В этом исследовании мы демонстрируем метода метку бесплатно нейтрофилов разделения от клинических дыхательных путей выделениями, используя замкнутого цикла эксплуатации спираль инерционного микрофлюидика. Предложенный метод расширит клинических в vitro анализов для различных респираторных заболеваний.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Этикетка бесплатно нейтрофилов обогащения от секрецию дыхательные пути пациента, полученных с помощью замкнутых инерционного микрофлюидика
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Дыхательных путей выделениями содержат большое количество связанных с иммунной клетки, например, нейтрофилы, макрофаги и лимфоциты, которые могут быть использованы в качестве основных ресурсов для оценки различных легочных заболеваний, как для научных исследований и клинических целей. Однако из-за разнородных и вязких характер пациента слизи, в настоящее время нет надежных диссоциации метод, который не повредить принимающей иммунные клетки в дыхательные пути пациента секрецию. В этом исследовании мы представляем пример подготовка метод, который использует инерционного микрофлюидика иммунной оценки пациента. Независимо от свойства гетерогенных аэрогидродинамических клинических образцов, предложенный метод восстанавливает более чем 95% нейтрофилов из дыхательных путей секрецию образцы, которые разбавляют Гарибова миллилитрами чистой соленой. По рециркуляции концентрированной выходной поток для первоначальной выборки водохранилище, предоставляются высокой концентрации, восстановления и чистоту иммунных клеток; рециркуляция считается компромисс для работы на основе шприц сингл запуск инерционного микрофлюидика. Замкнутого цикла эксплуатации спираль микрофлюидика обеспечивает лейкоциты без физического или химического вмешательства, как продемонстрировано phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA)-индуцированной эластазы релиз отсортированных нейтрофилов.
Введение
Поскольку клетки инкапсулированы в большое количество слизи в дыхательных путей выделениями, функциональной оценки лейкоцитов в assay в vitro был затруднен. Дитиотреитол (DTT) является наиболее распространенным буфера lysis отмежеваться и гомогенизации мокроты для цитологического анализа и выявления посредников обеспечивая допустимых жизнеспособность изолированных клеток в1,2. Однако DTT может помешать с привязкой к поверхности антигены сократимость нейтрофилов, что приводит к нарушению нейтрофилов функции такие как эластазы и миелопероксидаза (МПО) релиз2,3. Таким образом было проведено несколько исследований человеческого сократимость нейтрофилов функции с нейтрофилов периферической крови, которые могут не выявить физиологические характеристики легочной4. Тем временем инерционного микрофлюидика добилась успехов в изоляции клетки от различных пациентов biomatrices5,6. Равновесие между инерционного подъем сил и перетащите Дин выравнивает частиц/ячейку согласно их размер, который позволяет лейбл свободной частицы разделения7. Наша группа ранее представил метод подготовки образца для распространения опухоли клетки8,9, патогенов в крови8, клетки от подвеска культуры10,11, 12и полиморфноядерных лейкоцитов (ПНЛ) от крови13,14.
Здесь мы представляем протокол подготовить иммунные клетки от пациента выделениями дыхательных путей с помощью замкнутых инерционного микрофлюидика для вниз по течению в vitro assay, таких как assay нейтрофилов эластазы (NE). Этот метод обеспечивает высокую концентрацию и восстановления, особенно когда есть значительное перекрытие в боковой направлении клеток/частиц из которого клеток/частиц из интерес является быть удалены, который обычно наблюдается в клинических пробах. По рециркуляции Внутренняя стена (IW)-сосредоточены крупные частицы или ячейки ввода образца трубки, частицы или ячейки интерес концентратов в оригинальной водохранилище, в то время как фон жидкости с небольшой муцина агрегаты проходят через отходов водохранилище. Несмотря на свойства гетерогенных аэрогидродинамических клинических образцов, предложенный метод восстанавливает последовательно выше 95% нейтрофилов из дыхательных путей секрецию образцы, которые разбавляют Гарибова с чистой физиологическим раствором (~ 1 мл). Напротив метод лизис представляет широкий ассортимент ПНЛ ставок возмещения в зависимости от состояния образца. Предлагаемый протокол захватывает лейкоциты образом ярлык бесплатно без физического или химического перерывов, который обеспечивает возможность собрать тонкие клетки от клинически сложных Биометрия с минимально инвазивных процедур.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Пример коллекции была утверждена университета Питтсбурга институциональных Наблюдательный Совет (IRB # PRO16060443, PRO10110387). Все эксперименты по биобезопасности, кабинет с надлежащего личного защитного оборудования.
