продемонстрировали здесь не связаны изменения в состав образца, они обычно применимы различные углеводы и матриц.

Введение

Анализ углеводов является важной и сложной темы. Углеводы и их производные играют важную роль в жизни организмов1,2,3. Эти молекулы сложные структуры и подвержены разлагаются. Многие из них не может быть охарактеризована ясно из-за трудности разделения и обнаружения. Хотя при содействии матрицы лазерной десорбции/ионизации (MALDI) масс-спектрометрия (МС) был применен к анализу широкого круга биомолекул, благодаря своей чувствительности и приемлемые результаты4, анализируя углеводы с помощью MALDI MS продолжается быть серьезной проблемой из-за низкой ионизации эффективность таких молекул5. Химические деривации является распространенным способом улучшить эффективность ионизации углеводов6,7, но такие процедуры являются время и использование образца. Кроме того эффективность ионизации дериватные углеводов по-прежнему ниже, чем белков. Таким образом необходима разработка методов для улучшения сигнала углеводов в MALDI MS без сложных процедур.

Еще одной сложной темой является применение MALDI MS для количественного анализа. Одной из основных проблем MALDI MS, что его чувствительность и данных воспроизводимость критически полагается на образец подготовки протоколов и экспериментальные параметры. Во многих случаях количественный анализ, MALDI MS ненадежной из-за разнородных образца морфологии и исследуемое вещество распределения. Хорошо известный пример-образцы, подготовленных с 2,5-dihydroxybenzoic кислоты (DHB) MALDI матрицей. Когда DHB кристаллизуется медленно под окружающей среды, степень включения аналита в матричные кристаллы непредсказуем, потому что полученные образцы показывают неправильные морфологии. Такие образцы обычно состоят из крупных кристаллов игольчатые и штраф. Когда DHB готовится с использованием летучих растворителей и/или тарелку с подогревом образца, быстрый процесс сушки приводит к более однородной тонкой кристаллов и лучше количественные результаты8,9,10. Этот метод известен как «перекристаллизации» MALDI образцов. Улучшение приписывается лучше включения аналитов в тонкой матричные кристаллы во время процесса быстрой кристаллизации. Мы также продемонстрировали, что настройка среды подготовки образца сократить неоднородность углеводов сигнала и улучшения количественных результатов11,12. В этих работах выводам, что образец морфология является критическим фактором, определяющим качество сигнала углеводов. Чтобы разработать общую стратегию для ежедневного анализа, метод эффективного образца Реформации, обеспечивая улучшение углеводного чувствительность не требуется.

Мы изучили систематически корреляции между образца морфологии и углеводов чувствительность в MALDI MS в последних доклада13. Результаты, полученные с помощью нескольких важных углеводов и матрицы показывают, что лучший повышение сигнала осуществляется recrystallizing сушеные MALDI образцы. Морфология образцов, подготовлен с использованием метода обычных сушеные капли (DD) реформировать путем быстрого перекристаллизации с метанолом (метанола). Здесь демонстрируются протоколы подготовки подробного образца. Протокол состоит из трех основных этапов, включая образца пластины литраж, образец осаждения и перекристаллизации и масс-спектрометрии анализа. Использовать углеводы включают sialyl Льюис (СКВA) и maltoheptaose (MH). DHB используется в качестве модели матрицы. Результаты показывают, что интенсивность сигнала углеводов и пространственного распределения заметно улучшилось после перекристаллизации. Такой метод может применяться для образцов с другими популярными матриц, включая 2,4,6-trihydroxyacetophenone (ТАП) и α- циано-4-Гидроксикоричная кислота. Этот метод служит общий подход, который может быть легко интегрирован в обычной лаборатории для анализа углеводов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. образец пластины Литраж

