Завод инфекции тест: Спрей и Рана опосредованной прививка с завода возбудителя Magnaporthe мурены

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол для проверки вирулентности завод с завода возбудитель Magnaporthe мурены. Этот доклад будет способствовать крупномасштабные скрининга pathotypes грибов изолятов и служат отличной отправной точкой для понимания устойчивых механизмов растений во время молекулярной разведения.

Аннотация

Растения обладают мощной системы, чтобы защитить себя от потенциальных угроз, патогенных грибов. Для аграрно важных растений однако, текущие меры по борьбе с такой патогенов оказались слишком консервативна и, таким образом, недостаточно эффективными и они могут создавать потенциально экологические риски. Таким образом это крайне необходимо для выявления факторов хост сопротивления для оказания помощи в контроля заболеваний растений естественно через выявление устойчивых зародышевой плазмы, изоляции и характеристика генов сопротивления и молекулярных разведения устойчивых сортов. В этой связи существует необходимость установить метод точного, быстрого и крупномасштабных прививка размножаться и развиваться завод гены сопротивления. Рис взрыв грибкового патогена Magnaporthe мурены причины тяжелой болезни симптомы и принести убытки. Недавно м. мурены стала модель организма для изучения механизмов взаимодействия растений грибкового патогена. Следовательно мы сообщают о разработке метода испытания вирулентности завод, который является специфичным для м. мурены. Этот метод обеспечивает для прививки спрей с конидиальная подвеска и ранив прививка с мицелием кубов или капельки конидиальная подвески. Ключевым шагом ранив метод прививки для отсоединенной рис листья, чтобы раны на листьях растений, который предотвращает любые помехи, вызванные сопротивление пенетрации хост. Этот спрей/ранив протокол способствует быстрой, точной и крупномасштабных скрининга pathotypes м. мурены изолятов. Это комплексное и систематические завод инфекции метод послужит отличной отправной точкой для получения широкой перспективы вопросов в фитопатологии.

Введение

Райс Доменная, вызванные м. мурены, является одним из самых серьезных заболеваний для риса сорта во всем мире^1,2. Этот процесс, по которому м. мурены заражает растений-хозяев включает в себя производство конидий и поверхности крепления, прорастание конидий и Аппрессории образование, формирование проникновения колышек и инфекционных ГИФА дифференциации, и распространением болезни ³. все эти этапы являются общими в многих других растений патогенных грибов, и, действительно, блокаду любой одноступенчатые предотвращает инфекции растений-хозяев. Благодаря его экономическое значение и отслеживаемости генетических м. мурены стала модель организма для изучения механизмов взаимодействия растений грибкового патогена^1,4. Таким образом изучая молекулярные основы эти этапы развития в . м. мурены поможет прояснить молекулярных механизмов грибковых патогенности и идентификации генов-мишеней кандидата для проверки и проектирования Роман Фунгициды⁵.

Последние доклады, касающиеся м. мурены инфекции были сосредоточены на молекулярных механизмов до проникновения этапов, особенно conidiation, Аппрессории формирования, проникновения колышки и инфекционные роста^{3, 6}. Таким образом, очень важно разработать подробный протокол для тестирования м. мурены инфекции. Здесь мы представляем подробный метод для инфекции тест, который использует спрей опосредованной инфекции анализов с конидиальная подвеска и прививка РАН с мицелиальных вилки м. мурены. В настоящем докладе протокол посвящен культуре штаммов, подготовка conidiation решения для распыления и мицелиальных вилка опосредованной Прививка растений с . м. мурены. Эти шаги описаны подробно ниже, и схема показаны весь процесс метода и типичные поражения приведены на рисунках 1 и 2, соответственно.

Протокол

1. spray прививка с подвеской конидий мурены м.