1. устройство изготовление и мягкие литография
Примечание: Стандартные мягкие литографии методы,1516 были использованы для создания микроканальные полидиметилсилоксан (PDMS).
- Смешайте PDMS прекурсоров в соотношении 10:1 базовый и полимеризации агента.
- Залить 30 g PDMS прекурсоров смеси на микро обработанные алюминиевых плесень (см. Рисунок 1 для измерений) и 20 г смеси PDMS прекурсоров на 100 мм Петри.
Примечание: Петри используется чтобы толстая пленка PDMS (~ 3 мм) для поддержки слоя. Несущий слой PDMS обеспечивает равномерное физических свойств поверхности всей микрофлюидика. В качестве альтернативы может использоваться PDMS тонкопленочных на стеклянное скольжение. Мастер формы с измерения конкретных каналов был разработан и сфабрикованы микро фрезерование на алюминиевый лист. Спиральный канал, используемый в данном исследовании было 8-Петля-Спираль микроканальные с один вход и два выхода, с увеличением от 8 мм до 24 мм для эффективного разделения на основе размера радиуса. - Место плесень и Петри в вакуумного эксикатора Дега до тех пор, пока не видны на поверхности, обычно 5-10 минут использования дом вакуум в эксикаторе.
- Отпустите вакуума и место плесень и Петри в 90 ° C духовку на 1 час.
Примечание: Плитой или другие инструменты Отопление может использоваться вместо духовки. - Удалить плесень и Петри блюдо из духовки и дайте ему остыть при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Тщательно вырезать контур и удар жидкости доступа отверстия на устройстве с помощью Дырокол 2 мм.
Примечание: Размер удар может варьироваться в зависимости от размера трубки или жидкости руководства. - Придерживаться ленты в сторону канала устройства и толстая пленка PDMS и тщательно чистить с щипцами для удаления пыли.
- Относитесь к стороне канала устройства и простой PDMS с воздуха плазмы и облигаций с подготовленной несущий слой из простой PDMS (рис. 1A).
- Установите фишку на слайде стекла 50 x 70 мм и поместите его в 70 ° C духовке в течение по крайней мере 30 минут, чтобы повысить прочность сцепления.
2. трахеи секрецию коллекции от механически вентилируемых пациентов
Примечание: Трахеи секреции можно получить от механически вентилируемых пациентов во время обычной рутинной сократимость уход с использованием протокола от обычных методов для размещения стандартных, взрослых вентилируемые пациента. Образцы были определены исключения и немедленно отправлен для обработки.
- Если указано аспирации трахеи, используйте катетер для извлечения выделениями дыхательных путей.
- Продвигать катетер тщательно полпути в эндотрахеальную трубку и привить 5 мл 0,9% стерильный физиологический из предварительно заполненные 10 мл шприца.
- Когда катетер продвигается полностью, или сопротивление, аспирационная выделениями и собирать в контейнер коллекции стерильных мокроты.
- Собирать 10 мл трахеи выделениями в контейнере стерильных мокроты и поместите его на льду. Отправьте образцы сразу для обработки.
3. трахеи секрецию пробоподготовки
Примечание: Все эксперименты должны выполняться по биобезопасности, кабинет с надлежащего личного защитного оборудования.
- Разогнать 1 мл сократимость секрецию образцов в 9 мл фосфат амортизированное saline (PBS), с помощью пластиковых 10 мл шприца (для разбавления 10 x). Используйте тупой пипетки для гомогенизации слизь образца.
- Штамм разбавителя с 40 мкм нейлон клеток сито, чтобы удалить большие куски или сгустки крови, которые могут блокировать микрофлюидика отверстие или канал. Поместите образец на льду после обработки.
- Разогнать разбавителя каждого образца с помощью объемом 100 x PBS буфера, что приводит к 1000 x разреженных подвеска. Поместите образец на льду во время операции всего диссоциации.
4. Экспериментальная установка
Примечание: Все эксперименты должны выполняться по биобезопасности, кабинет с надлежащего личного защитного оборудования.