  1. Очистка образца пластины
    1. Носите перчатки нитриловые, чтобы избежать загрязнения образца пластины во время очистки.
    2. Ручная автомойка образца пластины с 100,0 мл стирального раствора (1,0 мг/мл).
    3. Ручная автомойка образца пластины с дистиллированной деионизированной водой (DDW).
    4. Промойте поверхность пластины образца с 30.0 мл метанола.
    5. Положите пластину образца в 600 мл стакан и залейте DDW до тех пор, пока пластины образца полностью погружен в воду.
    6. Поставьте стакан в ультразвуковой ванны (см. таблицу материалы) и sonicate пластину образец 15 мин (200 Вт, 40 кГц).
    7. Взять образец стекла и удар от капель воды, используя под давлением азота.
    8. Депозит 0.2 мкл метанола на табличке образца, чтобы проверить ли метанола распространяется в другие места.
      Примечание: Если метанола сливается с других точек, повторите шаги 1.1.3-1.1.5; Если нет, переходите к следующему шагу.
  2. Регулирование температуры камеры сушки
    1. Используйте сушильную камеру устойчивый условиях сухой капли, как описано ранее,11,12,13. В частности используйте подробную процедуру, описанную в шагах 2.1-2.5 Ou, ю.-М. и др. 201612. Кратко:
      1. Очистить сушильную камеру, комнатной температуре азота при постоянной скорости потока для поддержания низкой относительной влажности окружающей среды.
      2. Держите пластины образца температуры константа в регулярные - (25 ° C) или условий Быстросохнущий (50 ° C), регулируется температуры Медная шашка в сушильную камеру.
  3. Подготовка матрицы и исследуемое вещество решений
    1. Подготовка матрицы решений
      1. Распустить DHB в ацетонитриле (ACN) 50%: 50% DDW приготовить раствор 0,1 М.
    2. Подготовка углеводов аналитов
      1. Растворите SLeA в DDW подготовить 10 раствора М-4 .
      2. Растворите MH в DDW приготовить раствор М 10-4 .

2. образец осаждения и рекристаллизация

Примечание: Оптимизированные процедуры для анализа малых и регулярные количество образцов описаны здесь. Убедитесь, что температура образца пластины стабилизируется на желаемую температуру до сдачи на хранение решения. Если образец распространяется на большой площади для покрытия других точек выборки в ходе перекристаллизации, подготовка нового образца или повторите шаг 1.1.

  1. Для анализа небольшого количества образца (0.1 мкл)
    Примечание:     следующие шаги были разработаны для минимизации времени и образец потребления. Это подходит для количественного анализа реальных образцов с ограниченный объем или быстрый IMS для количественной оценки анализа.
    1. Премикс 0,25 мкл раствора DHB и 0,25 мкл SLeA или MH раствора в пробки microcentrifuge.
    2. Вихревой смешанного решения с помощью вихревой смеситель для 3 s.
    3. Спин вниз смешанного решения в мини-центрифуга для 2 s (2000 x g).
    4. Использование пипетки вытянуть 0.1 мкл готовые решения и немедленно сдать его на плите образца.
      Примечание: При сдаче небольшое количество образца, Не держать готовые решения в наконечник пипетки для более чем 10 s.
    5. Ждать для образца высохнуть. Типичное время сушки, перечислены в таблице 1.
    6. Использование пипетки депозита 0.2 мкл метанола прямо на месте сушеные образца. Образец будет получить мокрой и сухой немедленно.
      Примечание: Убедитесь, что осаждения процедура закончена в 3 s, чтобы избежать потери значительного испарения метанола.
    7. Рассмотрим пример с помощью микроскопа. Если кристалл морфологии не как ожидается (см. Рисунок 1 например, желаемых результатов), повторите шаги 2.1.1-2.1.6 для подготовки нового образца.
    8. Надевайте перчатки из нитрила и осторожно вынуть пластину образца из сушильной камеры.
  2. Для анализа регулярных количество образцов (в 1 мкл)
    Примечание: Для максимального повышения однородности углеводов образцов объемом выборки обычно используемых MALDI разрабатываются следующие шаги. Этот процесс подходит для рутинных и количественного анализа. Рекристаллизация процесс перераспределяет образцов и матриц равномерно для больших площадей.
    1. Премикс 2,5 мкл раствора DHB и 2,5 мкл SLeA или MH раствора в пробки microcentrifuge.
    2. Вихревой готовые решения с вихревой смеситель для 5 s.
    3. Спин вниз смешанного решения в мини-центрифуга для 2 s (2000 x g).
    4. Использование пипетки вытянуть 1.0 мкл готовые решения и немедленно сдать его на плите образца.
      Примечание: не использовать оставшиеся готовые решения снова после депонирования образцов.
    5. Ждать для образца высохнуть. Типичное время сушки, перечислены в таблице 1.
    6. Использование пипетки депозита 1.5 мкл метанола прямо на месте высушенные образцы. Образец будет получить мокрой и сухой немедленно.
      Примечание: В случаях с Температура плиты высокой пробы (50 ° C), перекристаллизации шаг должно быть сделано в течение 5 s к минимуму испарение метанола в наконечник пипетки.
    7. Рассмотрим пример с помощью микроскопа. Если кристалл морфологии не как ожидается (см. Рисунок 1 например, желаемых результатов), повторите шаги 2.2.1-2.2.6 для подготовки нового образца.
    8. Надевайте перчатки из нитрила и осторожно вынуть пластину образца из сушильной камеры.