1. Грибковые культуры для M.grisea
   1. Готовить овсянку томатный агар (OTA) питательной среды для штаммов микромицетов.
   2. Весят 30-50 г овсяных хлопьев, добавить в 800 мл дистиллированной деионизированной воды (ddH₂O) и кипятить смесь на 30 мин в электрической кастрюле.
   3. Фильтр отварной овсянки сок в стакан через кусок Марли.
   4. 150 мл томатного сока и 20 г агара в фильтрат в стакан и добавить ddH₂O до 1000 мл.
2. Подготовка экспериментальных материалов
   1. Замочите около 50 семена сорта риса (Oryza sativa) Lijiangxintuan-heigu (LTH) ddH₂O для 3 d или понежьтесь около 50 семян ячменя (Hordeum vulgare cv золотой обещание) ddH₂O для около 1 d.
   2. Оберните семена риса или ячменя в влажной марлей и прорастают их на влажные фильтровальную бумагу в около 30 чашек Петри с диаметром 10 см х 10 см на 28 ° C. Время прорастания семян риса-около 2-3 d, время прорастания семян ячменя около 2 d. Относительная влажность воздуха в теплицах составляет примерно 70%.
   3. Посадку саженцев риса или ячменя в горшках, используя газобетона заливки почвы и полив, а затем покрыть их с слой вермикулита.
   4. Поместите растения в подходящей Теплице или роста кабинета при 25 ° C около 1 ~ 2 недели.
   5. Вырезать 3 слоя фильтровальной бумаги в кругах с стерильные Ножницы хирургические (каждый круг должен иметь диаметр 8 см) и поместите их на 100 мм стерильных пластиковых пластин.
   6. Добавьте ddH₂O в каждое блюдо, чтобы впитать фильтровальной бумаги.
   7. Убедитесь, что фильтр бумага полностью мокрые, но добавить без дополнительных воды.
   8. Удалите излишки воды с вакуумным насосом.
   9. 2 место стерильным зубочистки в культуре блюдо для поддержки ячмень рис листья; пространство зубочистки ~ 2-3 см друг от друга.
   10. Собирают листья рис 2 недели после посева семян или взять в листьях ячменя 7 d после посева семян.
   11. С помощью 4 - 6 листьев саженцев риса/ячменя, отрезать нижнюю часть ствола на ~ 5 см от верхней и собирать листья.
3. Спрей прививка протокол
   1. Культура грибковых нагрузку на OTA пластины в термостатический инкубатора (25 ° C) для ~ 4 d.
   2. Добавьте ~ 2 мл ddH₂O, с помощью 0.5 - 5 мл пипетки на каждой пластине 4-дневного возраста.
   3. С прививкой петли скрип мицелия м. мурены одичал тип деформации и мутантный штамм в мицелия мусора.
   4. Сбор мусора мицелия и перевести его на новую пластину OTA. Возьмите мицелия мусора и сушить в чистой скамейке.
   5. Крышка с 3 слоями марля для обеспечения влажности, необходимых для роста конидий в Теплице при 25 ° C в течение дня (14 ч) и 23 ° C в ночь (10 h) за 24-48 ч.
   6. Добавить 2 мл ddH₂O к каждому блюду и скрести конидий осторожно стерильные ватные тампоны, следуют фильтрации через 2 слоя бумаги объектива. Будьте осторожны, чтобы не поцарапать поверхность питательной среды.
   7. Перенесите конидий подвеска в новый Тюбик 50 мл с пипеткой 100-1000 мкл.
   8. Центрифуги для 5 минут как минимум 5000 x g при 25 ° C.
   9. Удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле дать конидий⁴ 2 x 10 мл 0,025% (v/v) Tween-20 решения. Tween-20 решение обычно это около 10-20 мл.
   10. Налейте споро подвеска ручной опрыскиватель.
   11. Spay около 10 мл конидиальная подвески на рис листья 2-недели Старый рис саженцы или ячменя листьях проростков ячменя 7-дневных и инкубировать их в 25 ° C в темных, влажных камере для ~ 24 h. спрей управления растения с 0,025% (v/v) Tween-20 решения.
   12. Перенесите листья в другой влажной камере под флуоресцентный свет при 25 ° C для фотопериода 12 h.
   13. Запись симптомы болезни на 5 d после прививки. Изучите больной риса/ячмень лезвия ~ 6 см в длину. Стандарта оценки согласно системе скоринга взрыва сопротивления из Международный институт исследований риса (МНИИР). Сведения о системе скоринга взрыва сопротивления приведены в таблице 1.
   14. Фотография листья для оценки инфекции испытанных штаммов. Инфекция оценивали количество поражений за 3,6 см².

2. ранив прививка с мицелием кубов или капельки конидиальная подвеска мурены м.

1. С помощью анатомических иглы, скрести три 2-3 см длиной раны в основных вен отдельностоящий риса/ячмень листьев; Будьте осторожны, не проникает в листья.
2. Положите листья царапины на зубочистки и спрей 0,02% (v/v) Tween-20 решения на листья образуют слой капель.
3. Вырежьте 0,5 х 0,5 см мицелиальных плагин для каждого штамма м. мурены (штаммов одичал тип, мутант, дополнения, или другие штаммы тест) от пластины OTA.
4. Положите мицелиальных вилки или 25 мкл капельки конидиальная подвески на раненых листья и инкубации листья при 25 ° C в влажной камере для 3-8 d.
5. Изучите поражения на 5-7 d после прививки. Метод изучения такой же, как это было для метода прививка спрей (см. шаг 1.3.13).
6. Изучить больной риса/ячмень лезвия ~ 6 см в длину и сфотографировать их оценить инфекции испытанных штаммов. Инфекция оценивали количество поражений за 3,6 см².

Результаты

Весь рабочий процесс для техника показано на рисунке 1. Завод инфекции анализов проводились на 14-дневных восприимчивы риса саженцев (O. sativa cv CO-39) или листья восприимчивы 7-дневных ячменя (H. vulgare cv золотой обещание)^7,8,9. Для проверки инфекции на рис листья, были подготовлены и затем распыляется на лист влагалищ 14-дневных восприимчивы к...

Обсуждение

Гены сопротивления болезни растений играют важную роль в предотвращении инфекций патогенных микроорганизмов, в том числе грибковых патогенов^1,12. Райс Доменная использовалась как модель понять природу структур населения возбудителя и выявить гены сопротивления завод⁴. Таким образом это необходимо для изучения болезни сопротивления генотип и генотипов avirulence основных сортов сельскохозяйственных растений на больших масштабах для выявлени...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Фильтровальная бумага	марки GE Healthcare (Швеция)
Пробирка объемом 50 мл	CORNING(Америка)	430290
Центрифуга	Eppendorf(Америка)	5804R
Чашка для культуры	Thermofisher(Америка)	150326
пипетка 0,5-5 мл	Eppendorf
Пипетка 100-1000 мкл	Eppendorf	4920000083
Вакуумный насос	Leybold	D25B
Игла для рассечения	FST	26000-35
Инкубатор	MEMMERT	PYX313
Кольцо для инокуляции	Greiner Bio One	731175

103113874920000105