- Соберите PDMS чип с руководством жидкости применить однородность потока для каждого из четырех спираль микроканалов (рис. 1B).
Примечание: Четыре каналы были использованы для увеличения пропускной способности параллелизации, а также оптимизации плотности тома и клеток результате подвески. Жидкости руководство разработана и изготовлена с стереолитографии типа 3D-принтер с ясный смолы. Входе и выходе порт жидкости руководства использовать женский Luer разъемы для облегчения связи и стабильного уплотнения во время операции. - Подключите 1/16-дюймовый разъем Luer входе, внутренней розетки (IW) и напорный канал наружной стены (OW) жидкости руководства а Силиконовая трубка для образца подвески.
- Вставьте тупые советы к каждому концу вход и выходы, чтобы добраться до нижней части образца водохранилища.
- Подключите Перистальтический насос с впускной трубы.
- Поместите конец впускной трубы и трубы выход IW в образце водохранилище и поместите конец трубки розетки OW отходов водохранилище (рис. 1 c, D).
- Место 50 мл трубки отфильтрованных PBS без кальция и магния на водохранилище образца.
- Начните, насосных на низкий расход потока (~ 1 мл/мин) для премьер устройство.
Примечание: Когда пузыри захватываются в канал, нажмите в верхней части канала с пинцет дестабилизировать и устранения воздушных пузырьков. Когда устройство полностью наполненный буферным раствором, измените PBS трубки подготовить образец трубки сократимость секрецию. - Когда образец помещается в образце водохранилище, включите Перистальтический насос и установите скорость потока в 4 мл/мин (рис. 1 c, D).
- Когда объем образца достигает указанного тома (~ 1 мл), остановить операцию и отсоедините Силиконовая трубка.
Примечание: Предложенный метод является более эффективным в сокращении большой объем разбавителя (> 50 мл) в микро пластиковых пробирок тома (~ 1 мл) (Рисунок 2).
5. поток Cytometry анализ
Примечание: Для сравнения методов диссоциации (микрофлюидика и lysis), был использован проточной цитометрии с иммунофлюоресценции.
- Добавить что флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC) - конъюгированных мыши антинародным CD66b моноклональные антитела и аллофикоцианин (APC) - конъюгированных мыши античеловеческие CD45 моноклональных антител к первоначальной суспензий (шаг 3.3) и результирующая суспензий (шаг 4.9) (200 мкл из каждого антитела) в соотношении 1:25 v/v.
- Проинкубируйте образцы на 4 ° C в темноте за 30 мин.
- Анализ обоих образцов на проточный цитометр для количественного определения ПНЛ.
Примечание: Населения, FITC-APC двойной положительный, CD66b положительные и CD45 положительным считается нейтрофилов. Восстановления была рассчитана по соотношению числа общей ячейки ввода и результате подвеска.
6. NE релиз анализ
Примечание: Для сравнения функциональных возможностей изолированных нейтрофилов методом микрофлюидика и lysis, СВ пробирного комплект был использован.
- Добавить PMA (предоставляется в комплекте пробирного) каждый полученный подвеска (полученное на шаге 4.9) до конечной концентрации 50 Нм.
- Проинкубируйте образцы при 37 ° C на 2 ч.
- Центрифуга для подвески на 300 g x 10 мин.
- Передача 10 мкл каждого супернатант 96-луночных пластины (поставляется в комплекте пробирного в).
Примечание: 96-луночных микропланшетов с плоским дном и черный полистирола могут использоваться также. - Добавьте 90 мкл разбавленного аналитического буфера (предоставляется в комплекте пробирного) в каждой скважине.
- 10 мкл эластазы субстрата (Z-Ala-Ala-Ala-Ala-2Rh110, пробирного комплекта).
- Инкубируйте 1,5 ч при 37 ° C.
- Прочитано 96-луночных пластину, используя флуориметр на длине волны возбуждения 485 Нм и длина волны излучения 525 Нм.