3. Массовое спектрометрирование данных сбора и анализа данных

Примечание: Анализ выполняется с использованием коммерческих время полета масс-спектрометр (Таблица материалов) оснащены источник ионов MALDI. Инструмент находится в ведении конкретного контроля программного обеспечения (Таблица материалов) с предварительно оптимизированные извлечения задержки и лазерной энергии. Спектры записываются в линейном режиме с массовых спектр m/z = 0 – 1500. Пластину образца потенциал является ±25 кэВ и каждый спектра в среднем 10 лазерных выстрелов. Пользователи должны проводить инструмент оптимизации и анализа проб с помощью совместимого программного обеспечения и следовать инструкциям завода-изготовителя прибора.

  1. Открыть инструмент контроля программного обеспечения (см. Таблицу материалы).
  2. Вставьте пластину образца в масс-спектрометр.
  3. Выберите метод приобретения предварительно оптимизированные данных в программном обеспечении.
  4. Зарегистрировать весь образец региона для IMS с использованием изображений программного обеспечения (см. Таблицу материалы).
    Примечание: Пропустите этот шаг, если не делать IMS.
  5. Начало сбора данных в пакетном режиме управления программного обеспечения.
  6. Участок Ион изображения с помощью изображений программного обеспечения после завершения сбора данных.
  7. Анализировать массового спектры с использованием программного обеспечения для анализа (см. Таблицу материалы) Если данные записываются без изображение Иона.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Представитель SEM изображения SLeA смешивается с DHB подготовлен с использованием DD и рекристаллизация методы показаны на рисунке 1. Типичный DHB морфологии, подготовленный метод DD является большой игольчатые кристаллы на обод и тонкой кристаллических структур в центре образца пятна. Типичная длина таких игольчатые кристаллы являются ~ 100 мкм. После перекристаллизации, метанола образец имеет большую поверхность равномерно покрыты тонкой древесно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Неоднородность образца является одной из серьезнейших проблем в DD MALDI-г-жа наиболее часто используемый метод подготовки образца, но результирующая кристаллы являются весьма разнородными. Такие примеры показывают воспроизводимость плохой выстрел до снимка и образец для сигнала. Таким образом Поиск «лакомые» в образце районах во время сбора данных является процедурой в MALDI экспериментов. Такие разнородные образцы являются неподходящими для количественная оценка в рутинных анализов.