Примечание: Уровень NE была разделена ПМН счетчик от cytometry анализ потока.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мы достигли прозрачный иммунной клеточных суспензий с обеих DTT mucolysis и микрофлюидика диссоциации (рис. 3A). Микрофлюидика диссоциации собранные 4,40 x 105 ПНЛ в среднем (2,1 x 104 5,60 x 105 ПНЛ, n = 6) от сократимость секрецию образцов разбавленный Гарибова (общий объем 50 мл) в 1 мл чистого подвески. По сравнению с первоначальной разбавителя, ПНЛ 94,0% (CD66b+/CD45+) были обнаружены в небольшом объ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В инерциальной микрофлюидика частиц и клетки локализовать в определённой боковой позиции в микро канал, основанный на их размер5,18,19,20. Из-за совокупный эффект декан перетащите силы и инерционных подъемная сила в изогнутые microchannel, крупные частицы или нейтрофилов (> 10 мкм) расположены внутри канала и мелких частиц, слизь агрегатов и мусора, меньше, чем 6 мкм расположены за пределами ка...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы подали заявку на патент на технологию, описанных здесь.
Благодарности
Эта работа была поддержана NIH/NIAID (R21AI119042) а также NIH U24 образца щадящие пробирного программы (U24-AI118656).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Прекурсор PDMS | Dow corning | 184 SIL ELAST KIT 3,9 КГ | соотношение основания и отвердителя 10:1 |
| Гравитационная конвекционная печь VWR | 414005-128 | Прекурсор PDMS для отверждения при температуре 90 градусов. | |
| 100 мм чашка Петри | VWR | 89000-324 | Изготовление PDMS Несущий слой |
| Harris Uni-Core Puncher | Sigma-aldrich | WHAWB100076 | диаметром 2 мм или другой в зависимости от размера трубки |
| Воздушная плазменная машина | Femto Science | Cute | Поверхность плазменной обработки для PDMS устройства до нижнего основания. |
| Стеклянная горка 2 x 3 дюйма | TED PELLA, INC. | 2195 | Для поддержки устройства PDMS |
| Masterflex катушка с платиновым отверждением силиконовой трубки, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | Трубка для микрофлюидики и перистального насоса |
| 1/16 дюймовый разъем Люэра, мужской | аппарат Harvard аппарат | PC2 72-1443 | Соединитель для проводника жидкости |
| 50 мл Трубка Falcon Corning | 21008-940 | сбор и подготовка образцов | |
| Фосфатно-солевой буфер, 1X без кальция и магния | Corning | 45000-446 | Буферный раствор для разбавления образца |
| Halyard Катетер закрытой аспирации, локоть, 14F / канал 4,67 мм | HALYARD HEALTH | 22113 | Катетер для секции трахеи |
| 0,9% Стерильный Нормальный физиологический раствор, 10 мл предварительно заполненный шприц | BD PosiFlush | NHRIC: 8290-306547 | Для сбора трахеи у пациентов |
| SecurTainer™ III Контейнеры для образцов, 20 мл | Simport | 1176R36 | Контейнер для сбора стерильной мокроты (секрета дыхательных путей) |
| Шприц с наконечником Luer-Lok, 10 мл | BD | BD309604 | Для пипетки гомогенизации образца слизи и достижения дна пробирки |
| для образца BD Игла для тупого заполнения, с BD Luer-Lok Наконечник | BD | Для пипетки гомогенизируйте образец слизи и дойдите до дна пробирки для образца | |
| 40&микро; M Нейлоновое сетчатое фильтр | Falcon | 21008-949 | Для удаления больших кусков или тромбов, которые могут блокировать отверстие для доступа микрофлюидики или канал. |
| Перистальтический насос (Masterflex L/S Digital Drive) | Коул-Пармер | HV-07522-30 | Работа микрофлюидики |
| BD LSR II Проточный цитометр | BD Bioscience | LSR II | Количественная оценка коэффициента восстановления клеток |
| Флуоресцеин изотиоцианат (FITC)-конъюгированный мышиный античеловеческий CD66b моноклональное антитело | BD Bioscience | 561927 | Иммуноокрашивание нейтрофилов для анализа проточного цитометра |
| Аллофикоцианин (APC)-конъюгированный мышиный античеловеческий CD45 моноклональное антитело | BD Bioscience | 561864 | Иммуноокрашивание нейтрофилов для анализа проточного цитометра |
| Планшетный ридер | Thermo Fisher scientific | Varioskan | Планшетный ридер для анализа нейтрофильной эластазы, ex485/em525 |
| Набор для анализа нейтрофильной эластазы | Cayman Chemical | 600610 | Оценка функциональности нейтрофилов |
| Флуоресбрит YG Микросферы 10.0&микро; m | PolyScience, Inc. | 18140-2 | Флуоресцентные частицы для экспрессии траектории лейкоцитов в микрофлюидике |
Ссылки
- Hamid, Q., et al. Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation. European Respiratory Journal. 20 (Supplement 37), 19S-23S (2002).