В текуще...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы имеют без подтверждений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Реагент
Моющий порошокAlconox242985
метанолMerck106009
ацетонитрил Merck100003
2,5-дигидроксибензойная кислота (DHB)Alfa Aesar A11459
сиалил-льюис А (SLeA)Sigma-AldrichS1782
MaltoheptaoseSigma-AldrichM7753
Наконечники для пипетокMettler Toledo17005091
Микроцентрифужная трубкаAxygenMCT-150-C
Equipment
Milli-Q система очистки водыMilliporeZMQS6VFT1
Неопудренные нитриловые перчаткиMicroflexSU-690
600 мл стаканDuran2110648
Ультразвуковой очистительDeltaDC300H
ГигрометрWisewind5330
Расходомер газообразного азотаDwyerRMA-6-SSV
K-типа термопарыDigitron311-1670
Вихревой смесительScientific Industries  SI-0236
Мини-центрифугаSelect BioProductsForce Mini 
ПипеткаRaininpipet-lite XLS
СтереомикроскопOlympusSZX16
Терморегулируемая сушильная камераЭта лаборатория
Масс-спектрометр Ultraflex II TOF/TOFBruker Daltonics
MTP 384 целевая пластина полированная сталь BCBruker Daltonics8280781
Flexcontrol Версия 3.4Программное обеспечение для управленияBruker Daltonics
Fleximaging Версия 2.1Программное обеспечение для визуализацииBruker Daltonics
Flexanalysis Версия 3.4Программное обеспечение для анализаBruker Daltonics

Ссылки

  1. Holme, D. J., Peck, H. Analytical Biochemistry. , 3rd edn, Addison Wesley Longman Limited. (1998).
  2. Costello, C. E. Time, life ... and mass spectrometry - New techniques to address biological questions. Biophysical Chemistry. 68 (1-3), 173-188 (1997).
  3. Caroff, M., Karibian, D. Structure of bacterial lipopolysaccharides. Carbohydrate Research. 338 (23), 2431-2447 (2003).
  4. Marvin, L. F., Roberts, M. A., Fay, L. B. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry in clinical chemistry. Clinica Chimica Acta. 337 (1), 11-21 (2003).
  5. Harvey, D. J. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of carbohydrates. Mass Spectrometry Reviews. 18 (6), 349-450 (1999).
  6. Ciucanu, I., Kerek, F. A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates. Carbohydrate Research. 131 (2), 209-217 (1984).
  7. Lamari, F. N., Kuhn, R., Karamanos, N. K. Derivatization of carbohydrates for chromatographic, electrophoretic and mass spectrometric structure analysis. Journal of Chromatography B. 793 (1), 15-36 (2003).
  8. Nishikaze, T., Amano, J. Reverse thin layer method for enhanced ion yield of oligosaccharides in matrix-assisted laser desorption/ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 23 (23), 3787-3794 (2009).
  9. Williams, T. I., Saggese, D. A., Wilcox, R. J., Martin, J. D., Muddiman, D. C. Effect of matrix crystal structure on ion abundance of carbohydrates by matrix-assisted laser desorption/ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21 (5), 807-811 (2007).
  10. Nicola, A. J., Gusev, A. I., Proctor, A., Jackson, E. K., Hercules, D. M. Application of the fast-evaporation sample preparation method for improving quantification of angiotensin II by matrix-assisted laser desorption/ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 9 (12), 1164-1171 (1995).
  11. Lai, Y. H., et al. Reducing Spatial Heterogeneity of MALDI Samples with Marangoni Flows During Sample Preparation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (8), 1314-1321 (2016).
  12. Ou, Y. -M., et al. Preparation of Homogeneous MALDI Samples for Quantitative Applications. Journal of Visualized Experiments. (116), e54409(2016).
  13. Lee, H., et al. Enhancing carbohydrate ion yield by controlling crystalline structures in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. , 49-55 (2017).
  14. Allwood, D. A., Perera, I. K., Perkins, J., Dyer, P. E., Oldershaw, G. A. Preparation of 'near' homogeneous samples for the analysis of matrix-assisted laser desorption/ionisation processes. Applied Surface Science. 103 (3), 231-244 (1996).
  15. Sadeghi, M., Vertes, A. Crystallite size dependence of volatilization in matrix-assisted laser desorption ionization. Applied Surface Science. 127 (Supplement C), 226-234 (1998).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

MALDI

Похожие статьи