- van Overveld, F. J., et al. Effects of homogenization of induced sputum by dithiothreitol on polymorphonuclear cells. J Physiol Pharmacol. 56, Suppl 4. 143-154 (2005).
- Qiu, D., Tan, W. C. Dithiothreitol has a dose-response effect on cell surface antigen expression. J Allergy Clin Immunol. 103 (5 Pt 1), 873-876 (1999).
- Usher, L. R., et al. Induction of Neutrophil Apoptosis by the Pseudomonas aeruginosa Exotoxin Pyocyanin: A Potential Mechanism of Persistent Infection. The Journal of Immunology. 168 (4), 1861-1868 (2002).
- Di Carlo, D. Inertial microfluidics. Lab Chip. 9 (21), 3038-3046 (2009).
- Martel, J. M., Toner, M. Inertial focusing dynamics in spiral microchannels. Phys Fluids. 24 (3), 32001(2012).
- Zhang, J., et al. Fundamentals and applications of inertial microfluidics: a review. Lab Chip. 16 (1), 10-34 (2016).
- Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15 (10), 2297-2307 (2015).
- Warkiani, M. E., et al. Ultra-fast, label-free isolation of circulating tumor cells from blood using spiral microfluidics. Nat Protoc. 11 (1), 134-148 (2016).
- Warkiani, M. E., Tay, A. K., Guan, G., Han, J. Membrane-less microfiltration using inertial microfluidics. Sci Rep. 5, 11018(2015).
- Warkiani, M. E., Wu, L., Tay, A. K., Han, J. Large-Volume Microfluidic Cell Sorting for Biomedical Applications. Annu Rev Biomed Eng. 17, 1-34 (2015).
- Kwon, T., et al. Microfluidic Cell Retention Device for Perfusion of Mammalian Suspension Culture. Sci Rep. 7 (1), 6703(2017).
- Wu, L., Guan, G., Hou, H. W., Bhagat, A. A., Han, J. Separation of leukocytes from blood using spiral channel with trapezoid cross-section. Anal Chem. 84 (21), 9324-9331 (2012).
- Guan, G., et al. Spiral microchannel with rectangular and trapezoidal cross-sections for size based particle separation. Sci Rep. 3, 1475(2013).
- Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J Vis Exp. (8), e319(2007).
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane). Analytical Chemistry. 70 (23), 4974-4984 (1998).
- Ryu, H., et al. Patient-Derived Airway Secretion Dissociation Technique To Isolate and Concentrate Immune Cells Using Closed-Loop Inertial Microfluidics. Anal Chem. 89 (10), 5549-5556 (2017).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol Bioeng. 107 (2), 302-311 (2010).
- Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (48), 18892-18897 (2007).
- Xiang, N., et al. Fundamentals of elasto-inertial particle focusing in curved microfluidic channels. Lab Chip. 16 (14), 2626-2635 (2016).
- Lotvall, J., et al. Asthma endotypes: a new approach to classification of disease entities within the asthma syndrome. J Allergy Clin Immunol. 127 (2), 355-360 (2011).
- Houston, N., et al. Sputum neutrophils in cystic fibrosis patients display a reduced respiratory burst. J Cyst Fibros. 12 (4), 352-362 (2013).
- Janoff, A., Scherer, J. Mediators of inflammation in leukocyte lysosomes. IX. Elastinolytic activity in granules of human polymorphonuclear leukocytes. J Exp Med. 128 (5), 1137-1155 (1968).
- Kawabata, K., Hagio, T., Matsuoka, S. The role of neutrophil elastase in acute lung injury. Eur J Pharmacol. 451 (1), 1-10 (2002).
- Rubin, B. K. Plastic Bronchitis. Clin Chest Med. 37 (3), 405-408 (2016).
- Kokot, K., Teschner, M., Schaefer, R. M., Heidland, A. Stimulation and inhibition of elastase release from human neutrophils dependent on the calcium messenger system. Miner Electrolyte Metab. 13 (2), 133-140 (1987).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
